Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Summary

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Abstract

Elettroporazione del pulcino embrionale tubo neurale ha molti vantaggi come essere veloce ed efficiente per l'espressione di geni estranei in cellule neuronali. In questo manoscritto forniamo un metodo che dimostra univocamente come l'elettroporazione di DNA nel cervello posteriore aviaria in E2.75, al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di progenitori neuronali, e come seguire le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche in Gran fase avanzata di sviluppo, fino a E14.5. Abbiamo utilizzato nuovi strumenti genetici tra cui specifici elementi enhancer, Cre / Lox - plasmidi base e il sistema di recepimento DNA PiggyBac-mediata di guidare l'espressione della GFP in un sottotipo di cellule romboencefalo (la dorsale più sottogruppo di interneuroni, DA1). Traiettorie e target di DA1 assoni assonale sono seguiti a inizio e fine fasi embrionali in varie regioni del tronco encefalico. Questa strategia contribuisce tecniche avanzate per il targeting di cellule di interesse nel romboencefalo embrionale e per il TRACing formazione circuito a più stadi di sviluppo.

Introduction

Romboencefalo rappresenta un mozzo relè chiave del sistema nervoso comunicando tra il sistema nervoso centrale e periferico tramite ascendente e discendente reti neuronali. Esso regola le funzioni di base tra cui la respirazione, la coscienza, l'udito, e la coordinazione motoria ^1-3. Durante lo sviluppo embrionale precoce, la romboencefalo vertebrati viene transitoriamente suddiviso lungo il suo asse antero-posteriore (AP) in rhombomeres ripetitivi, in cui si formano diversi tipi di cellule neuronali e generano molteplici centri nuclei del tronco cerebrale ^4. Il cervello posteriore è diviso lungo il suo asse dorso-ventrale (DV) in una piastra basale e alari, in cui progenitori neuronali discrete diventano specificati e differenziano in distinti luoghi DV ^3,5,6. Come il primo AP e specifiche DV modelli neuronali sono di istituzione dei circuiterie tronco cerebrale funzionale è in gran parte sconosciuto.

Di acquisire conoscenze su questo fondamentalequestione, gli strumenti sono necessari al fine di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni nel cervello posteriore e presto per tracciarne la traiettoria degli assoni e la connettività nelle fasi più avanzate. Abbiamo precedentemente utilizzati specifici elementi enhancer, e un sistema di espressione condizionale Cre / loxP-based per il monitoraggio traiettoria assonale delle dorsali interneuroni spinali nei primi embrione di pollo ^7-9. Nel manoscritto attuale abbiamo preso di mira il cervello posteriore e aggiornato il paradigma sperimentale per l'etichettatura di fine interneuroni romboencefalo embrionali, gli assoni e ai loro obiettivi sinaptici, utilizzando una strategia di elettroporazione modificato e il PiggyBac - trasposizione del DNA mediata. La nostra nuova strategia permette la codifica dei sottotipi neuronali distinti in un lato del cervello posteriore e il tracciamento delle loro proiezioni assonali e siti sinaptici nelle varie fasi embrionali, da 2 a 12 giorni dopo l'elettroporazione. In base a questo metodo, abbiamo etichettato la dorsale più a sottogruppo di interneuroni romboencefalo (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

La combinazione di pulcino elettroporazione, genetica rintracciamento di neuroni e analisi di siti per proiezioni molto stadi avanzati di sviluppo prevede una piattaforma unica per studiare la formazione di reti neuronali nel cervello e per chiarire i meccanismi molecolari che presiedono circuito.

Protocol

1. Romboencefalo elettroporazione

1.1 gestione Egg

1. Mettere le uova orizzontalmente in un incubatore umidificato (37-38,5 ° C). Gli embrioni sono elettroporati dopo 65-70 ore di incubazione, quando raggiungono 16-17 (HH) stadio (25-30 somiti).
2. Togliere le uova dal termostato, rimangono in posizione orizzontale.

1.2 Preparativi

1. Tirare vetro capillari (0,5 mm di diametro).
2. Collegare piegati a forma di L oro Genetrodes elettrodi (3 mm di diametro) con un supporto adattatore per il generatore di impulsi. Parametri di elettroporazione sono 25 volt, 5 numeri di impulsi, 45 ms lunghezza dell'impulso, 300 msec intervalli di impulso.
3. Preparare una pipetta a bocca, 10 ml della siringa, strisce parafilm, una spazzola morbida, forbici dissezione nitide e 25 ml di soluzione PBS sterile. Tale importo è di solito sufficiente per gestire un vassoio di uovo (18 uova).
4. Preparare una miscela adeguata di plasmidi di DNA (5 mg / mL ciascuno) eaggiungere circa 0.025% Veloce colorante verde per visualizzare l'iniezione del DNA. Solitamente un volume di 4 ml è sufficiente per l'iniezione di un vassoio.

