Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Published: May 29, 2013 doi: 10.3791/50136

Summary

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Abstract

Electroporation של הצינור העצבי החומוס העוברי יש יתרונות רבים כגון להיות מהיר ויעיל לביטוי של גנים זרים לתוך תאים עצביים. בכתב היד הזה אנו מספקים שיטה ייחודית המדגימה כיצד electroporate דנ"א לתוך המוח האחורי העופות בE2.75 כדי לתייג את קבוצת משנה של אבות עצביים באופן ספציפי, וכיצד לעקוב אחרי תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבים מתקדמים הרבה של פיתוח, עד E14.5. יש לנו מנוצלים כלים גנטיים חדשים כולל אלמנטים ספציפיים משפר, Cre / קס - פלסמידים מבוססי ומערכת ה-DNA טרנספוזיציה PiggyBac בתיווך לנהוג ביטוי של GFP בתת סוג של תאי מוח אחוריים (רוב תת קבוצה של interneurons הגבי, dA1). מסלולים ויעדים של dA1 האקסונים axonal הם אחריו בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחר באזורי גזע מוח שונים. אסטרטגיה זו תורמת טכניקות מתקדמות למיקוד תאים של עניין במוח האחורי העוברי ועבור טרהcing היווצרות מעגלים בשלבים שונים של פיתוח.

Introduction

המוח האחורי מייצג רכזת ממסר מרכזית של מערכת העצבים על ידי תקשורת בין מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות באמצעות עולה ויורד רשתות נוירונים. הוא מווסת את פונקציות בסיסיות כולל נשימה, תודעה, שמיעה, ומוטורי תיאום 1-3. במהלך ההתפתחות עוברית מוקדמת, המוח האחורי החוליות מחולק transiently לאורך הציר (AP) קדמי, האחורי שלה לתוך rhombomeres חוזרת ונשנית, שבו תאים מסוגים שונים עצביים נוצרים וליצור מרכזי גרעיני גזע מוח מספר 4. המוח האחורי מחולק גם לאורך הציר (DV) גב, גחונו לתוך צלחת בסיס ועלאר, שבו אבות עצביים בדידים להפוך צוינו ולהבדיל במקומות שונים DV 3,5,6. איך מוקדם AP וDV ספציפיים הדפוסים עצביים המסדירים את הקמתה של circuitries גזע המוח תפקודי הוא במידה רבה לא ידוע.

כדי לצבור ידע על זה בסיסישאלה, כלים הנדרשים כדי לתייג תת ספציפית של תאי עצב במוח האחורי מוקדם ולעקוב אחר המסלולים וקישוריות axonal בשלבים מתקדמים יותר. יש לנו מנוצלים בעבר אלמנטים משפר ספציפיים, ומערכת משפט תנאי Cre / מבוסס LoxP למעקב אחר המסלול של axonal interneurons השדרה הגבי בעובר האפרוח מוקדם 7-9. בכתב היד הנוכחית יש לנו ממוקד למוח האחורי ומשודרג פרדיגמה הניסויית לתיוג interneurons המאוחר עוברי המוח האחורי, אקסונים והיעדים סינפטיים שלהם, משתמש באסטרטגיה שונה וelectroporation PiggyBac - טרנספוזיציה DNA התיווך. האסטרטגיה החדשה שלנו מאפשרת התיוג של תת עצביים נפרדים בצד אחד של המוח האחורי ואת המעקב של תחזיות axonal ואתרים סינפטיים בשלבים עובריים שונים, מ -2 עד 12 ימים לאחר electroporation. המבוסס על שיטה זו, אנו הכותרת הגבי ביותר תת קבוצה של interneurons המוח האחורי (dA1/Atoh1 + 10.

שילוב של electroporation האפרוח, התחקות הגנטית של תאי עצב וניתוח של אתרי הקרנה בשלבים מתקדמים של פיתוח רבים מספק פלטפורמה ייחודית ללמוד את היווצרותם של רשתות עצביות במוח ועל מנת להבהיר מנגנונים מולקולריים השולטים היווצרות מעגל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporation המוח האחורי

טיפול ביצה 1.1

  1. מניחים את הביצים בצורה אופקית בחממת humidified (37-38.5 מעלות צלזיוס). עוברי electroporated לאחר 65-70 שעות של דגירה, כשהם מגיעים 16-17 (HH) שלב (25-30 somites).
  2. להסיר את הביצים מהחממה, הם נשארים במצב האופקי.

