Electroporation av hindbrain å spore Aksonal Trajectories og Synaptic Targets i Chick Embryo

Summary

Hvordan nevrale nettverk er etablert i den embryonale hjernen er et grunnleggende spørsmål i utviklingspsykologi nevrobiologi. Her har vi kombinert en electroporation teknikken med romanen genetiske verktøy, for eksempel Cre / Lox-plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system i luftfarten hindbrain å merke rygg interneurons og spore sine aksonale anslag og synaptiske mål på ulike utviklingsstadier.

Abstract

Electroporation av chick embryonale nevralrøret har mange fordeler som å være rask og effektiv for uttrykket av fremmede gener inn i nerveceller. I dette manuskriptet gir vi en metode som demonstrerer unikt hvordan du electroporate DNA inn i aviær hindbrain på E2.75 for å spesifikt merke en undergruppe av nevrale stamceller, og hvordan å følge sine aksonale anslag og synaptiske mål på mye avanserte stadier av utvikling, opp til E14.5. Vi har utnyttet nye genetiske verktøy, inkludert spesifikke enhancer elementer, Cre / Lox - baserte plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system for å drive GFP uttrykk i en undertype av hindbrain celler (dorsal mest undergruppe av interneurons, da1). Aksonale baner og mål av da1 axoner følges ved tidlige og sene embryonale stadier på ulike hjernestammen regioner. Denne strategien bidrar avanserte teknikker for målretting celler av interesse i den embryonale hindbrain og for traprosjektfinansiering krets formasjon på flere stadier av utviklingen.

Introduction

Hindbrain representerer en viktig stafett hub av nervesystemet ved å kommunisere mellom de sentrale og perifere nervesystemet via stigende og synkende nevrale nettverk. Den regulerer grunnleggende funksjoner inkludert respirasjon, bevissthet, hørsel og motorisk koordinasjon ^1-3. Under tidlig embryonal utvikling, er virveldyr hindbrain forbigående delt langs anterior-posterior (AP)-aksen i repeterende rhombomeres, der forskjellige nevrale celletyper er dannet og generere flere hjernestammen atomkjerner sentre ^fire. Hindbrain er også delt langs dorsal-ventral (DV)-aksen i en basal og Alar plate, hvor diskrete nevrale stamceller blir spesifisert og differensiere i forskjellige DV steder ^3,5,6. Hvor tidlig AP og DV-spesifikke nevrale mønstre er styrende etablering av funksjonelle hjernestammen circuitries er i stor grad ukjent.

Å få kunnskap om dette grunnleggendespørsmål, er verktøy som kreves for å merke spesifikke undergrupper av nevroner i tidlig hindbrain og for å oppspore sine aksonale baner og tilkoblingsmuligheter på mer avanserte stadier. Vi har tidligere benyttet spesifikke enhancer elementer, og en Cre / LoxP-baserte betinget uttrykk system for sporing aksonal banen dorsal spinal interneurons tidlig chick embryo ^7-9. I dagens manuskriptet har vi målrettet hindbrain og oppgradert den eksperimentelle paradigmet for merking sene embryonale hindbrain interneurons, aksoner og deres synaptiske mål, ved hjelp av en modifisert electroporation strategi og PiggyBac - mediert DNA innarbeiding. Vår nye strategi tillater merking av forskjellige nevrale subtyper i den ene siden av hindbrain og sporing av sine aksonale anslag og synaptiske områder på ulike embryonale stadier, fra 2 opp til 12 dager etter electroporation. Basert på denne metoden, merket vi dorsal-mest undergruppe av hindbrain interneurons (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

Kombinasjonen av chick elektroporering, genetisk sporing av nevroner og analyse av projeksjon nettsteder på mye avanserte stadier av utvikling gir en unik plattform for å studere dannelsen av nevrale nettverk i hjernen og å belyse molekylære mekanismer som styrer kretsen formasjon.

Protocol

En. Hindbrain Electroporation

1.1 Egg håndtering

1. Ha eggene horisontalt i en fuktet inkubator (37 til 38,5 ° C). Embryoer electroporated etter 65-70 timer med inkubasjon, når de når 16-17 (HH) stadium (25-30 somites).
2. Ta eggene fra inkubatoren, de forblir i horisontal stilling.