1.3 windowing, iniezione ed elettroporazione

1. Pulire i gusci d'uovo con il 70% di etanolo.
2. Maneggiare un uovo alla volta a ridurre al minimo il tempo di esposizione embrionale all'aria.
3. Fare un buco al polo uovo con le estremità forbici e togliere 3-4 ml di albumina con la siringa. Non rimuovere una maggiore quantità di albumina in quanto riduce la vitalità.
4. Aprire una piccola finestra ovale (2,5 x 2 dimensioni cm) al centro superiore del guscio delle uova usando le forbici dissezione.
5. Gocciolare qualche goccia di PBS sopra l'embrione per prevenire la secchezza durante tutto il processo.
6. Caricare una piccola quantità della miscela DNA nel capillare di vetro usando una pipetta a bocca.
7. Posizionare l'embrione con la sua estremità posteriore verso di voi. Nessuna iniezione di inchiostro è richiesta in questa fase, l'embrione è chiaramente visibile. Evitare aumenti di iniezione d'inchiostrosopravvivenza embrionale. Penetrare il romboencefalo caudale tenendo il capillare a ~ 45 °. Non rimuovere la membrana da tutto l'embrione. Iniettare la soluzione di DNA con cura nel lume romboencefalo ed espirare senza formare bolle d'aria. Soluzione di DNA diffonde anteriormente.
8. Subito dopo l'iniezione del DNA, posizionare gli elettrodi paralleli al preciso AP e la posizione romboencefalo DV si mira a bersaglio. Spingere gli elettrodi leggermente ventrale senza toccare il cuore, in quanto può ridurre la vitalità. Pulse il elettroporatore. Elettrodi devono essere coperti con bolle per indicare conducibilità elettrica (Figura 1A).
9. Rimuovere con attenzione gli elettrodi e gocciolare qualche goccia di PBS per raffreddare l'embrione e per rimuovere le bolle. Sigillare l'uovo apertura correttamente con una striscia di parafilm per evitare l'essiccazione durante l'incubazione. Lavare elettrodi in PBS con la spazzola morbida.
10. Mettere uova in incubatrice per il tempo desiderato. La sopravvivenza degli embrioni è di circa il 90% 2-3 giorni dopoelettroporazione, e riduce fino al 50% 12 giorni dopo l'elettroporazione.

2. Analisi di embrioni

2.1 preparazione Flat-mount e immunofluorescenza

1. Flat-mount preparativi del cervello posteriore possono essere eseguite fino a E6.5 di visualizzare facilmente gli assoni al microscopio o di uno stereo-microscopio.
2. Sezionare con cura l'embrione separandola dalla membrane che circondano e vasi sanguigni. Posizionare l'embrione in un piccolo silicone - rivestito piastra di Petri contenente PBS. Attaccare l'embrione al piatto con perni di tungsteno rivolti dorsalmente. Eseguire una fenditura dorsale nel romboencefalo tettoia parapioggia con tagliente capillari di vetro.
3. Usando le pinzette taglienti e micro-forbici tenere la parte superiore della testa e tirare con molta attenzione il tessuto hindbrain dal rostrale caudale. Dopo separazione della romboencefalo eliminare i rimanenti tessuti ventrali raggiungere una preparazione pulita.
4. Incubare la romboencefalo con 4Paraformaldeide soluzione% (PFA) per 1-2 ore a temperatura ambiente (RT). Lavare il romboencefalo con PBT (PBS/0.1% Triton X-100) per rimuovere PFA.
5. Per immunofluorescenza in hindbrains piatto montati aggiungere 500 ml di soluzione di bloccaggio (5% di siero di capra in PBT e incubare per 2 ore a RT Incubare con ¹ m anticorpo ON a 4 ° C. Lavare con PBT (15 min x 3). Incubare con il 2 ^° anticorpo per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBT (15 min x 3).
6. Posizionare il romboencefalo fronte dorsalmente su un vetrino. Aggiungi mezzi di montaggio fluorescenti sul cervello posteriore. Utilizzare vetro capillari o aghi di tungsteno per appiattire il romboencefalo sulla diapositiva.
7. Aggiungere piccole quantità di grasso ad ogni angolo per impedire spremitura del tessuto dal vetrino. Collocare il vetrino sulla parte superiore del cervello posteriore e di evitare bolle d'aria. Per aderenza aggiungere smalto per coprire i bordi di vetro.