1.2 הכנות

  1. משוך זכוכית נימים (בקוטר 0.5 מ"מ).
  2. חבר אלקטרודות Genetrodes מכופף בצורת L זהב (קוטר 3 מ"מ) עם בעל מתאם למחולל הפעימות. פרמטרים Electroporation כוללים 25 וולט, 5 מספרים דופק, 45 אורך הפולס אלפיות, 300 מרווחי דופק msec.
  3. הכן פיפטה פה, 10 מיליליטר מחט מזרק, רצועות parafilm, מברשת רכה, מספריים חדים ולנתח 25 מיליליטר פתרון PBS סטרילית. סכום זה הוא בדרך כלל מספיק כדי להתמודד עם מגש ביצים (18 ביצים).
  4. הכן תערובת נאותה של פלסמידים DNA (5 מיקרוגרם / μl כל אחד) ולהוסיף על 0.025% צבע ירוק מהיר כדי להמחיש הזרקת ה-DNA. בדרך כלל בהיקף של 4 μl מספיק להזרקה של מגש.

1.3 Windowing, הזרקה וElectroporation

  1. יש לנקות את קליפות ביצים עם 70% אתנול.
  2. להתמודד עם ביצה אחת בכל פעם כדי לצמצם את זמן חשיפה עוברית לאוויר.
  3. לעשות חור בקוטב הביצה עם קצות המספריים ולהסיר מיליליטר 3-4 של אלבומין עם המזרק. אין להסיר כמות גדולה יותר של אלבומין שכן הוא מפחית יכולת קיום.
  4. פתח חלון סגלגל קטן (בגודל 2.5 ס"מ X 2) במרכז העליון של קליפת הביצה באמצעות המספריים לנתח.
  5. לטפטף כמה טיפות של PBS על גבי של העובר כדי למנוע יובש במהלך כל התהליך.
  6. טען כמות קטנה של תערובת ה-DNA לתוך נימי הזכוכית באמצעות פיפטה פה.
  7. הנח את העובר עם הקצה האחורי שלה כלפיך. הזרקת דיו לא נדרשת בשלב זה כעובר נראה בבירור. הימנעות עליות הזרקת דיוהישרדות עוברית. לחדור למוח האחורי הזנב על ידי החזקת הנימים ב ~ 45 מעלות. אין להסיר כל קרום מסביב העובר. הזרק פתרון ה-DNA בזהירות לתוך לום המוח האחורי ולנשוף בלי ליצור בועות אוויר. פתרון ה-DNA מתפשט anteriorly.
  8. מייד לאחר הזרקת ה-DNA, הנח את האלקטרודות המקבילות בAP המדויק ואת מיקום המוח האחורי DV אתם שואפים להתמקד. לדחוף את האלקטרודות מעט ventrally בלי לגעת בלב, כפי שהוא עשוי להפחית את הכדאיות. דופק electroporator. אלקטרודות צריכה להיות מכוסות בבועות כדי לציין מוליכות חשמלית (איור 1 א).
  9. מוציא בזהירות את האלקטרודות ולטפטף כמה טיפות של PBS כדי לקרר את העובר וכדי להסיר בועות. לאטום את הביצה פותחת כראוי עם רצועת parafilm כדי למנוע התייבשות במהלך דגירה. שטוף אלקטרודות בPBS עם המברשת הרכה.
  10. מניחים ביצה בחממה לאורך הרצוי של זמן. הישרדות של עוברים היא כ -90% אחרי 2-3 ימיםelectroporation, ומפחית עד 50% 12 ימים לאחר electroporation.

