Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Summary

Como as redes neuronais são estabelecidas no cérebro embrionário é uma questão fundamental no desenvolvimento da neurobiologia. Aqui nós combinamos uma técnica de eletroporação com novas ferramentas genéticas, como Cre / Lox-plasmídeos e sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada no hindbrain aviária para rotular interneurons dorsal e rastrear suas projeções axonais e metas sinápticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

Abstract

A electroporação do tubo neural embrionário pintainho tem muitas vantagens, tais como ser rápido e eficiente para a expressão de genes estranhos em células neuronais. Neste artigo, procuramos fornecer um método que demonstra unicamente como electroporate DNA no hindbrain aviária em E2.75, a fim de marcar especificamente um subconjunto de células progenitoras neuronais, e como seguir suas projeções axonais e metas sinápticas em estágios muito avançados de desenvolvimento, até E14.5. Utilizamos ferramentas genéticas novas, incluindo elementos específicos do realçador, Cre / Lox - plasmídeos base e do sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada para dirigir a expressão GFP em um subtipo de células rombencéfalo (o dorsal mais subgrupo de interneurônios, da1). Trajetórias e metas da da1 axônios axonal são seguidas em fases embrionárias precoces e tardias em várias regiões do tronco cerebral. Esta estratégia contribui com técnicas avançadas para as células de interesse alvo na parte posterior do cérebro embrionário e para tracing formação circuito em vários estágios de desenvolvimento.

Introduction

A parte posterior do cérebro representa um cubo do relé-chave do sistema nervoso por meio da comunicação entre os sistemas nervosos central e periférico via ascendente e descendente redes neuronais. Ele regula as funções básicas, incluindo respiração, consciência, audição e coordenação motora ^1-3. Durante o desenvolvimento embrionário inicial, a parte posterior do cérebro dos vertebrados é transitoriamente subdividida ao longo do eixo ântero-posterior (AP) em rhombomeres repetitivas, em que os tipos de células neuronais distintas são formadas e gerar múltiplos centros de núcleos do tronco cerebral ^4. A parte posterior do cérebro também é dividido ao longo do seu eixo dorsal-ventral (DV) em uma placa basal e alar, em que os progenitores neuronais discretas e diferenciar-se especificadas em locais distintos ^3,5,6 DV. Como o início da AP e DV específicos padrões neuronais estão governando o estabelecimento de circuitos do tronco cerebral funcional é em grande parte desconhecido.

Para adquirir conhecimentos sobre esta fundamentaisquestão, são necessárias ferramentas, a fim de rotular subconjuntos específicos de neurônios no cérebro posterior cedo e traçar suas trajetórias axonal e conectividade em estágios mais avançados. Nós já utilizou elementos de melhoria específica, e um sistema de expressão condicional Cre / baseado LoxP para acompanhar a trajetória axonal de interneurônios da coluna dorsal no embrião de galinha cedo ^7-9. No manuscrito atual que têm como alvo o cérebro posterior e atualizado o paradigma experimental para a rotulagem final interneurons rombencéfalo embrionárias, axônios e seus alvos sinápticas, usando uma estratégia de eletroporação modificado eo PiggyBac - Transposição DNA mediada. A nossa nova estratégia permite a marcação de subtipos neuronais distintas em um dos lados da parte posterior do cérebro e a localização dos seus locais de projecções axonais e sinápticos em vários estádios de desenvolvimento embrionário, a partir de 2 até 12 dias após a electroporação. Com base neste método, que classificou o dorsal, mais subgrupo de interneurons rombencéfalo (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

A combinação de garota eletroporação, rastreamento genético de neurônios e análise de locais de projeção em estágios muito avançados de desenvolvimento fornece uma plataforma única de estudar a formação de redes neuronais no cérebro e para elucidar os mecanismos moleculares que governam a formação de circuitos.

Protocol

1. Eletroporação hindbrain

1.1 manuseio Egg

1. Colocar os ovos horizontalmente numa incubadora humidificada (37-38,5 ° C). Os embriões são electroporados após 65-70 horas de incubação, quando atingem 16-17 (HH) fase (25-30 somites).
2. Retire os ovos da incubadora, eles permanecem na posição horizontal.