2.2 Cryo-sezioni ed immunofluorescenza

1. Cryo-sezioni del tronco encefalico can essere eseguita in qualsiasi momento per visualizzare traiettorie assonali. Eppure, dopo E6.5 questo dovrebbe essere il metodo preferito per la difficoltà di visualizzare assoni nell'embrione piatto montata, che diventa troppo spesso. Inoltre, la dimostrazione di sinapsi richiede sezionamento del tessuto e una vista di alto ingrandimento al microscopio.
2. Sezionare l'embrione e rimuovere tutti i tessuti circostanti. Risciacquare con PBS. Tagliare l'embrione alla parte caudale del midollo utilizzando micro-forbici e pinzette taglienti. Fai una vasta incisione tra il cervelletto e il mesencefalo e rimuovere l'intero tronco encefalico. Il tessuto deve contenere il midollo, ponte e cervelletto.
3. Fissare il tronco encefalico in PFA 4% per il pernottamento (ON) a 4 ° C, lavare con PBS (10 min x 3), e incubare con il 30% di saccarosio per ON a 4 ° C fino al naufragio.
4. Incorpora il romboencefalo in un crio-stampo con ottobre composto (Optimal Cutting Temperature), e metterlo a -20 ° C fino a congelamento, come descritto altrove ^11.
5. Asciugare i vetrini. Aggiungere 100 microlitri soluzione bloccante in ogni diapositiva per 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 100 ml di anticorpi (diluito in soluzione di blocco fino alla concentrazione desiderata). Il periodo di incubazione per 1 ^° e ² ° anticorpi è ON a 4 ° C o 2 ore a temperatura ambiente, rispettivamente. Per ogni periodo di incubazione, aggiungere delicatamente striscia parafilm sulla parte superiore della diapositiva per prevenire la secchezza. Lavare con PBS (10 min x 3) tra gli anticorpi. Se necessario, aggiungere 1:1.000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenilindolo), diluito in PBS per 20 minuti a RT. Risciacquare con PBS.
6. Montare il vetrino con mezzi di montaggio fluorescenti. Lasciate asciugare per 1 ora prima dell'analisi.

Representative Results

Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per scoprire i modelli assonale e siti di proiezione di DA1 sottogruppo di interneuroni nella romboencefalo pulcino ^10. Per etichettare specificamente questi assoni, un elemento enhancer (Atoh1), che è stata precedentemente caratterizzata da specifici per i neuroni spinali DI1 ^8,12,13, è stato confermato da esprimere in romboencefalo DA1 cellule ^10. L'elemento è stato clonato a monte di Cre ricombinasi e co-elettroporato a E2.75 insieme a un Cre dipendente citoplasmatica GFP plasmide reporter (pCAGG-loxP-Stop-loxP-CGFP; Figura 1BI). Hindbrains sono stati analizzati 48 ore seguenti l'elettroporazione per la preparazione di TV a monte e ha rivelato due ascendenti modelli di proiezione assonale contro-laterale (Figura 2A); un tratto è stato derivato esclusivamente da DA1 neuroni situati in rhombomeres 6-7 che allungata in un funicolo dorsale, mentre il altri provenivano da rhombomeres 2-5 e ampliato in un funicolo laterale.

14,15. Un giornalista Cre-condizionale-Myristoylated-GFP (mGFP) cassetta, clonato tra i due bracci PB (PB-CAG-loxP-STOP-loxP-mGFP-PB), è stato elettroporata a E2.75 insieme al Atoh1 :: Cre enhancer e il trasposasi vettore (CAG :: PBase). In questa strategia, il elettroporate mGFP Cre-condizionale è integrato nei cromosomi pulcino e di conseguenza la cassetta di STOP viene rimosso solo in DA1 neuroni, permettendo prolungata espressione di GFP in DA1 cellule (Figura 1BII; ^10). La forma Myristoylated delle GFP attacchi esso alla membrana tale che esso è localizzato lungo la membrana assonale anziché essere diluito nel citoplasma. Brainstems stati raccolti a E13.5 e analizzati in sezioni sagittali (Figura 2B). da1 assoni sono stati trovati per accumularsi nel cervelletto e di estendere verso l'esterno gr strato anulare (EGL), che è caratterizzato da ZIC1 cellule ^+.