2. ניתוח של עוברים

2.1 הכנה וimmunofluorescence שטוח הר

  1. ניתן לבצע את ההכנות שטוח הר המוח האחורי לE6.5 לדמיין האקסונים בקלות תחת מיקרוסקופ או סטריאו מיקרוסקופ.
  2. לנתח את העובר בקפידה על ידי הפרדתו מקרומים המקיפים וכלי דם. הנח את העובר בסיליקון קטן - צלחת פטרי המכילה PBS מצופה. צרף את העובר לצלחת עם סיכות טונגסטן מול dorsally. לבצע חריץ בגב גג הצלחת באמצעות חדות זכוכית נימי המוח האחורי.
  3. באמצעות פינצטה חדה ומייקרו מספריים להחזיק את החלק העליון של הראש ולמשוך את רקמת המוח האחורי בזהירות רבה ממקורי לזנב. לאחר ההפרדה של רקמות המוח האחורי להסיר הגחון שנותרו כדי להגיע להכנה נקיות.
  4. דגירה המוח האחורי עם 4Paraformaldehyde% (PFA) פתרון עבור שעות 1-2 בטמפרטורת החדר (RT). שטוף את המוח האחורי עם PBT (PBS/0.1% טריטון X-100) כדי להסיר PFA.
  5. לImmunofluorescence בhindbrains שטוח רכוב להוסיף 500 μl של פתרון חסימה (5% נסיוב עז בPBT ו דגירה במשך שעה 2 ב RT דגירה עם נוגדן 1 st ON ב 4 ° C. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3). דגירה עם נוגדן nd 2 לשעה 2 ב RT. לשטוף עם PBT (15 דקות X 3).
  6. מניחים את המוח האחורי מול dorsally בשקופית זכוכית. הוסף תקשורת הרכבה ניאון אל המוח האחורי. השתמש בזכוכית נימים או מחטי טונגסטן לשטח המוח האחורי בשקופית.
  7. הוסף כמות קטנה של שומן בכל פינה כדי למנוע התכווצות של הרקמות על ידי להחליק את המכסה. זהירות במקום להחליק על גבי עטיפה של המוח האחורי ולמנוע בועות אוויר. לדבקות להוסיף לק כדי לכסות את קצות זכוכית.

2.2 סעיפי Cryo וImmunofluorescence

  1. סעיפי Cryo של CA גזע המוחn להתבצע בכל שלב כדי להמחיש מסלולי עצב. ובכל זאת, אחרי E6.5 זו צריכה להיות שיטה המועדפת בשל הקושי לדמיין האקסונים בעובר שטוח רכוב, אשר הופך להיות סמיכים מדי. יתר על כן, הפגנה של סינפסות דורשת חתך של הרקמות ונוף גבוהה הגדלה תחת מיקרוסקופ.
  2. לנתח את העובר ולהסיר את כל הרקמות הסובבות. יש לשטוף עם PBS. חותכים את העובר בחלק הזנב של הלשד באמצעות מיקרו מספריים ופינצטה חדה. ביצוע חתך רחב בין המוח הקטן והמוח התיכון ולהסיר את כל גזע המוח. הרקמה צריכה להכיל את הלשד, פונס ומוח הקטן.
  3. תקן גזע המוח בPFA 4% ללילה (ON) ב 4 ° C, לשטוף עם PBS (10 דק 'x 3), ו דגירה עם 30% סוכרוז לON על 4 מעלות צלזיוס עד לטביעתה.
  4. שבץ המוח האחורי בcryo-תבנית עם מתחם אוקטובר (טמפרטורה אופטימלית חיתוך), ולמקם אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הקפאה, כפי שתואר במקומות אחרים 11.
  5. ייבש את השקופיות. הוסף פתרון חסימת μl 100 בכל שקופית במשך שעה 2 ב RT. הוסף 100 μl של נוגדנים (בדילול בפתרון החסימה לריכוז הרצוי). תקופת הדגירה של 1 ו 2 nd נוגדנים היא על על 4 מעלות צלזיוס או 2 שעות ב RT, בהתאמה. לכל אחד זמן דגירה, בעדינות להוסיף רצועת parafilm על גבי השקופית כדי למנוע יובש. לשטוף עם PBS (10 דק 'x 3) בין נוגדנים. במידת צורך, להוסיף 1:1,000 DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole), בדילול מלא PBS במשך 20 דקות ב RT. יש לשטוף עם PBS.
  6. הר השקופית עם תקשורת הרכבה ניאון. תן יבש במשך שעה 1 לפני הניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה היה בשימוש לאחרונה לחשוף את דפוסי axonal ואתרי הקרנה של dA1 תת קבוצה של interneurons בחומוס המוח האחורי 10. לתייג במיוחד אקסונים אלה, אלמנט משפר (Atoh1), שבעבר התאפיין כספציפיים לתאי עצב בעמוד השדרה dI1 8,12,13, אושר לבוא לידי ביטוי במוח האחורי dA1 תאים 10. האלמנט שוכפל במעלה הזרם לCre recombinase ושיתוף electroporated-בE2.75 יחד עם כתב Cre תלוי cytoplasmic GFP פלסמיד (pCAGG-LoxP-stop-LoxP-cGFP; איור 1BI). Hindbrains נותח electroporation 48 שעות הבאות על ידי הכנה שטוח הר וחשף שני דפוסי הקרנת קונטרה לרוחב עולים axonal (איור 2 א); מערכת אחת נגזרה באופן בלעדי מdA1 נוירונים הממוקמים בrhombomeres 6-7 שמוארכים בחבל טבור הגבי, ואילו מקור אחר מrhombomeres 2-5 ומורחב בחבל טבור לרוחב.