1.2 Forberedelser

1. Trekk glass kapillærer (0,5 mm diameter).
2. Koble bøyde L-formede gull Genetrodes elektroder (3 mm diameter) med en adapter holderen til pulsgeneratoren. Electroporation parametrene inkluderer 25 volt, 5 puls tall, 45 ms puls lengde, 300 ms puls intervaller.
3. Forbered en munn pipette, 10 ml sprøyte nål, parafilm strimler, en myk børste, skarpe dissekere saks og 25 ml sterilt PBS løsning. Dette beløpet er vanligvis tilstrekkelig til å håndtere et egg skuff (18 egg).
4. Forbered en tilstrekkelig blanding av DNA-plasmider (5 mikrogram / mL hver) oglegge til ca 0.025% Fast grønt fargestoff for å visualisere DNA injeksjon. Vanligvis et volum på 4 pl er tilstrekkelig for injeksjon av et brett.

1.3 Windowing, Injection og Electroporation

1. Rengjør eggeskall med 70% etanol.
2. Håndtak ett egg om gangen for å minimalisere embryonale eksponeringstid for luft.
3. Lag et hull på egget polet med saks ender og fjerne 3-4 ml av albumin med sprøyten. Ikke ta ut en større mengde albumin som det reduserer levedyktighet.
4. Åpne en liten oval vindu (2,5 x 2 cm størrelse) på den øvre sentrum av eggeskallet ved hjelp av dissekere saks.
5. Dryppe noen dråper PBS på toppen av kimen for å forhindre tørrhet under hele prosessen.
6. Legge en mindre mengde av DNA-blandingen i glasskapillær ved hjelp av en munn pipette.
7. Plasser embryo med sin bakre enden mot deg. Ingen blekk injeksjon er nødvendig på dette stadiet som fosteret er godt synlig. Unngå blekk injeksjon økeroverlevelse av embryo. Trenge kaudal hindbrain ved å holde kapillær på ~ 45 °. Ikke fjern membranen fra hele embryo. Injisere DNA løsning forsiktig inn i hindbrain lumen og puster uten at det dannes luftbobler. DNA løsning sprer anteriorly.
8. Umiddelbart etter DNA injeksjon, plasserer de parallelle elektroder på presise AP og DV hindbrain stilling du tar sikte på å målrette. Skyv elektrodene litt ventrally uten å berøre hjertet, da det kan redusere levedyktighet. Puls electroporator. Elektrodene bør være dekket med bobler å indikere elektrisk ledningsevne (figur 1A).
9. Fjern forsiktig elektrodene og dryppe noen dråper av PBS for å kjøle ned og embryoet for å fjerne bobler. Tett egg åpning ordentlig med en parafilm stripen for å hindre uttørking under inkubasjon. Vask elektroder i PBS med myk børste.
10. Plasser egg i inkubator for ønsket tidsrom. Overlevelse av befruktede egg er ca 90% 2-3 dager etterelectroporation, reduserer og opp til 50% 12 dager etter electroporation.

2. Analyse av embryo

2.1 Flat-mount forberedelse og immunfluorescens

1. Flat-mount preparater av hindbrain kan utføres opptil E6.5 for enkelt å visualisere axoner under et mikroskop eller en stereo-mikroskop.
2. Dissekere embryo nøye ved å skille den fra omkringliggende membraner og blodkar. Plasser embryoet i en liten silikon - belagt petriskål inneholdende PBS. Fest embryo til parabolen med wolfram pinner mot dorsally. Utføre en dorsal slit i hindbrain tak-plate ved hjelp av skarpe glass kapillærer.
3. Skarpe pinsett og mikro-saks holde den øvre delen av hodet og trekk hindbrain vev svært nøye fra rostral til kaudal. Etter separasjon av hindbrain fjerne gjenværende ventrale vev for å oppnå et rent preparat.
4. Inkuber hindbrain med 4% Paraformaldehyde (PFA) løsning for 1-2 timer ved romtemperatur (RT). Vask hindbrain med PBT (PBS/0.1% Triton X-100) for å fjerne PFA.
5. For Immunfluorescens i flat-montert hindbrains legge 500 mL av blokkering løsning (5% av geit serum i PBT og inkuberes i 2 timer ved RT Inkuber med en ^st antistoff PÅ ved 4 ° C. Vask med PBT (15 min x 3). Inkuber med to ^nd-antistoff i 2 timer ved RT. Vask med PBT (15 min x 3).
6. Plasser hindbrain overfor dorsally på et glass lysbilde. Legg fluorescerende montering media på hindbrain. Bruk glass kapillærer eller tungsten nåler å flate hindbrain på lysbildet.
7. Legg liten mengde fett ved hvert hjørne for å hindre klemming av vevet med dekkglass. Nøye plassere et dekkglass på toppen av hindbrain og unngå luftbobler. For tilslutning legge neglelakk å dekke glass kanter.