Bersagli sinaptici di DA1 assoni nel cervelletto sono stati analizzati. E2.75 embrioni sono stati elettroporate con proteine ​​delle vescicole sinaptiche 2 (SV2)-GFP plasmide reporter ^16,17, insieme a Atoh1 :: Cre enhancer e il PB trasposasi (Figura 1BIII). Questo metodo consente l'espressione del reporter GFP nelle vescicole presinaptiche di DA1 termini assonale. Il cervelletto era sezionati a E13.5 e colorati con il marcatore presinaptico generale synaptotagmin ^18,19, nonché con calbindina che contrassegna lo strato di Purkinje (Figure 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ vescicole sinaptiche sono stati rilevati in più regioni cerebellari, compreso lo strato di Purkinje, indicando le connessioni sinaptiche di DA1 interneuroni romboencefalo nel cervelletto.

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Figura 1 (A) Illustrazione della tecnica di elettroporazione in E2.75 pulcino romboencefalo (B) Schema dei plasmidi utilizzati per etichettare condizionale romboencefalo DA1 interneuroni; (I):.. Costrutti includono l'elemento Atoh1 enhancer clonato a monte di Cre-ricombinasi cDNA e un reporter condizionale plasmide, in cui è inserita una cassetta di STOP trascrizionale tra il CAGG enhancer / modulo promotore e il gene GFP citoplasmatica (CGFP). L'espressione condizionale di GFP in neuroni DA1 è guidato da Atoh1 :: Cre (II):. Metodo trasposizione PiggyBac per etichettare costitutivamente cellule romboencefalo. Costrutti includono il Atoh1 :: Cre enhancer plasmide, una cassetta giornalista Cre-condizionale, in cui Myristoylated GFP (mGFP) viene clonato tra due bracci PB (PB-CAG-loxP-STOPLoxP-mGFP-PB), e un trasposasi Pbase plasmide. Gliintegrazione della cassetta giornalista nel genoma di DA1 neuroni è guidata dai GAC :: PBase e Atoh1 :: vettori Cre. (III): Un metodo simile trasposizione PiggyBac di etichettare bersagli sinaptici di interneuroni romboencefalo. Il giornalista Cre-condizionale plasmide include un sinaptica SV2-GFP affiancato tra due bracci PB (PB-loxP-STOP-loxP-SV2-GFP-PB). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Traiettorie assonali di DA1 interneuroni (A): a. Preparazione piatto montato su E4.5 romboencefalo dimostra due ascendenti DA1 tratti assonali (verde, frecce). Il neurofillament marcatore 3A10 (rosso) viene utilizzato per marcare i confini rhombomere. (B) A sagittalesezione del cervelletto di E13.5 embrioni dimostra DA1 assoni (verde) si accumulano nel cervelletto. Le cellule EGL sono etichettati con ZIC1 (rosso). EGL, strato granulare esterno, bar Scala è segnato.

Figura 3. Bersagli sinaptici di DA1 interneuroni (A).: Una sezione sagittale del cervelletto E13.5 colorati con Calbindin (rosa) a marchio Purkinje strato e DAPI (blu) per nuclei etichetta. (B). Una vista ingrandimento maggiore della parte segnata A. SV2-GFP etichettato da1 sinapsi (verde) sono mostrati nello strato Purkinje del cervelletto (rosa). Il generale di pre-sinaptico marcatore synaptotagmin (rosso) è co-espresso con SV2-GFP ⁺ sinapsi (giallo, frecce). CALB, Calbindin; S-Tag, synaptotagmin. Barre di scala sono contrassegnati.

Discussion

In elettroporazione ovo è uno strumento fattibile, affidabile ed efficace per esaminare le specifiche delle cellule e la guida assonale durante pulcino sviluppo del sistema nervoso ^20. In questo protocollo si descrive una modalità di elettroporazione in romboencefalo pulcino a E2.75 utilizzando elementi enhancer che consentano l'etichettatura condizionale di interneuroni specifici. Questa strategia è combinato con il sistema di recepimento PiggyBac-mediata di inserire geni estranei nel genoma pulcino, che consente il monitoraggio dei percorsi assonale, proiezioni e siti sinaptici in fase avanzata di embriogenesi.