1.2 Preparações

1. Puxar capilares de vidro (0,5 mm de diâmetro).
2. Ligação dobrados em forma de L Genetrodes eléctrodos de ouro (diâmetro 3 mm) com uma placa de suporte para o gerador de impulsos. Parâmetros eletroporação incluem 25 volts, 5 números de pulso, 45 ms de comprimento de pulso, 300 intervalos de pulso ms.
3. Prepara-se uma pipeta de boca, agulha de seringa de 10 ml, as tiras de parafilme, uma escova macia, dissecando tesoura afiada e 25 ml de solução de PBS estéril. Esta quantidade é suficiente para lidar com uma bandeja de ovos (18 ovos).
4. Prepara-se uma mistura adequada de plasmídeos de ADN (5 mg / mL de cada) eadicionar cerca de corante Verde Rápido 0,025% para visualizar a injecção de ADN. Normalmente, um volume de 4 ul é suficiente para a injecção de um tabuleiro.

1.3 de janelas, Injeção e Eletroporação

1. Limpe as cascas de ovos com etanol 70%.
2. Lidar com um ovo de cada vez para minimizar o tempo de exposição ao ar embrionário.
3. Fazer um buraco no pólo ovo com as tesouras de pontas e remover 3-4 ml de albumina com a seringa. Não remova a maior quantidade de albumina, uma vez que reduz a viabilidade.
4. Abra uma pequena janela oval (2,5 x 2 cm de tamanho) na parte central superior da casca do ovo usando a tesoura de dissecação.
5. Gotejamento algumas gotas de PBS em cima do embrião para evitar a secura durante todo o processo.
6. Coloque uma pequena quantidade da mistura de ADN no capilar de vidro usando uma pipeta de boca.
7. Coloque o embrião com a extremidade posterior em direção a você. Sem injeção de tinta é necessária nesta fase, o embrião é claramente visível. Evitar um aumento de injeção de tintasobrevivência embrionária. Penetrar o hindbrain caudal mantendo o capilar em ~ 45 °. Não retire nenhuma membrana ao redor do embrião. Injetar solução de DNA com cuidado para a luz hindbrain e expire sem formar bolhas de ar. Solução de ADN espalha anteriormente.
8. Imediatamente após a injeção de DNA, coloque os eletrodos paralelos no AP precisa e DV posição hindbrain você apontar para o alvo. Empurrar os eléctrodos ligeiramente ventralmente sem tocar no coração, em que pode reduzir a viabilidade. Pulsar o electroporator. Os eléctrodos deverão ser cobertas com bolhas para indicar condutividade elétrica (Figura 1A).
9. Cuidadosamente retire os eletrodos e pingar algumas gotas de PBS para esfriar o embrião e para remover as bolhas. Selar o ovo abrir corretamente com uma tira de parafilme para evitar o ressecamento durante a incubação. Lavar eléctrodos em PBS com o pincel macio.
10. Coloque ovos na incubadora para o período de tempo desejado. A sobrevivência de embriões de aproximadamente 90% depois de 2-3 diaselectroporação, e reduz-se para 50% de 12 dias após a electroporação.

2. Análise de Embriões

2.1 Preparação e imunofluorescência plano de montagem

1. Preparações plano de montagem da parte posterior do cérebro podem ser realizadas até E6.5 para visualizar facilmente axônios sob um microscópio ou um estéreo-microscópio.
2. Dissecar o embrião cuidadosamente separando-a de membranas que envolvem e vasos sanguíneos. Colocar o embrião num pequeno silicone - revestido placa de Petri contendo PBS. Conecte o embrião para o prato com pinos de tungstênio enfrentam dorsal. Realize uma fenda dorsal na parte posterior do cérebro telhado placa usando sharp capilares de vidro.
3. Usando pinças afiadas e micro-tesouras segurar a parte superior da cabeça e puxe o tecido hindbrain com muito cuidado a partir de rostral para caudal. Após separação da rombencéfalo remover restantes tecidos ventrais para alcançar uma preparação limpa.
4. Incubar a hindbrain com 4Solução% paraformaldeído (PFA) por 1-2 horas em temperatura ambiente (RT). Lava-se a parte posterior do cérebro com PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para remover a PFA.
5. Para imunofluorescência em hindbrains plana montados adicionar 500 ul de solução de bloqueio (5% de soro de cabra em PBT e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com um anticorpo Incubar ^r ON a 4 ° C. A lavagem com PBT (15 minutos x 3). Incubar 2 ^nd com anticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBT (15 minutos x 3).
6. Colocar o rombencéfalo virada dorsalmente numa lâmina de vidro. Adicione meios de montagem fluorescentes na parte posterior do cérebro. Use capilares de vidro ou agulhas de tungstênio para achatar a hindbrain no slide.
7. Adicionar pequena quantidade de massa lubrificante, em cada canto para impedir a compressão do tecido por a lamela de cobertura. Cuidadosamente coloque uma cobertura de vidro na parte superior da parte posterior do cérebro e evitar bolhas de ar. Para adesão adicionar unha polonês para cobrir as bordas de vidro.

