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Neuroscience

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

Published: May 29, 2013 doi: 10.3791/50136

Summary

¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.

Abstract

La electroporación del tubo neural de embriones de pollo tiene muchas ventajas tales como ser rápida y eficiente para la expresión de genes extraños en células neuronales. En este manuscrito se proporciona un método que demuestra cómo única para electroporar ADN en el cerebro posterior aviar en E2.75 con el fin de etiquetar específicamente un subconjunto de células progenitoras neuronales, y cómo seguir sus proyecciones axonales y metas sinápticas en una fase mucho más avanzada de desarrollo, hasta E14.5. Hemos utilizado herramientas genéticas nuevas que incluyen elementos específicos potenciadoras, Cre / Lox - plásmidos basados ​​y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada para dirigir la expresión de GFP en un subtipo de células del cerebro posterior (dorsal más subgrupo de interneuronas, DA1). Trayectorias y objetivos de DA1 axonal axones se siguen en las etapas embrionarias tempranas y tardías en varias regiones del tronco cerebral. Esta estrategia contribuye con técnicas avanzadas para atacar a las células de interés en la parte posterior del cerebro embrionario y de tracing formación circuito en múltiples etapas de desarrollo.

Introduction

El cerebro posterior representa un concentrador relé clave del sistema nervioso mediante la comunicación entre los sistemas nerviosos central y periférico por medio de ascendente y descendente redes neuronales. Regula las funciones básicas como la respiración, la conciencia, el oído y la coordinación motora 1-3. Durante el desarrollo embrionario temprano, la parte posterior del cerebro de vertebrados se subdivide transitoriamente a lo largo de su eje antero-posterior (AP) en rhombomeres repetitivas, en las que se forman distintos tipos de células neuronales y generan múltiples centros de los núcleos del tronco cerebral 4. El cerebro posterior también se divide a lo largo de su eje dorsal-ventral (DV) en una placa basal y alar, en la que los progenitores neuronales discretas se especifican y se diferencian en lugares distintos DV 3,5,6. Como a principios del AP y DV-específicos patrones neuronales se rige el establecimiento de circuitería tronco cerebral funcional es en gran parte desconocida.

Para adquirir conocimientos sobre este fundamentalcuestión, se requieren herramientas para etiquetar subconjuntos específicos de neuronas en el cerebro posterior y principios para trazar su trayectoria axonal y la conectividad en las etapas más avanzadas. Hemos utilizado previamente elementos específicos potenciador, y un sistema de expresión condicional Cre / loxP basada para el seguimiento de la trayectoria axonal de interneuronas espinales dorsales en el embrión de pollo temprano 7-9. En el manuscrito actual se ha centrado en el cerebro posterior y mejorado el paradigma experimental para etiquetar finales interneuronas rombencéfalo embrionarias, axones y sus objetivos sinápticas, mediante una estrategia de electroporación modificado y el PiggyBac - Adaptación de ADN mediada. Nuestra nueva estrategia permite que el etiquetado de los subtipos neuronales distintas en un lado del cerebro posterior y el seguimiento de sus proyecciones axonales y sitios sinápticos en las diversas etapas embrionarias, desde 2 hasta 12 días después de la electroporación. En base a este método, se calificó el dorsal más subgrupo de interneuronas del cerebro posterior (dA1/Atoh1 + 10 proyecto.

La combinación de polluelo de la electroporación, el rastreo genético de las neuronas y el análisis de los sitios de proyección en una fase mucho más avanzadas de desarrollo proporciona una plataforma única para estudiar la formación de redes neuronales en el cerebro y para dilucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la formación de circuito.

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Protocol

1. La electroporación Rombencéfalo

1.1 Manejo de Huevos

  1. Coloque los huevos horizontalmente en un incubador humidificado (37-38.5 ° C). Los embriones son electroporación después de 65-70 horas de incubación, cuando alcanzan 16-17 (HH) etapa (25-30 somitas).
  2. Eliminar los huevos de la incubadora, sino que permanecen en la posición horizontal.