2.2 Cryo-seksjoner og Immunfluorescens

1. Cryo-deler av hjernestammen can utføres når som helst å visualisere aksonale baner. Likevel, etter E6.5 dette bør være den foretrukne fremgangsmåte på grunn av vanskeligheter med å visualisere axoner i flat-montert embryo, som blir for tykt. Videre krever demonstrasjon av synapser seksjonering av vevet og en høy forstørrelse visning under et mikroskop.
2. Dissekere embryo og fjerne alle omkringliggende vev. Skyll med PBS. Kutt embryo ved kaudal delen av medulla bruker mikro-saks og skarpe pinsett. Lage et bredt innsnitt mellom lillehjernen og midthjernen og fjerne hele hjernestammen. Vevet bør inneholde medulla, pons og lillehjernen.
3. Fest hjernestammen i 4% PFA for natten (ON) ved 4 ° C, skyll med PBS (10 min x 3), og ruge med 30% sukrose for ON ved 4 ° C inntil synke.
4. Bygg inn hindbrain i en Cryo-formen med OCT (Optimal Cutting Temperature) sammensatte, og plassere den ved -20 ° C før frysing, som beskrevet andre steder ^11.
5. Tørk lysbildene. Tilsett 100 mL blokkerende løsning på hvert objektglass i 2 timer ved RT. Tilsett 100 pl av antistoff (fortynnet i den blokkerende oppløsning til den ønskede konsentrasjon). Inkubasjonstiden for ^1. og ^2. antistoffer er PÅ ved 4 ° C eller 2 timer ved romtemperatur, henholdsvis. For hver inkubasjonstid, tilsett parafilm stripe på toppen av lysbildet for å hindre tørrhet. Vask med PBS (10 min x 3) mellom antistoffer. Hvis nødvendig, tilsett 1:1.000 Dapi (4'-6-diamidino-2-phenylindole), fortynnet i PBS i 20 min ved RT. Skyll med PBS.
6. Monter lysbilde med fluorescerende montering media. La tørke i en time før analyse.

Representative Results

Denne protokollen ble nylig brukt til å avdekke de aksonale mønstre og projeksjon områder av da1 undergruppe av interneurons i chick hindbrain ^10. Spesifikt merke disse axoner, ble en enhancer element (Atoh1), som tidligere har vært karakterisert som spesifikt for spinal di1 nevroner ^8,12,13, bekreftet å være uttrykt i hindbrain da1 celler ^10. Elementet ble klonet oppstrøms til Cre recombinase og co-electroporated på E2.75 sammen med en Cre avhengig cytoplasmic GFP reporter plasmid (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP; Figur 1BI). Hindbrains ble analysert 48 hr følgende electroporation av flat-mount forberedelse og avdekket to kontra-laterale stigende aksonale projeksjon mønstre (Figur 2A), en traktat ble utelukkende stammer fra da1 nevroner ligger på rhombomeres 6-7 at langstrakte i en dorsal funiculus, mens andre stammer fra rhombomeres 2-5 og utvidet i en lateral funiculus.

14,15. En reporter Cre-betinget-Myristoylated-GFP (mGFP) kassett, klonet mellom de to PB armene (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), ble electroporated på E2.75 sammen med Atoh1 :: Cre Enhancer og transposase vektor (CAG :: PBase). I denne strategien er electroporated Cre-betinget mGFP integrert i chick kromosomer og dermed STOP kassetten er fjernet bare i da1 nevroner, slik at langvarig uttrykk for GFP i da1 celler (Figur 1BII, ^10). Den Myristoylated form av GFP stagene det til membranen slik at den er lokalisert langs den axonal membranen heller enn å bli fortynnet i cytoplasma. Brainstems var samlet på E13.5 og analysert i sagittal seksjoner (figur 2B). DA1 axoner ble funnet å akkumulere i lillehjernen og å utvide mot den ytre gr ringformet lag (EGL), som er preget av Zic1 ⁺ celler.