2.2 Cryo-seções e Imunofluorescência

1. Cryo-seções do tronco cerebral can ser realizada em qualquer fase de visualizar trajectórias axonais. No entanto, depois de E6.5 este deve ser o método preferido, devido à dificuldade em visualizar os axônios no embrião fixa-montado, que se torna demasiado espessa. Além disso, a manifestação de sinapses requer o seccionamento do tecido e uma vista de alta ampliação com um microscópio.
2. Dissecar o embrião e remover todos os tecidos circundantes. Lavar com PBS. Corte o embrião na parte caudal da medula usando micro-tesouras e pinças afiadas. Fazer uma ampla incisão entre o cerebelo eo mesencéfalo e remover todo o tronco cerebral. O tecido deve conter a medula, ponte e cerebelo.
3. Fixar o tronco cerebral em PFA a 4% durante a noite (ON) a 4 ° C, lavar com PBS (10 minutos x 3), e incubar com 30% de sacarose para LIGADO, a 4 ° C até afundamento.
4. Incorporar o rombencéfalo num molde de crio com outubro (temperatura óptima de corte) de composto, e colocá-lo a -20 ° C, até o congelamento, conforme descrito noutro local ^11.
5. Seque as lâminas. Adicionar 100 ul de solução de bloqueamento em cada lâmina, durante 2 horas à temperatura ambiente. Adicionar 100 ul de anticorpos (diluído em solução de bloqueio à concentração desejada). O período de incubação para a 1 ^ª e 2 ^ª anticorpos está ligado a 4 ° C ou 2 horas à temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tempo de incubação, adicionar suavemente parafilme tira na parte superior da corrediça para evitar a secura. Lavar com PBS (10 minutos x 3) entre os anticorpos. Se for necessário, adicionar 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-fenilindole), diluiu-se em PBS durante 20 min à TA. Lavar com PBS.
6. Montar o slide com meios de montagem fluorescentes. Deixe secar por 1 hora antes da análise.

Representative Results

Este protocolo foi usado recentemente para descobrir os padrões axonal e locais de projeção de da1 subgrupo de interneurônios na garota hindbrain ^10. Para identificar especificamente esses axónios, um elemento potenciador (Atoh1), que tenha sido previamente caracterizadas como específico para neurónios espinais ED1 ^8,12,13, foi confirmado para ser expresso em células rombencéfalo da1 ^10. O elemento foi clonado a montante Cre recombinase e co-electroporados em E2.75 juntamente com uma Cre dependente citoplasmática repórter GFP plasmídeo (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP; Figura 1BI). Hindbrains foram analisados ​​48 horas a seguir a electroporação, por uma preparação plana de montagem e revelou dois padrões de projecção axonal ascendentes contra-lateral (Figura 2A), um tracto foi exclusivamente derivado de da1 neurónios localizados em rhombomeres 6-7 que alongados numa funículo dorsal, enquanto o outro originado de rhombomeres 2-5 e estendidas em um funículo lateral.

14,15. Um repórter Cre-condicional-miristoiladas-GFP cassete (mGFP), clonado entre os dois braços de PB (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), foi electroporado em E2.75, juntamente com o intensificador de Cre Atoh1 :: ea transposase vetor (CAG :: PBASE). Nesta estratégia, o mGFP Cre-condicional electroporated está integrado nos cromossomas bico e, consequentemente, a cassete STOP é removido somente em da1 neurônios, permitindo a expressão prolongada de GFP em da1 células (Figura 1BII; ^10). A forma miristoiladas das amarras GFP-lo para a membrana de tal forma que ele está localizado ao longo da membrana axonal em vez de serem diluídas no citoplasma. Brainstems foram coletadas em E13.5 e analisados ​​nas seções sagital (Figura 2B). da1 axónios foram encontrados para acumular no cerebelo e a prolongar-se para o gr externo camada anular (EGL), que é marcada por células Zic1 ^+.