Metodi precedenti per etichetta assoni / sinapsi nel cervello posteriore pulcino inclusi classical colorante retrograda o anterograda etichettatura o l'innesto esperimenti ^21-23. Questi studi hanno contribuito i dati significativi sulla romboencefalo ascendenti e discendenti tratti assonali. Tuttavia, alcune traiettorie e le proiezioni sono stati trascurati da questi approcci cellulari. In addit ione, le identità molecolari di sottogruppi di neuroni che proiettano nel Funiculi riportato non potevano essere rivelati. Il nostro metodo combinato di elettroporazione e sostenuto genetica tracciato offre la possibilità unica di seguire lo sviluppo dei neuroni romboencefalo selezionati dalle loro fasi di specifica alla navigazione assonale e obiettivi di proiezione ^10. In particolare, il nostro approccio è stato precedentemente applicato per tracciare le traiettorie degli assoni del midollo spinale interneuroni dorsali per brevi periodi di tempo ^8,9.

Gli strumenti descritti possono anche servire per scoprire meccanismi molecolari che governano proiezioni assonale; codici genetici (ad esempio il codice homeo-dominio Lim) furono selettivamente modificati in un certo sottogruppo neuronale utilizzando l'approccio enhancer-Cre/Lox-based e impatto della crescita assonale e la connettività è stata seguita ^8,10. Quindi, questo protocollo può essere utile non solo per l'etichettatura delle cellule, ma anche per le manipolazioni genetiche su cellule desiderate.

ve_content "> Uno dei vantaggi di elettroporazione come un metodo in gene delivery ovo è la rapidità di espressione, che si osserva già entro 3 ore dopo l'elettroporazione ^24. Tuttavia, l'espressione transiente dei geni introdotti svanisce via con divisioni cellulari a seguito dello sviluppo fasi. Per ignorare questa limitazione abbiamo fatto uso del metodo di trasposizione per PiggyBac in ovo inserimento del gene. Questo strumento consente il tracciamento degli assoni e sinapsi in un modo molto robusto per stadi avanzati dopo l'elettroporazione, rispetto ai metodi precedenti. Come potremmo facilmente individuare etichettato neuroni fino a 12 giorni dopo l'elettroporazione (E14.5), è altamente plausibile di utilizzare questo approccio anche per lunghi periodi di tempo, anche dopo la schiusa.

Un altro vantaggio del pulcino neurali relè elettroporazione a tubo sul Targeting unilaterale delle cellule in una maniere ristretti spaziali e temporali. Ciò consente di tracciare traiettorie assonali su bOTH lati del cervello posteriore in base stadio per stadio, che è più difficile da seguire nei mammiferi. Questo è soprattutto perché germinali risultati transgenesi in etichettatura delle cellule desiderate in entrambi i lati del tubo neurale, complicando la possibilità di ricostruire proiezioni unilaterali e per separare tra l'origine del IPSI e tratti assonali controlaterale. In ultima analisi, basata su l'alto grado di omologia tra topi e pulcino tronco cerebrale neuroni ^3,5, la nostra tecnica fornisce un potente strumento per acquisire nuove conoscenze sul gruppo di cablaggio e di neuroni nel cervello posteriore sviluppo dei vertebrati.

Seppur i vantaggi della nostra tecnica, l'utilizzo di elementi enhancer di guidare l'espressione condizionale di geni reporter nel pulcino tubo neurale richiede un'attenta valutazione per cella-specificità e la tempistica di espressione dei costrutti enhancer-GFP; introduzione di alcuni elementi enhancer sono stati trovati in il nostro sistema di guidare una espressione non soggetta a restrizioni di GFP nel cervello posteriore, mentre alcunialtri hanno prodotto una espressione non specifica a presto, ma non, fasi del tubo neurale in ritardo (dati non riportati). Inoltre, la nostra strategia non supporta attualmente una espressione temporale-specifica del gene reporter. Pertanto, non siamo in grado di distinguere tra i sottogruppi presto o tardi-nato di DA1 interneuroni, che possono eventualmente progetto diverso tratti assonali per indirizzare le aree cerebellari distinte. Costruzione genetica di strumenti aggiuntivi per passare temporalmente / disattivare l'espressione di GFP in neuroni romboencefalo sarà vantaggioso per seguire con maggiore precisione lo sviluppo delle traiettorie degli assoni e sinapsi nel tronco cerebrale embrionale / adulto. Infine, un inconveniente tecnico della nostra strategia di elettroporazione è l'inaccessibilità di un embrione di questa manipolazione nelle fasi di là E2.75-3, per la sua posizione nell'uovo, vasi sanguigni e membrane avvolgenti. Questa limitazione impedisce la destinazione dei nostri plasmidi in sottotipi aggiuntivi di neuroni romboencefalo che nascono in seguito in fase di sviluppo.