Synaptiske målene for da1 axoner i lillehjernen ble også analysert. E2.75 embryoene ble electroporated med synaptiske vesikkelproteinet 2 (SV2)-GFP reporter plasmid ^16,17, sammen med Atoh1 :: Cre enhancer og PB transposase (figur 1BIII). Denne metoden gjør det mulig uttrykk for GFP reporter i presynaptiske vesikler av da1 aksonale termini. Lillehjernen var delt på E13.5 og farget med den generelle presynaptiske markør synaptotagmin ^18,19, så vel som med calbindin at etikettene Purkinje lag (Tall 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ synaptiske vesikler ble påvist i flere lillehjernen regioner, inkludert Purkinje laget, indikerer de synaptiske forbindelser av da1 hindbrain interneurons i lillehjernen.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Figur 1 (A) Illustrasjon av electroporation teknikken i E2.75 chick hindbrain (B) Scheme av plasmider som brukes til betinget merke hindbrain DA1 interneurons; (I):.. Konstruerer inkluderer Atoh1 enhancer element klonet oppstrøms til Cre-recombinase cDNA og en betinget reporter plasmid, hvori et transkripsjons STOP kassetten er satt mellom CAGG enhancer / promoter-modul og den cytoplasmiske GFP-genet (cGFP). Den betingede uttrykk for GFP i da1 nevroner er drevet av Atoh1 :: Cre (II):. Den PiggyBac innarbeiding metode for å constitutively merke hindbrain celler. Konstruerer inkluderer Atoh1 :: Cre Enhancer plasmid, en Cre-betinget reporter kassett, der Myristoylated GFP (mGFP) er klonet mellom to PB armene (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), og en pbase transposase plasmid. Denintegrering av reporter kassetten inn i genomet til da1 nevroner er drevet av CAG :: PBase og Atoh1 :: Cre vektorer. (III): En lignende PiggyBac innarbeiding metode for å merke synaptiske mål for hindbrain interneurons. Den Cre-betinget reporter plasmid inkluderer en synaptiske SV2-GFP flankert mellom to PB armene (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Aksonale baner av da1 interneurons (A):. Flatskjerm-montert utarbeidelse av E4.5 hindbrain demonstrerer to stigende da1 aksonale urinveier (grønn, piler). Den neurofillament markør 3A10 (rød) brukes til å markere rhombomere grenser. (B) En sagittaldelen av lillehjernen av E13.5 embryo demonstrerer da1 axoner (grønn) akkumuleres i lillehjernen. De EGL celler er merket med Zic1 (rød). EGL, ekstern Granular Layer, er Skalalinje merket.

Figur 3. Synaptiske målene for da1 interneurons (A):. En sagittal delen av E13.5 lillehjernen farget med Calbindin (rosa) til mark Purkinje lag og DAPI (blå) til etikett kjerner. (B). En høyere forstørrelse visning av det markerte området i A. SV2-GFP merket da1 synapser (grønn) er vist i Purkinje laget av lillehjernen (rosa). Den generelle presynaptiske markør synaptotagmin (rød) er co-uttrykkes med SV2-GFP ⁺ synapser (gul, piler). Calb, Calbindin; S-Tag, synaptotagmin. Scale barer er merket.

Discussion

I ovo electroporation er et mulig, pålitelig og effektivt verktøy for å undersøke celle spesifikasjon og aksonal veiledning under chick nervesystemet utvikling ^20. I denne protokollen beskriver vi en modus for elektroporering i chick hindbrain på E2.75 hjelp enhancer elementer som gjør den betingede merking av bestemte interneurons. Denne strategien er kombinert med PiggyBac-mediert innarbeiding system for å sette inn fremmede gener inn i chick genomet, som muliggjør sporing av aksonale ruter, projeksjoner og synaptiske områder i avanserte stadier av embryogenese.