> "Jove_content" כדי למפות את תחזיות axonal של dA1 interneurons בשלבים מאוחר יותר של התפתחות, שיטת טרנספוזיציה PiggyBac יושמה 14,15. כתב קלטת Cre-מותנה-myristoylated-GFP (mGFP), המשובטת בין שתי זרועות PB (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), הייתה בelectroporated E2.75 יחד עם Atoh1 :: Cre משפר ווקטור transposase (CAG :: PBase). באסטרטגיה זו, mGFP Cre-המותנה electroporated משתלב הכרומוזומים החומוס וכתוצאה מכך את קלטת STOP יוסר רק בdA1 הנוירונים, מה שמאפשר ביטוי ממושך של ה-GFP בdA1 תאים (איור 1BII; 10). טופס myristoylated מרצועותיו לGFP הקרום כזה שהוא מקומי לאורך קרום axonal במקום להיות מדולל בציטופלסמה. Brainstems נאספו ונותח בE13.5 בסעיפי sagittal (איור 2). dA1 אקסונים נמצאו להצטבר במוח הקטן ולהרחיב כלפי גר החיצוני שכבת anular (EGL), אשר מסומנת על ידי Zic1 + תאים.

מטרות של Synaptic dA1 האקסונים במוח הקטן גם נותחו. E2.75 עוברי electroporated עם חלבון הסינפטי שלפוחית ​​2 (SV2)-GFP כתב פלסמיד 16,17, יחד עם Atoh1 :: Cre משפר וtransposase PB (איור 1BIII). שיטה זו מאפשרת את הביטוי של כתב ה-GFP בשלפוחית ​​presynaptic של dA1 טרמיני עצב. המוח הקטן נותח בE13.5 ומוכתם בסמן הכללי מראש הסינפטי synaptotagmin 18,19, כמו גם עם calbindin שמתייג את שכבת פורקינג' (3A דמויות, 3 ב). SV2-GFP + שלפוחית ​​סינפטית התגלו באזורי מוח הקטנים מרובים, כולל שכבת פורקינג', המציינת את הקשרים סינפטיים של dA1 interneurons המוח האחורי במוח הקטן.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
איור 1 () איור של טכניקת electroporation במוח אחורי אפרוח E2.75 (ב ') תכנית של פלסמידים משמשים תווית תנאי dA1 interneurons המוח האחורי; (אני):.. בונה כוללת אלמנט משפר Atoh1 משובט מעלה זרם לCre-recombinase cDNA וכתב מותנה פלסמיד, שבו קלטת STOP תעתיק מוכנסת בין משפר CAGG / מודול האמרגן וגן GFP cytoplasmic (cGFP). ביטוי התנאי של ה-GFP בdA1 הנוירונים הוא מונע על ידי Atoh1 :: Cre (השני):. שיטת טרנספוזיציה PiggyBac לתייג constitutively תאי מוח אחורי. מבנים כוללים Atoh1 :: Cre משפר פלסמיד, קלטת כתב Cre-מותנית, שבה ה-GFP myristoylated (mGFP) הוא משובט בין שתי זרועות PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), וtransposase Pbase פלסמיד.שילוב של קלטת הכתב לתוך הגנום של תאי עצב dA1 הוא מונע על ידי החטיבה :: PBase וAtoh1 :: וקטורי Cre. (III): שיטת טרנספוזיציה PiggyBac דומה לתווית מטרות סינפטיים של interneurons המוח האחורי. כתב Cre-מותנה הפלסמיד כולל SV2-GFP הסינפטית וצדים בין שתי זרועות PB (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. מסלולי axonal של dA1 interneurons (א):. הכנה שטוחות רכוב של E4.5 המוח האחורי מדגים שני dA1 שטחי axonal עולים (ירוק, חיצים). Neurofillament הסמן 3A10 (אדום) המשמש לסימון גבולות rhombomere. (ב) sagittalסעיף של המוח הקטן של עובר E13.5 מדגים dA1 אקסונים (ירוק) המצטברים במוח הקטן. תאי EGL מסומנים עם Zic1 (אדום). EGL שכבת גרגרים חיצוני,, בר סולם מסומן.