1.2 Preparativos

  1. Tire de capilares de vidrio (0,5 mm de diámetro).
  2. Conectar dobladas en forma de L de oro Genetrodes electrodos (3 mm de diámetro) con un soporte del adaptador para el generador de impulsos. Electroporación parámetros incluyen 25 voltios, 5 números de impulsos, 45 ms de longitud de pulso, los intervalos de 300 ms de pulso.
  3. Preparar una pipeta de boca, 10 ml de aguja de la jeringa, tiras de parafilm, un cepillo suave, unas tijeras de disección afilados y 25 ml de solución de PBS estéril. Esta cantidad es por lo general suficiente para manejar una bandeja de huevos (18 huevos).
  4. Preparar una mezcla adecuada de los plásmidos de ADN (5 g / l cada uno) yañadir alrededor de 0,025% de colorante verde rápido para visualizar la inyección de ADN. Por lo general, un volumen de 4 l es suficiente para la inyección de una bandeja.

1.3 de ventanas, de inyección y electroporación

  1. Limpie las cáscaras de huevo con etanol al 70%.
  2. Manejar un huevo a la vez para minimizar el tiempo de exposición al aire embrionaria.
  3. Hacer un agujero en el polo de huevo con los extremos tijeras y retire 3-4 ml de albúmina con la jeringa. No extraiga la mayor cantidad de albúmina, ya que reduce la viabilidad.
  4. Abra una ventana oval pequeño (2,5 x 2 cm de grosor) en el centro superior de la cáscara de huevo con las tijeras de disección.
  5. Por goteo unas gotas de PBS en la parte superior del embrión para evitar la sequedad durante todo el proceso.
  6. Cargar una pequeña cantidad de la mezcla de ADN en el capilar de vidrio usando una pipeta de boca.
  7. Coloque el embrión con su extremo posterior hacia usted. No se requiere la inyección de tinta en esta etapa el embrión es claramente visible. Evitar el aumento de inyección de tintasupervivencia embrionaria. Penetrar en el cerebro posterior caudal mediante la celebración de los capilares en el ~ 45 °. No retire cualquier membrana de todo el embrión. Inyectar solución de ADN con cuidado en el lumen cerebro posterior y exhalar sin que se formen burbujas de aire. Solución de ADN se extiende hacia delante.
  8. Inmediatamente después de la inyección de ADN, coloque los electrodos paralelos a la AP precisa y DV posición rombencéfalo tu objetivo es orientar la campaña. Empuje los electrodos ligeramente ventralmente sin tocar el corazón, ya que puede reducir la viabilidad. Pulso del electroporador. Los electrodos deben estar cubiertos con burbujas para indicar la conductividad eléctrica (Figura 1A).
  9. Retire con cuidado los electrodos y gotear unas gotas de PBS para enfriar el embrión y para eliminar las burbujas. Selle el orificio correctamente con una tira de parafina para evitar que se sequen durante la incubación de los huevos. Lave los electrodos en PBS con un cepillo suave.
  10. Coloque huevo en la incubadora durante el período de tiempo deseado. La supervivencia de los embriones es de aproximadamente 90% después de 2-3 díaselectroporación, y reduce hasta el 50% 12 días después de la electroporación.

2. Análisis de embriones

2.1 La elaboración del plano de montaje e inmunofluorescencia

  1. Preparaciones plana de montaje de la parte posterior del cerebro se pueden realizar hasta E6.5 para visualizar fácilmente los axones bajo un microscopio o un estereomicroscopio.
  2. Diseccionar el embrión cuidadosamente por lo separa de membranas que rodean y los vasos sanguíneos. Coloque el embrión en una pequeña silicona - placa de Petri recubierto que contiene PBS. Conecte el embrión al plato con alfileres de tungsteno enfrenta dorsal. Realice una hendidura dorsal en el cerebro posterior en el techo placa con fuerte capilares de vidrio.
  3. Con ayuda de pinzas cortantes y micro-tijeras sujetar la parte superior de la cabeza y tirar del tejido de cerebro posterior muy cuidadosamente de rostral a caudal. Después de la separación de la parte posterior del cerebro eliminar los tejidos ventrales restantes para alcanzar una preparación limpia.
  4. Incubar el cerebro posterior con 4% De solución de paraformaldehído (PFA) para 1-2 hr a temperatura ambiente (RT). Lavar el cerebro posterior con PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para eliminar PFA.
  5. Por inmunofluorescencia en hindbrains-montados plana añadir 500 l de solución de bloqueo (5% de suero de cabra en PBT y se incuba durante 2 horas a RT Incubar con 1 pt de anticuerpo ON a 4 ° C. Lavar con PBT (15 min x 3). Incubar con 2 ª anticuerpo durante 2 horas a TA. Lavar con PBT (15 min x 3).
  6. Coloque el cerebro posterior frente dorsalmente en un portaobjetos de vidrio. Añadir medio de montaje fluorescentes en la parte posterior del cerebro. Usa capilares de vidrio o agujas de tungsteno para aplanar la parte posterior del cerebro en la diapositiva.
  7. Añadir pequeña cantidad de grasa en cada esquina para evitar exprimir del tejido por la hoja de la cubierta. Con cuidado, coloque una hoja de cubierta en la parte superior de la parte posterior del cerebro y evitar burbujas de aire. Para añadir la adhesión esmalte de uñas para cubrir los bordes del vidrio.