Alvos sinápticos do da1 axônios no cerebelo também foram analisadas. E2.75 embriões foram electroporadas com a proteína de vesícula sináptica 2 (SV2)-GFP plasmídeo repórter ^16,17, juntamente com Atoh1 :: Cre e potenciador da transposase PB (Figura 1BIII). Este método permite a expressão do repórter da GFP em vesículas pré-sinápticas da da1 terminais axonais. O cerebelo foi seccionado em E13.5 e coradas com o marcador geral de pré-sináptica sinaptotagmina ^18,19, bem como com calbindina que rotula a camada de Purkinje (Figuras 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ de vesículas sinápticas foram detectados em várias regiões do cerebelo, incluindo a camada de Purkinje, indicando as conexões sinápticas do da1 interneurónios rombencéfalo no cerebelo.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
A Figura 1 (A) Ilustração da técnica de electroporação em E2.75 pintainho rombencéfalo (B) Esquema de plasmídeos utilizados para etiquetar condicionalmente rombencéfalo da1 interneurónios: (I):.. Constrói incluir o elemento potenciador Atoh1 clonado a montante Cre-recombinase ADNc e um plasmídeo repórter condicional, em que uma cassete de interrupção da transcrição é inserido entre a CAGG potenciador / módulo promotor e o gene da GFP do citoplasma (cGFP). A expressão condicionada da GFP em neurónios da1 é accionado por Atoh1 :: Cre (II):. PiggyBac O método de transposição para etiquetar células constitutivamente rombencéfalo. As construções incluem o Atoh1 :: Cre potenciador plasmídeo, uma cassete repórter Cre-condicional, em que miristoiladas GFP (mGFP) é clonado entre os dois braços de PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), e uma transposase Pbase plasmídeo. Oa integração da cassete repórter no genoma de da1 neurónios é impulsionado pelo GAC PBASE :: e :: Atoh1 vectores Cre. (III): Um método de transposição PiggyBac semelhante para rotular alvos sinápticos do interneurons rombencéfalo. O repórter Cre-condicional plasmídeo inclui uma sináptica SV2-GFP ladeado entre os dois braços PB (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2. Trajetórias axonal de da1 interneurons (A):. Uma preparação flat-montado de E4.5 hindbrain demonstra duas ascendentes da1 tratos axonais (verde, setas). O neurofillament marcador 3A10 (vermelho) é usado para marcar fronteiras rhombomere. (B) Um sagitalseção do cerebelo de E13.5 embrião demonstra da1 axônios (verde) que se acumulam no cerebelo. As células são marcadas com EGL Zic1 (vermelho). EGL, Camada granular externa, bar Scale é marcado.

Figura 3. Alvos sinápticos do da1 interneurons (A):. Uma seção sagital do cerebelo E13.5 manchada com Calbindin (rosa) a marca de Purkinje camada e DAPI (azul) para rotular os núcleos. (B). Uma visão maior ampliação da área marcada em A. SV2-GFP marcado da1 sinapses (verde) são mostrados na camada de Purkinje do cerebelo (rosa). O general pré-sináptica marcador sinaptotagmina (vermelho) é co-expressa com SV2-GFP ⁺ sinapses (amarelo, setas). CALB, Calbindin; S-Tag, sinaptotagmina. Barras de escala são marcadas.

Discussion

Na eletroporação in ovo é uma ferramenta viável, confiável e eficaz para examinar especificação celular e orientação axonal durante garota desenvolvimento do sistema nervoso ^20. Neste protocolo, descrevemos um modo de eletroporação na hindbrain garota em E2.75 usando elementos potenciador que permitem a rotulagem condicional de interneurons específicas. Esta estratégia é combinada com o sistema de transposição PiggyBac mediada para inserir genes estranhos no genoma do pintinho, que permite o rastreamento de rotas axonal, projeções e sites sinápticas em estágios avançados da embriogênese.

Métodos anteriores para rótulo axônios / sinapses no cérebro posterior garota incluiu tintura retrógrada ou anterógrada clássico rotulagem ou enxertia experimentos ^21-23. Estes estudos contribuíram resultados significativos em hindbrain subindo e descendo tratos axonais. No entanto, algumas trajetórias e projeções foram ignorados por essas abordagens celulares. Em addit iônica, identidades moleculares de subgrupos de neurônios que se projetam para o funiculi informou não poderia ser revelado. Nosso método combinado de eletroporação e sustentada genética tracing oferece a capacidade única de acompanhar o desenvolvimento dos neurônios rombencéfalo selecionados a partir de suas fases de especificação para navegação axonal e as metas de projeção ^10. Notavelmente, a nossa abordagem foi aplicada anteriormente para traçar as trajetórias axonal de medula espinhal dorsal interneurons por períodos mais curtos de tempo ^8,9.

As ferramentas descritas podem também servir para descobrir os mecanismos moleculares que governam projecções axonais; códigos genéticos (tais como o código de domínio homeo-Lim), foram modificados de forma selectiva um determinado subgrupo neuronal utilizando a abordagem enhancer-Cre/Lox-based e impacto do crescimento axonal e conectividade foi seguido ^8,10. Assim, este protocolo pode ser útil não só para a marcação celular, mas também para as manipulações genéticas nas células desejadas.

ve_content "> Um dos benefícios da electroporação, como um método de entrega de genes in ovo é a rapidez de expressão, o qual já é observada dentro de 3 horas após a electroporação ^24. No entanto, a expressão transiente dos genes introduzidos distância desaparece com divisões celulares no posterior desenvolvimento etapas. substituir essa limitação, fizemos uso do método de transposição PiggyBac na inserção do gene ovo. Esta ferramenta permite o rastreamento dos axônios e sinapses de uma maneira muito robusta para estágios avançados após a eletroporação, em relação aos métodos anteriores. À medida que poderia facilmente detectar neurónios rotulados até 12 dias após a electroporação (E14.5), é altamente plausível para utilizar esta abordagem, mesmo durante longos períodos de tempo, incluindo após a eclosão.

Outro benefício do bico do tubo neural relés eletroporação na segmentação unilateral de células em uma maneiras restritas espaciais e temporais. Isso permite traçar trajetórias axonal em both os lados da parte posterior do cérebro em uma base de etapa por etapa, o que é mais difícil de seguir em mamíferos. Isto é principalmente porque transgênese germinativas resultados na marcação de células desejadas, em ambos os lados do tubo neural, o que complica a capacidade de traçar projeções unilaterais e para separar entre a origem da ipsi e contra-tratos axonais laterais. Em última instância, com base no alto grau de homologia entre ratos e garota tronco cerebral neurônios ^3,5, nossa técnica fornece uma ferramenta poderosa para ganhar novos conhecimentos sobre a montagem de fiação e os neurônios no cérebro posterior desenvolvimento dos vertebrados.

Embora as vantagens da nossa técnica, o uso de elementos potenciadores para conduzir a expressão de genes repórter condicional no pintainho tubo neural requer uma avaliação cuidadosa para a célula-especificidade e de sincronização de expressão das construções potenciador-GFP; introdução de alguns elementos potenciadores foram encontrados em nosso sistema para conduzir uma expressão não restrita da GFP no cérebro posterior, ao passo que algunsoutros rendeu uma expressão não específica no início, mas não final, as fases do tubo neural (dados não mostrados). Além disso, nossa estratégia não suporta atualmente uma expressão específica-temporal do gene repórter. Por isso, não é possível distinguir entre os subgrupos cedo ou mais tarde, nascido de da1 interneurons, que pode, eventualmente, projeto diferente tratos axonais para atingir áreas do cerebelo distintas. Construção genética de ferramentas adicionais para mudar temporariamente de ligar / desligar a expressão de GFP em neurônios rombencéfalo será benéfico para acompanhar mais precisamente o desenvolvimento de trajetórias de axônios e sinapses no tronco cerebral embrionário / adulto. Finalmente, uma desvantagem técnica de electroporação nossa estratégia é a inacessibilidade do embrião para esta manipulação em fases além E2.75-3, devido à sua posição no ovo, os vasos sanguíneos e as membranas envolventes. Esta limitação impede a segmentação dos nossos plasmídeos em subtipos adicionais de neurónios rombencéfalo que nascem mais tarde no desenvolvimento.