איור 3
איור 3. מטרות של Synaptic dA1 interneurons (א):. קטע sagittal של המוח הקטן מוכתם E13.5 עם Calbindin (ורוד) לסימן פורקינג' השכבה וDAPI (כחול) לגרעיני תווית. (ב). צפו בהגדלה גבוהה יותר של האזור המסומן בא SV2-GFP שכותרתו dA1 סינפסות (ירוק) מוצגת בשכבת פורקינג' של המוח הקטן (ורוד). טרום הסינפטי סמן synaptotagmin הכללי (אדום) הוא במשותף עם הביע SV2-GFP + סינפסות (צהובים, חיצים). Calb, Calbindin; S-Tag, synaptotagmin. ברים סולם מסומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב electroporation אובו הוא כלי אפשרי, אמין, יעיל ולבחון מפרט תא והכוונה axonal במהלך אפרוח פיתוח מערכת עצבים 20. בפרוטוקול זה אנו מתארים מצב של electroporation במוח האחורי החומוס בE2.75 באמצעות משפר אלמנטים המאפשרים תיוג המותנה של interneurons הספציפי. אסטרטגיה זו היא בשילוב עם מערכת טרנספוזיציה PiggyBac בתיווך להוספת גנים זרים לתוך הגנום האפרוח, המאפשר מעקב אחר מסלולי axonal, תחזיות ואתרים סינפטיים בשלבים מתקדמים של עובר.

שיטות קודמות לאקסונים תווית / הסינפסות במוח האחורי האפרוח כללו צבע או מדרדר אנטרוגדית קלסית תיוג או השתלת ניסויי 21-23. מחקרים אלה תרמו ממצאים משמעותיים על המוח האחורי עולה ויורד שטחי עצב. עם זאת, כמה מסלולים ותחזיות היו להתעלם ידי אלה הסלולר גישות. בaddit יון, זהויות מולקולריות של תת קבוצות של נוירונים שמוקרנים לתוך funiculi דיווח לא יכולים להתגלות. השיטה המשולבת שלנו של electroporation וספג גנטי מעקב מספקת את היכולת הייחודית לעקוב אחר ההתפתחות של נוירונים מוח אחוריים נבחרים משלבי אפיונם לניווט axonal והקרנת מטרות 10. יש לציין, הגישה שלנו יושמה בעבר לאתר את המסלולים של axonal interneurons גב בעמוד השדרה לתקופות קצרות של זמן 8,9.