2.2 Cryo-secciones e inmunofluorescencia

  1. Cryo-secciones del tronco cerebral can llevarse a cabo en cualquier etapa de visualizar las trayectorias axonales. Sin embargo, después de E6.5 este debe ser el método preferido debido a la dificultad para visualizar los axones en el embrión de montaje plana, que se convierte en demasiado grueso. Por otra parte, la demostración de las sinapsis requiere la sección del tejido y una vista de gran aumento bajo un microscopio.
  2. Disección del embrión y eliminar todos los tejidos circundantes. Lavar con PBS. Cortar el embrión en la parte caudal de la médula mediante micro-tijeras y pinzas cortantes. Hacer una amplia incisión entre el cerebelo y el cerebro medio y retirar todo el tronco cerebral. El tejido debe contener el bulbo raquídeo, la protuberancia y el cerebelo.
  3. Fijar el tronco cerebral en PFA al 4% durante toda la noche (ON) a 4 ° C, enjuague con PBS (3 x 10 min), y se incuba con 30% de sacarosa para ON a 4 ° C hasta que se hunde.
  4. Insertar el cerebro posterior en un molde con la crio-compuesto OCT (temperatura óptima de corte), y colocarlo a -20 ° C hasta su congelación, tal como se describe en otro lugar 11.
  5. Secar los portaobjetos. Añadir 100 l de solución de bloqueo en cada portaobjetos durante 2 h a TA. Añadir 100 l de anticuerpos (diluido en la solución de bloqueo a la concentración deseada). El período de incubación de 1 ª y 2 ª anticuerpos está encendido a 4 ° C o 2 horas a temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tiempo de incubación, añadir con cuidado tira de parafina en la parte superior de la corredera para evitar la sequedad. Lavar con PBS (10 min x 3) entre los anticuerpos. Si es necesario, añadir 1:1000 DAPI (4'-6-diamidino-2-fenilindol), diluido en PBS durante 20 min a TA. Lavar con PBS.
  6. Coloque el portaobjetos con medio de montaje fluorescentes. Deje que se seque durante 1 hora antes de su análisis.

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Representative Results

Este protocolo fue utilizado recientemente para descubrir los patrones axonal y sitios de proyección de DA1 subgrupo de interneuronas en el cerebro posterior chica 10. Para etiquetar específicamente estos axones, se confirmó un elemento potenciador (Atoh1), que anteriormente ha sido caracterizado como específico para las neuronas espinales ED1 8,12,13, que se expresa en las células del cerebro posterior 10 DA1. El elemento fue clonado aguas arriba de la recombinasa Cre y co-electroporación en E2.75, junto con un dependiente reportero GFP citoplasmática Cre plásmido (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-CGFP; Figura 1BI). Hindbrains se analizaron 48 horas siguientes electroporación mediante la preparación de montaje plana y revelaron dos patrones de proyección axonal ascendentes contra-laterales (Figura 2A), un tubo se deriva exclusivamente de DA1 neuronas localizadas en rhombomeres 6-7 que alarga en un funículo dorsal, mientras que el otros se originó a partir rhombomeres 2-5 y extendidos en un cordón lateral.

14,15. Cre-condicional-myristoylated-GFP (mGFP) Casete Un periodista, clonado entre los dos brazos PB (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), se sometió a electroporación en E2.75 junto con el Atoh1 :: Cre potenciador y el vector de transposasa (CAG :: PBASE). En esta estrategia, la mGFP Cre-condicional electroporación se integra en los cromosomas de pollo y por lo tanto el casete de PARADA se elimina sólo en DA1 las neuronas, lo que permite prolongada expresión de GFP en células DA1 (Figura 1BII; 10). La forma miristoilada de las correas GFP a la membrana de tal manera que se localiza a lo largo de la membrana axonal en lugar de ser diluido en el citoplasma. Brainstems se recogieron en E13.5 y se analizaron en las secciones sagitales (Figura 2B). Se encontraron DA1 axones a acumularse en el cerebelo y para extenderse hacia el gr externa capa anular (EGL), que se caracteriza por células Zic1 +.

También se analizaron los objetivos sinápticas de los axones DA1 en el cerebelo. E2.75 embriones fueron electroporated con la proteína de la vesícula sináptica 2 (SV2)-GFP plásmido reportero 16,17, junto con Atoh1 :: Cre potenciador y el PB transposasa (Figura 1BIII). Este método permite la expresión del reportero de GFP en las vesículas presinápticas de DA1 extremos axonales. El cerebelo se seccionó en E13.5 y teñidas con el marcador de pre-sináptica general de sinaptotagmina 18,19, así como con calbindina que las etiquetas de la capa de Purkinje (Figuras 3A, 3B). SV2-GFP + se detectaron vesículas sinápticas en múltiples regiones del cerebelo, incluyendo la capa de Purkinje, lo que indica las conexiones sinápticas de DA1 interneuronas en el cerebelo del cerebro posterior.

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Figura 1 (A) Ilustración de la técnica de electroporación en E2.75 polluelo cerebro posterior (B) Esquema de los plásmidos utilizados para etiquetar condicionalmente rombencéfalo DA1 interneuronas; (I):.. Construcciones incluyen el elemento potenciador de Atoh1 clonado aguas arriba a Cre-recombinasa ADNc y un plásmido reportero condicional, en el que se inserta un casete de terminación de la transcripción entre el CAGG potenciador / módulo promotor y el gen GFP citoplasmática (CGFP). La expresión condicional de GFP en las neuronas DA1 está impulsado por Atoh1 :: Cre (II):. El método de transposición PiggyBac para etiquetar constitutivamente células del cerebro posterior. Las construcciones incluyen el potenciador Atoh1 :: Cre plásmido, un reportero de cassette Cre-condicional, en la que GFP miristoilada (mGFP) se clona entre los dos brazos PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), y un plásmido Pbase transposasa. Lala integración de la casete del reportero en el genoma de las neuronas DA1 es impulsado por el CAG :: PBASE y Atoh1 :: vectores de Cre. (III): Un método de transposición PiggyBac similar a etiquetar objetivos sinápticas de interneuronas del cerebro posterior. El plásmido reportero Cre-condicional incluye una sináptica SV2-GFP flanqueado entre dos brazos PB (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Trayectorias axonal de DA1 interneuronas (A): A. Preparación de montaje plana de E4.5 cerebro posterior demuestra dos ascendentes DA1 tractos axonales (verde, flechas). El neurofillament marcador 3A10 (rojo) se utiliza para marcar las fronteras rhombomere. (B) Un sagitalsección del cerebelo de embrión E13.5 demuestra DA1 axones (verde) que se acumulan en el cerebelo. Las células se etiquetan con EGL Zic1 (rojo). EGL, la capa granular externa, barra de escala está marcada.

Figura 3
Figura 3. Objetivos sinápticas de DA1 interneuronas (A):. Una sección sagital del cerebelo E13.5 teñidas con Calbindin (rosa) hasta la marca de Purkinje y capa de DAPI (azul) a los núcleos etiqueta. (B). Una vista más ampliada de la zona marcada en A. SV2-GFP etiquetados DA1 sinapsis (verde) se muestran en la capa de Purkinje del cerebelo (rosa). El pre-sináptica marcador sinaptotagmina general (rojo) es co-expresada con + sinapsis SV2-GFP (amarillo, flechas). Calb, Calbindin, S-Tag, sinaptotagmina. Las barras de escala están marcados.

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Discussion

En electroporación in ovo es una herramienta viable, fiable y eficaz para examinar especificación de las células y la guía axonal durante el desarrollo del sistema nervioso polluelo 20. En este protocolo se describe un modo de electroporación en el cerebro posterior chica en E2.75 utilizando elementos potenciadores que permiten el etiquetado condicional de interneuronas específicos. Esta estrategia se combina con el sistema de transposición mediada por PiggyBac para insertar genes extraños en el genoma de pollo, lo que permite el seguimiento de rutas, proyecciones axonales y sitios sinápticos en las etapas avanzadas de la embriogénesis.

Los métodos anteriores a los axones / sinapsis etiqueta en la parte posterior del cerebro chick incluyen tinte retrógrada o anterógrada clásica etiquetado o el injerto experimentos 21-23. Estos estudios contribuyeron hallazgos significativos en cerebro posterior ascenso y descenso tractos axonales. Sin embargo, algunas trayectorias y proyecciones fueron pasados ​​por alto por estos enfoques celulares. En adic ion, las identidades moleculares de los subgrupos de neuronas que se proyectan en el funiculi informado no podían ser revelados. Nuestro método combinado de electroporación y sostenido genética rastreo proporciona la capacidad única de seguir el desarrollo de las neuronas del cerebro posterior seleccionados de sus etapas de especificación para la navegación axonal y objetivos de proyección 10. En particular, nuestro enfoque se aplicó anteriormente para trazar las trayectorias axonal de las interneuronas espinales dorsales de la médula por períodos más cortos de tiempo 8,9.

Las herramientas descritas también pueden servir para descubrir los mecanismos moleculares que rigen las proyecciones axonales; códigos genéticos (tales como el código de dominio homeo-Lim) se modifican selectivamente en un determinado subgrupo neuronal utilizando el enfoque enhancer-Cre/Lox-based y el impacto de crecimiento axonal y la conectividad fue seguido 8,10. Por lo tanto, este protocolo puede ser útil no sólo para el marcaje de las células, sino también para manipulaciones genéticas en las células deseadas.

ve_content "> Uno de los beneficios de la electroporación in ovo como un método de entrega de genes es la rapidez de expresión, que se observa ya a menos de 3 horas después de la electroporación 24. Sin embargo, la expresión transitoria de los genes introducidos se desvanece de distancia con divisiones celulares en el desarrollo posterior etapas. Para anular esta limitación se hizo uso del método de transposición PiggyBac en la inserción de genes ovo. Esta herramienta permite el seguimiento de los axones y las sinapsis de manera robusta para una fase mucho más avanzados después de la electroporación, en comparación con los métodos anteriores. Como pudimos detectar fácilmente etiquetado neuronas hasta 12 días después de la electroporación (E14.5), es muy plausible para utilizar este enfoque incluso por períodos de tiempo más largos, incluyendo después de la eclosión.

Otro de los beneficios de los polluelos del tubo neural relés electroporación en la orientación unilateral de las células en un modales restringidas espaciales y temporales. Esto permite trazar trayectorias axonal en bOTH lados del cerebro posterior en una base etapa por etapa, que es más difícil de seguir en los mamíferos. Esto es sobre todo debido a la línea germinal de los resultados de transgénesis en el etiquetado de las células deseadas en ambos lados del tubo neural, lo que complica la capacidad de rastrear proyecciones unilaterales y separar entre el origen del IPSI y tractos axonales contra-lateral. En última instancia, basado en el alto grado de homología entre ratones y chick tronco cerebral neuronas 3,5, nuestra técnica ofrece una poderosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre el montaje de los cables y las neuronas en el cerebro posterior desarrollo de vertebrados.

Aunque las ventajas de nuestra técnica, el uso de elementos potenciadores para conducir la expresión condicional de genes informadores en el pollo tubo neural requiere una cuidadosa evaluación para la célula-especificidad y el momento de expresión de las construcciones potenciador-GFP; introducción de algunos elementos potenciadores se encontraron en nuestro sistema para conducir una expresión no restringida de GFP en la parte posterior del cerebro, mientras que unos pocosotros produjeron una expresión no específica en temprano, pero no del tubo neural, las etapas finales de los años (datos no mostrados). Por otra parte, nuestra estrategia no admite una expresión temporal específica del gen reportero. Por lo tanto, no podemos distinguir entre los subgrupos temprano o más tarde, nacido de DA1 interneuronas, que posiblemente pueden proyectar diferentes tractos axonales para apuntar a áreas del cerebelo distintas. Construcción genética de herramientas adicionales para cambiar temporalmente de encendido / apagado de la expresión de GFP en las neuronas del cerebro posterior será beneficioso para seguir con mayor precisión el desarrollo de trayectorias axonales y sinapsis en el tronco cerebral embrionario / adulto. Por último, un inconveniente técnico de nuestra estrategia de electroporación es la inaccesibilidad del embrión a esta manipulación en las etapas más allá de E2.75-3, debido a su posición en el huevo, los vasos sanguíneos y las membranas envolventes. Esta limitación impide que la orientación de nuestros plásmidos en subtipos adicionales de las neuronas del cerebro posterior que nacen más tarde en el desarrollo.

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Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

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References

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Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

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