Tidligere metoder til å merke axoner / synapser i chick hindbrain inkludert klassisk retrograd eller anterograde fargestoff merking eller pode eksperimenter ^21-23. Disse studiene bidro betydelige funn på hindbrain stigende og synkende aksonale traktater. Imidlertid ble noen baner og prognoser oversett av disse cellulære tilnærminger. I addit ion, kunne molekylære identiteter av undergrupper av nevroner som projiseres inn i den rapporterte funiculi ikke bli avslørt. Vår felles metode for elektroporering og vedvarende genetisk sporing gir en unik evne til å følge utviklingen av utvalgte hindbrain nevroner fra sine spesifikasjon etapper for å axonal navigasjon og projeksjon mål ^10. Spesielt ble vår tilnærming tidligere søkt å spore aksonale baner av ryggmargen rygg interneurons for kortere perioder ^8,9.

De beskrevne verktøy kan også tjene til å avdekke molekylære mekanismer som styrer aksonale anslag; Genetiske koder (for eksempel Lim homeo-domain kode) ble selektivt endret i en bestemt neuronal undergruppe med enhancer-Cre/Lox-based tilnærming og virkningen av aksonal vekst og tilkobling ble fulgt ^8,10. Derfor kan denne protokollen være nyttig ikke bare for celle merking, men også for genetiske manipulasjoner på ønskede celler.

ve_content "> En av fordelene med elektroporering som en i ovo genet levering metoden er den hurtigheten i uttrykket, som er observert allerede innen tre timer etter electroporation ^24. Men forbigående uttrykk av introduserte gener blekner bort med celledelinger på senere utviklingsmessige stadier. For å overstyre denne begrensningen vi gjort bruk av PiggyBac innarbeiding metoden for i ovo genet innsetting. Dette verktøyet gjør det mulig for sporing av axoner og synapser på en robust måte for mye avanserte stadier etter elektroporering, sammenlignet med tidligere metoder. Som vi lett kunne gjenkjenne merket nevroner opp til 12 dager etter electroporation (E14.5), er det høyst sannsynlig til å bruke denne tilnærmingen selv for lengre perioder av gangen, blant annet etter klekking.

En annen fordel for chick nevralrørsdefekter electroporation tjeneren og ensidig satsing på celler i en romlig og tidsmessig begrensede manerer. Dette gjør sporing aksonale baner på both sider av hindbrain i et trinn-for-trinn basis, som er vanskeligere å følge i pattedyr. Dette er mest fordi bakterie-line transgenesis resulterer i merking av ønskede celler i begge nevralrørsdefekter sider, kompliserer muligheten til å spore ensidige anslag og å skille mellom opprinnelsen til ipsi og contra-laterale aksonale traktater. Til syvende og sist, basert på høy grad av homologi mellom mus og chick hjernestammen nevroner ^3,5, gir vår teknikk et kraftig verktøy for å få ny kunnskap om montering av ledninger og nevroner i utviklingsland virveldyr hindbrain.

Riktignok fordelene med teknikken vår, til bruken av enhancer elementer drive betinget uttrykk for reporter gener i chick nevralrøret krever nøye vurdering for celle-spesifisitet og timing av uttrykk for Enhancer-GFP konstruerer, innføring av noen enhancer elementer ble funnet i systemet vårt å drive en ikke-begrenset uttrykk for GFP i hindbrain, mens noenandre ga en ikke-spesifikk ekspresjon ved tidlig, men ikke sent, nevralrørs stadier (data ikke vist). Videre gjør vår strategi for øyeblikket ikke støtter en temporal-spesifikke uttrykk for reporter genet. Derfor kan vi ikke skille mellom tidlig eller senere-fødte undergrupper av da1 interneurons, noe som kan muligens projisere forskjellige aksonale traktater for å målrette ulike lillehjernen områder. Genetisk bygging av flere verktøy for å midlertidig slå på / av uttrykket av GFP i hindbrain nevroner vil være fordelaktig å følge mer presist utviklingen av aksonal baner og synapser i den embryonale / voksen hjernestammen. Endelig er en teknisk ulempe ved vår elektroporering strategi utilgjengelighet av embryoet til denne ved manipulering faser utover E2.75-3, på grunn av sin posisjon i egg, blodkar og innhyllende membraner. Denne begrensningen hindrer målretting av våre plasmider i flere undertyper av hindbrain nevroner som er født senere i utviklingen.