הכלים המתוארים יכולים גם לשמש כדי לחשוף את המנגנונים מולקולריים השולטים תחזיות axonal; קודים גנטיים (כגון קוד homeo-תחום לים) היו שונה באופן סלקטיבי בתת קבוצה עצבית מסוימת בגישת enhancer-Cre/Lox-based וההשפעה של צמיחת axonal וקישוריות בעקבות 8,10. לפיכך, פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לא רק לתיוג תא, אלא גם למניפולציות גנטיות בתאים רצויים.

ve_content "> אחד היתרונות של electroporation כמו בשיטת משלוח גן אובו הוא המהירות של ביטוי, אשר נצפה כבר במרחק של 3 שעות לאחר electroporation 24. עם זאת, הביטוי החולף של גנים הציגו נמוג משם עם חלוקות תא במאוחר התפתחותית שלבים. כדי לעקוף מגבלה זו שעשינו שימוש בשיטת טרנספוזיציה PiggyBac להחדרת גנים באוב. כלי זה מאפשר מעקב של אקסונים וסינפסות באופן חזק לשלבים מתקדמים הרבה אחרי electroporation, בהשוואה לשיטות קודמות. כפי שאנו יכולים לזהות בקלות כותרת נוירונים עד 12 ימים לאחר electroporation (E14.5), זה מתקבל על הדעת ביותר לשימוש בגישה זו גם לתקופות זמן ארוכות יותר, ובכלל זה לאחר בקיעה.

יתרון נוסף של ממסרי electroporation הצינור העצביים חומוס על המיקוד חד צדדי של תאים בנימוסים מוגבלים מרחב ובזמן. זה מאפשר איתור מסלולי axonal על bOth צדדים של המוח האחורי בבסיס שלב אחר שלב, וזה קשה יותר לעקוב ביונקים. זה בעיקר בגלל תוצאות transgenesis ניבט קו בתיוג של תאים רצויים בשני הצדדים בצינור עצביים, שמסבך את היכולת לעקוב אחר תחזיות חד צדדיות ולהפריד בין מוצאו של ipsi ושטחי axonal קונטרה לרוחב. סופו של דבר, המבוסס על הרמה הגבוהה של הומולוגיה בין עכברים וחומוס גזע המוח נוירונים 3,5, הטכניקה שלנו מספקת כלי רב עוצמה כדי לרכוש ידע חדש על ההרכבה של חיווט ונוירונים במוח האחורי חוליות המתפתחות.

אם כי את היתרונות של הטכניקה שלנו, את השימוש של אלמנטים משפר לנהוג ביטוי מותנה של גני כתב בחומוס צינור עצבי דורש הערכה זהירה לתא ספציפי ועיתוי של ביטוי של המבנים משפר-GFP; הקדמה של כמה אלמנטים משפר נמצאה המערכת שלנו לנהוג בביטוי שאינו מוגבל של ה-GFP במוח האחורי, ואילו מעטיםאחרים הניבו ביטוי הלא ספציפי בשלב מוקדם, אבל לא בשלבים מאוחר, צינור עצביים (מידע לא מוצג). יתר על כן, האסטרטגיה שלנו אינה תומכת כרגע בביטוי זמני ספציפי של גן הכתב. לפיכך, אין אנו יכולים להבחין בין תת קבוצות מוקדמות או במאוחר, יליד של dA1 interneurons, אשר עשויים אולי להקרין קטעי axonal שונים כדי להתמקד באזורי מוח קטנים שונים. הבנייה גנטית של כלים נוספים להפעלה / הפסקה באופן זמני את הביטוי של ה-GFP בתאי עצב מוח האחורי תהיה מועילה כדי לעקוב באופן מדויק יותר את הפיתוח של מסלולי axonal וסינפסות בגזע המוח העוברי / מבוגר. לבסוף, חסרון טכני של האסטרטגיה שלנו הוא electroporation הנגישות של העובר למניפולציה זו בשלבים מעבר E2.75-3, בשל מיקומו בביצה, כלי דם וקרומים עוטפים. מגבלה זו מונעת את המיקוד שלנו לפלסמידים תת נוסף של נוירונים מוח אחוריים שנולדו מאוחר יותר בפיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Tags

Neuroscience גיליון 75 נוירוביולוגיה ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית אנטומיה פיזיולוגיה גנטיקה Electroporation צ'יק המוח האחורי אקסון Interneuron dA1 PiggyBac Enhancer סינפסה תאי עצב האקסונים ביטוי של GFP, המוח האחורי מוח מודל חיה עוברי
Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A.,More

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter