Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Published: May 29, 2013 doi: 10.3791/50136
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.

Abstract

Electroporation من الفرخ الجنينية الأنبوب العصبي لديه العديد من المزايا مثل أن تكون سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الغريبة إلى خلايا العصبية. في هذا المخطوط ونحن نقدم الأسلوب الذي يوضح كيف فريد ل electroporate DNA في الدماغ المؤخر الطيور في E2.75 من أجل تسمية على وجه التحديد مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الأسلاف، وكيفية متابعة اسقاطاتها محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل متقدمة بكثير من التنمية، حتى E14.5. لقد استخدمت الأدوات الوراثية الرواية بما في ذلك عناصر محددة محسن، لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن - البلازميدات مقرها ونظام تبديل الحمض النووي PiggyBac بوساطة لدفع التعبير GFP في نوع فرعي من خلايا الدماغ المؤخر (الظهرية معظم فرعية من interneurons، DA1). يتم اتباع مسارات وأهداف DA1 المحاور محور عصبي في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة في مناطق الدماغ المختلفة. تساهم هذه الاستراتيجية التقنيات المتقدمة لاستهداف خلايا من الفائدة في الدماغ المؤخر الجنينية ولهيئة تنظيم الاتصالاتالوراثة تشكيل الدوائر في مراحل متعددة من التنمية.

Introduction

الدماغ المؤخر يمثل محور التتابع مفتاح في الجهاز العصبي من خلال التواصل بين الجهاز العصبي المركزي والمحيطي عبر الصعود والنزول الشبكات العصبية. وينظم الوظائف الأساسية بما في ذلك التنفس، والوعي، والسمع، والحركية التنسيق 1-3. أثناء التطور الجنيني المبكر، وينقسم الدماغ المؤخر الفقاريات عابر على طول لها الأمامي الخلفي (AP) في محور rhombomeres المتكررة، التي تتشكل أنواع الخلايا العصبية متميزة ومتعددة المراكز توليد نوى الدماغ 4. وينقسم الدماغ المؤخر أيضا جنبا إلى جنب في الظهري البطني (DV) محور في لوحة القاعدية والجناحية، الذي الأسلاف العصبية المنفصلة تصبح المحدد وتفرق في مواقع متميزة DV 3،5،6. كيف أوائل AP وDV-محددة أنماط الخلايا العصبية هي التي تنظم إنشاء circuitries الدماغ وظيفية غير معروف إلى حد كبير.

لاكتساب المعرفة الأساسية في هذاالسؤال، هناك حاجة إلى أدوات من أجل تسمية مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر المبكر وتتبع مساراتها محور عصبي والاتصال في مراحل أكثر تقدما. لقد استخدمت سابقا محسن عناصر محددة، ونظام التعبير الشرطي لجنة المساواة العرقية / المستندة إلى LoxP لتتبع مسار محور عصبي من interneurons العمود الفقري الظهري في جنين الفرخ المبكر 7-9. في المخطوطة الحالية قمنا استهدفت الدماغ المؤخر وترقية النموذج التجريبي لوصفها في وقت متأخر interneurons الدماغ المؤخر الجنينية، محاور عصبية وأهدافهم متشابك، وذلك باستخدام استراتيجية electroporation تعديل وPiggyBac - تبديل الحمض النووي بوساطة. يسمح لدينا استراتيجية جديدة لوضع علامات على أنواع فرعية متميزة العصبية في جانب واحد من الدماغ المؤخر وتتبع اسقاطاتها محور عصبي ومواقع متشابك في مختلف المراحل الجنينية، في الفترة من 2 إلى 12 يوما التالية electroporation. وبناء على هذه الطريقة، ونحن وصفت الظهري معظم فرعية من interneurons الدماغ المؤخر (dA1/Atoh1 + 10.

مزيج من فرخ electroporation، تتبع الوراثية من الخلايا العصبية وتحليل مواقع الإسقاط في مراحل متقدمة بكثير من التنمية توفر منصة فريدة لدراسة تشكيل شبكات الخلايا العصبية في الدماغ وإلى توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في تشكيل الدوائر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporation الدماغ المؤخر

1.1 التعامل مع البيض

  1. وضع البيض أفقيا في حاضنة ترطيب (37-38،5 درجة مئوية). يتم electroporated الأجنة بعد 65-70 ساعة من الحضانة، عندما تصل إلى 16-17 (HH) مرحلة (25-30 somites).
  2. إزالة البيض من الحاضنة، بل البقاء في وضع أفقي.

1.2 التحضيرات

  1. سحب الزجاج الشعيرات الدموية (0.5 مم).
  2. ربط عازمة Genetrodes الذهب على شكل L أقطاب (3 مم) مع حامل محول لمولد النبض. وتشمل المعلمات Electroporation 25 فولت، 5 أرقام النبض، 45 ميللي ثانية النبض طول، 300 ميللي ثانية فترات النبض.
  3. إعداد ماصة الفم، 10 مل إبرة حقنة، شرائط parafilm، فرشاة ناعمة، ومقص تشريح حادة و 25 مل من محلول PBS العقيمة. هذا المبلغ يكفي عادة للتعامل مع علبة البيض (18 بيضة).
  4. إعداد خليط كافية من البلازميدات الحمض النووي (5 ميكروغرام / ميكرولتر لكل منهما) وإضافة حوالي 0.025٪ سريع الصبغة الخضراء لتصور حقن الحمض النووي. عادة ما يكون حجم 4 ميكرولتر كافية لحقن صينية.

1.3 النوافذ، حقن و Electroporation

  1. تنظيف قشر البيض مع الايثانول 70٪.
  2. التعامل مع بيضة واحدة في وقت واحد لتقليل الجنينية وقت التعرض للهواء.
  3. جعل ثقب في القطب البيض مع نهايات مقص وإزالة مل 3-4 من الألبومين مع الحقنة. لا تقم بإزالة كمية أكبر من الألبومين كما أنه يقلل من قدرتها على البقاء.
  4. فتح نافذة صغيرة بيضاوية (2.5 × 2 سم حجم) في مركز العليا من قشرة البيضة باستخدام مقص تشريح.
  5. بالتنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني على رأس الجنين لمنع جفاف خلال العملية برمتها.
  6. تحميل كمية صغيرة من الخليط الحمض النووي في الزجاج الشعرية باستخدام ماصة الفم.
  7. وضع الجنين مع نهاية الخلفي نحو لك. لا يلزم حقن الحبر في هذه المرحلة، ذلك لأن الجنين غير واضحة للعيان. تجنب الزيادات حقن الحبرالبقاء على قيد الحياة الجنينية. اختراق الدماغ المؤخر الذيلية من خلال عقد الشعرية في ~ 45 درجة. لا تقم بإزالة أي غشاء من حول الجنين. حقن محلول الحمض النووي بعناية في تجويف الدماغ المؤخر والزفير دون تشكيل فقاعات الهواء. حل الحمض النووي ينتشر الأمامية.
  8. مباشرة بعد حقن الحمض النووي، ووضع الأقطاب المتوازية دقيق عند AP وموقف الدماغ المؤخر DV كنت تهدف لاستهداف. دفع أقطاب البطني قليلا دون لمس قلب، لأنه قد يقلل من قدرتها على البقاء. نبض electroporator. يجب تغطية الأقطاب مع فقاعات للإشارة إلى الموصلية الكهربائية (الشكل 1A).
  9. إزالة بعناية الأقطاب وبالتنقيط بضع قطرات من برنامج تلفزيوني لتبريد الجنين وإزالة الفقاعات. ختم البيض فتح بشكل صحيح مع قطاع parafilm لمنع جفاف أثناء الحضانة. غسل أقطاب في برنامج تلفزيوني مع فرشاة ناعمة.
  10. وضع البيض في الحاضنة لمدة من الوقت المطلوب. بقاء الأجنة ما يقرب من 90٪ بعد 2-3 أيامelectroporation، ويقلل ما يصل الى 50٪ 12 أيام التالية electroporation.

2. تحليل الأجنة

2.1 شقة جبل إعداد والمناعي

  1. الاستعدادات مسطحة جبل من الدماغ المؤخر لا يمكن أن يؤديها حتى E6.5 لتصور محاور بسهولة تحت المجهر أو ستيريو المجهر.
  2. تشريح الجنين بعناية من قبل فصله من الأغشية المحيطة والأوعية الدموية. وضع الجنين في سيليكون صغيرة - المغلفة طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. نعلق الجنين إلى الطبق مع دبابيس التنغستن تواجه ظهريا. إجراء شق ظهري في الدماغ المؤخر سقف لوحة باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية الحادة.
  3. باستخدام الملقط حادة والمقص الصغير يعقد الجزء العلوي من الرأس وسحب الأنسجة الدماغ المؤخر بعناية فائقة من منقاري إلى الذيلية. بعد فصل الدماغ المؤخر إزالة الأنسجة بطني المتبقية للتوصل إلى إعداد نظيفة.
  4. احتضان الدماغ المؤخر مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل للموارد البشرية 1-2 في درجة حرارة الغرفة (RT). غسل الدماغ المؤخر مع PBT (PBS/0.1٪ تريتون X-100) لإزالة PFA.
  5. لالمناعي في hindbrains محمولة على شقة إضافة 500 ميكرولتر من عرقلة الحل (5٪ من مصل الماعز في PBT واحتضان لمدة 2 ساعة على RT احتضان مع الأجسام المضادة 1 شارع ON في 4 درجات مئوية. غسل مع PBT (15 دقيقة × 3). احتضان مع 2 الأجسام المضادة الثانية لمدة 2 ساعة على RT. يغسل مع PBT (15 دقيقة × 3).
  6. وضع الدماغ المؤخر تواجه ظهريا على شريحة زجاجية. إضافة وسائط الفلورسنت تصاعد على الدماغ المؤخر. استخدام الزجاج الشعيرات الدموية أو الإبر التنغستن لشد الدماغ المؤخر على الشريحة.
  7. إضافة كمية صغيرة من الشحوم في كل زاوية لمنع الضغط من الأنسجة من قبل انزلاق الغطاء. وضع بعناية زلة تغطية على الجزء العلوي من الدماغ المؤخر وتجنب فقاعات الهواء. لتمسك إضافة طلاء الأظافر لتغطية حواف الزجاج.

2.2 البرد أقسام والمناعي

  1. البرد أجزاء من الدماغ CAغير أن يؤديها في أي مرحلة لتصور مسارات محور عصبي. حتى الآن، بعد E6.5 هذا ينبغي أن يكون الأسلوب المفضل نظرا لصعوبة تصور محاور عصبية في الجنين محمولة على شقة، والتي تصبح سميكة جدا. وعلاوة على ذلك، مظاهرة من نقاط الاشتباك العصبي يتطلب باجتزاء الأنسجة والرؤية تضخم عالية تحت المجهر.
  2. تشريح الجنين وإزالة جميع الأنسجة المحيطة بها. شطف مع برنامج تلفزيوني. قطع الجنين في الجزء الذيلية من النخاع باستخدام مقص الصغرى وملاقط حاد. جعل شق واسع بين المخيخ والدماغ المتوسط ​​وإزالة الدماغ بأكمله. يجب أن يحتوي على أنسجة النخاع، بونز والمخيخ.
  3. إصلاح الدماغ في 4٪ PFA ليلة وضحاها (ON) في 4 درجات مئوية، وشطف مع برنامج تلفزيوني (10 دقيقة × 3)، واحتضان مع 30٪ سكروز لON في 4 درجات مئوية حتى الغرق.
  4. تضمين الدماغ المؤخر في البرد القالب مع أكتوبر مركب (درجة الحرارة المثلى للقطع)، ووضعه في -20 درجة مئوية حتى تجميد، كما هو موضح في مكان آخر 11.
  5. تجفيف الشرائح. إضافة 100 ميكرولتر حل حظر على كل شريحة لمدة 2 ساعة على RT. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة (مخففة في عرقلة الحل للتركيز المطلوب). فترة الحضانة لمدة 1 و 2 ش الأجسام المضادة الثاني هو ON عند 4 درجة مئوية أو 2 ساعة على RT، على التوالي. في كل مرة الحضانة، إضافة بلطف قطاع parafilm على رأس الشريحة لمنع جفاف. يغسل مع برنامج تلفزيوني (10 دقيقة × 3) بين الأجسام المضادة. إذا لزم الأمر، إضافة 1:1،000 دابي (4'-6-Diamidino-2-phenylindole)، مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT. شطف مع برنامج تلفزيوني.
  6. تركيب الشريحة مع وسائل الاعلام الفلورسنت في تصاعد مستمر. اسمحوا الجافة لمدة 1 ساعة قبل التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا للكشف عن أنماط محور عصبي ومواقع الإسقاط من DA1 فرعية من interneurons في الدماغ المؤخر كتكوت 10. لتسمية تحديدا هذه المحاور، تم تأكيد عنصر محسن (Atoh1)، الذي سبق وصفها بأنها محددة لالشوكي الخلايا العصبية DI1 8،12،13، أن أعرب في الدماغ المؤخر DA1 الخلايا 10. تم استنساخ عنصر المنبع لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور، وشارك في electroporated في E2.75 جنبا إلى جنب مع لجنة المساواة العرقية تعتمد مراسل GFP البلازميد حشوية (pCAGG-LoxP-وقف LoxP-cGFP؛ الشكل 1BI). وقد تم تحليل Hindbrains 48 ساعة التالية electroporation بواسطة إعداد مسطحة جبل وكشف اثنين مضاد الوحشي أنماط الإسقاط محور عصبي تصاعدي (الشكل 2A)؛ وقد اشتق المسالك واحد حصرا من DA1 الخلايا العصبية الموجودة في rhombomeres 6-7 أن ممدود في الحبلة الظهرية، في حين أن أخرى نشأت من rhombomeres 2-5 والموسعة في الحبلة الجانبية.

"jove_content"> لتعيين التوقعات محور عصبي من DA1 interneurons في مراحل لاحقة من التطور، تم تطبيق طريقة تبديل PiggyBac 14،15. تم electroporated مراسل جنة المساواة العرقية، مشروط-myristoylated-GFP (mGFP) كاسيت، المستنسخة بين اثنين من الأسلحة PB (PB-CAG-LoxP وقفة وLoxP-mGFP-PB)، في E2.75 جنبا إلى جنب مع Atoh1 :: لجنة المساواة العرقية محسن وtransposase ناقلات (CAG :: PBase). في هذه الاستراتيجية، تم دمج electroporated mGFP جنة المساواة العرقية، مشروط في الكروموسومات الفرخ، وبالتالي تتم إزالة كاسيت المحطة الوحيدة في DA1 الخلايا العصبية، وتمكين التعبير لفترات طويلة من GFP في DA1 الخلايا (الشكل 1BII؛ 10). شكل myristoylated من الحبال GFP إلى غشاء بحيث يكون موضعيا على طول الغشاء محور عصبي بدلا من أن تضعف في السيتوبلازم. تم جمع Brainstems في E13.5 وتحليلها في أقسام السهمي (الشكل 2B). تم العثور على DA1 محاور عصبية لتتراكم في المخيخ وتمتد نحو غرام الخارجية طبقة anular (EGL)، التي وضعت من قبل خلايا + Zic1.

وتم أيضا تحليل الأهداف متشابك من DA1 محاور عصبية في المخيخ. و electroporated E2.75 الأجنة مع متشابك بروتين حويصلة 2 (SV2)-GFP البلازميد مراسل 16،17، جنبا إلى جنب مع Atoh1 :: لجنة المساواة العرقية محسن وPB transposase (الشكل 1BIII). هذه الطريقة تمكن من التعبير عن GFP مراسل في الحويصلات قبل المشبكي من DA1 مصطلحات محور عصبي. كان المخيخ مقطوع في E13.5 وملطخة العام علامة ما قبل متشابك synaptotagmin 18،19، وكذلك مع calbindin أن تصف طبقة العصبية (أرقام 3A، 3B). SV2-GFP + تم الكشف عن حويصلات متشابك في مناطق متعددة المخيخ، بما في ذلك طبقة العصبية، مما يدل على اتصالات متشابك من DA1 interneurons الدماغ المؤخر في المخيخ.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
الشكل 1 (أ) رسم توضيحي للتقنية electroporation في E2.75 الدماغ المؤخر كتكوت (B) مخطط البلازميدات المستخدمة لتسمية مشروط الدماغ المؤخر DA1 interneurons؛ (I): وتشمل يبني محسن عنصر Atoh1 المستنسخة المنبع لجنة المساواة العرقية، recombinase البكتيري المحور [كدنا] ومراسل البلازميد مشروطة، والتي يتم إدراج شريط كاسيت إيقاف النسخي بين CAGG محسن / وحدة المروج والجين GFP حشوية (cGFP). هو الدافع وراء التعبير الشرطي من GFP في DA1 الخلايا العصبية بواسطة Atoh1 :: لجنة المساواة العرقية (II): طريقة تبديل PiggyBac لتسمية خلايا الدماغ المؤخر جوهري. وتشمل يبني Atoh1 :: لجنة المساواة العرقية محسن البلازميد، شريط كاسيت مراسل جنة المساواة العرقية، الشرطي، الذي يتم استنساخ GFP myristoylated (mGFP) بين اثنين من الأسلحة PB (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB)، وtransposase Pbase البلازميد. الهو الدافع والتكامل من الكاسيت مراسل في جينوم الخلايا العصبية DA1 من قبل CAG :: PBase وAtoh1 :: ناقلات لجنة المساواة العرقية. (III): أسلوب تبديل PiggyBac مماثلة لتسمية الأهداف متشابك من interneurons الدماغ المؤخر. مراسل جنة المساواة العرقية، مشروط البلازميد يتضمن متشابك SV2-GFP يحيط بين اثنين من الأسلحة PB (PB-LoxP وقفة وLoxP-SV2-GFP-PB). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. مسارات محور عصبي من DA1 interneurons (A): A إعداد محمولة على شقة من E4.5 الدماغ المؤخر يوضح اثنين تصاعدي DA1 مساحات محور عصبي (الأخضر والسهام). يتم استخدام neurofillament 3A10 علامة (الحمراء) للاحتفال الحدود قسيم معيني. (ب) السهميقسم من المخيخ من E13.5 الجنين يوضح DA1 محاور عصبية (الأخضر) تتراكم في المخيخ. وصفت الخلايا EGL مع Zic1 (الحمراء). EGL، الطبقة الحبيبية الخارجية، يتم وضع علامة شريط مقياس.

الشكل (3)
الشكل (3). أهداف متشابك من DA1 interneurons (A): A مقطع سهمي من E13.5 الملون المخيخ مع Calbindin (الوردي) إلى علامة العصبية طبقة ودابي (الأزرق) لنواة التسمية. (B). منظر التكبير أعلى من منطقة ملحوظ في A. SV2-GFP المسمى ترد DA1 نقاط الاشتباك العصبي (الأخضر) في الطبقة العصبية في المخيخ (وردي). ما قبل متشابك synaptotagmin علامة العامة (الحمراء) ويشترك في أعربت مع SV2-GFP + نقاط الاشتباك العصبي (الأصفر والسهام). Calb، Calbindin؛ S-الدلالية، synaptotagmin. يتم وضع علامة على نطاق والحانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

electroporation في البيضة هو أداة مجدية وموثوقة، وفعالة لفحص مواصفات الخلية والتوجيه محور عصبي خلال كتكوت تطوير الجهاز العصبي 20. في هذا البروتوكول ونحن تصف طريقة electroporation في الدماغ المؤخر فرخ في E2.75 باستخدام عناصر محسن التي تمكن من وضع العلامات الشرطية interneurons محددة. يتم الجمع بين هذه الاستراتيجية مع نظام تبديل PiggyBac بوساطة لادخال الجينات الغريبة في جينوم الفرخ، والتي تمكن من تتبع المسارات محور عصبي، والإسقاطات ومواقع متشابك في مراحل متقدمة من التطور الجنيني.

وشملت الأساليب السابقة إلى محاور التسمية / نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ المؤخر كتكوت الكلاسيكية صبغ الوراء أو تقدمي وضع العلامات أو ترقيع التجارب 21-23. ساهمت هذه الدراسات نتائج هامة على الدماغ المؤخر الصعود والنزول مساحات محور عصبي. ومع ذلك، تم التغاضي عن بعض المسارات والتوقعات من قبل هذه النهج الخلوية. في الخا أيون، لا يمكن كشف الهويات الجزيئية لمجموعات فرعية من الخلايا العصبية التي يتوقع في الحبل عنها. لدينا طريقة مجتمعة electroporation وأصيب تتبع الوراثية يوفر قدرة فريدة على متابعة تطور الخلايا العصبية الدماغ المؤخر مختارة من مراحل مواصفات الخاصة بهم إلى التصفح المحاور والأهداف الإسقاط 10. والجدير بالذكر، كان نهجنا المطبقة سابقا لتتبع مسارات محور عصبي من العمود الفقري الظهري interneurons الحبل لفترات أقصر من الوقت 8،9.

يمكن للأدوات صفها أيضا تعمل على كشف الآليات الجزيئية التي تتحكم التوقعات محور عصبي؛ الشفرات الوراثية (مثل قانون التماثل مجال ليم) تم تعديل انتقائي في بعض فرعية الخلايا العصبية باستخدام نهج enhancer-Cre/Lox-based وأثر النمو محور عصبي وأعقب اتصال 8،10. وبالتالي، قد يكون هذا البروتوكول يست فقط مفيدة لوضع العلامات الخلية ولكن أيضا للتلاعب الجيني على الخلايا المطلوب.

ve_content "> واحدة من الفوائد من electroporation باعتبارها البيضة في طريقة توصيل الجينات هي سرعة التعبير، والذي لوحظ بالفعل خلال 3 ساعة التالية electroporation 24. ومع ذلك، فإن التعبير عابر يتلاشى الجين قدم بعيدا مع انقسامات الخلية في وقت لاحق التنموية مراحل. لتجاوز هذا القيد التي قطعناها على أنفسنا استخدام طريقة تبديل PiggyBac لفي البيضة الإدراج الجينات. هذه الأداة تمكن من تتبع محاور ونقاط الاشتباك العصبي بطريقة قوية لمراحل متقدمة كثيرا بعد electroporation، مقارنة مع الطرق السابقة. كما أننا يمكن أن تكشف بسهولة وصفت الخلايا العصبية تصل إلى 12 يوما التالية electroporation (E14.5)، فمن المعقول للغاية لاستخدام هذا النهج حتى لفترات أطول من الوقت، بما في ذلك بعد الفقس.

فائدة أخرى من فرخ العصبية التبديلات electroporation أنبوب على الاستهداف من جانب واحد من الخلايا في المكانية والزمانية الخلق المقيدة. وهذا يسمح تتبع مسارات محور عصبي على Bأوراسكوم تليكوم القابضة الجانبين من الدماغ المؤخر في أساس مرحلة تلو مرحلة، والتي هي أصعب لمتابعة في الثدييات. هذا هو في الغالب بسبب جرثومة سطر نتائج نقل الجينات في توسيم الخلايا المطلوب في كلا الجانبين الأنبوب العصبي، تعقيد القدرة على تتبع التوقعات من جانب واحد وفصل بين أصل IPSI ومساحات محور عصبي مضاد الوحشي. في نهاية المطاف، استنادا إلى درجة عالية من التماثل بين الفئران وفرخ الدماغ الخلايا العصبية 3،5، أسلوبنا يوفر أداة قوية لاكتساب المعرفة الجديدة على تجميع الأسلاك والخلايا العصبية في الدماغ المؤخر الفقاريات النامية.

ولو مزايا تقنية لدينا، واستخدام عناصر محسن لدفع التعبير الشرطي من الجينات مراسل في فرخ الأنبوب العصبي يتطلب إجراء تقييم دقيق للخلية خصوصية وتوقيت التعبير عن بنيات محسن-GFP؛ تم العثور على إدخال بعض العناصر محسن في النظام لدينا على قيادة التعبير غير المقيدة من GFP في الدماغ المؤخر، في حين أن عدد قليلأسفرت الآخرين تعبير غير محددة في وقت مبكر، ولكن ليس في وقت متأخر، مراحل الأنبوب العصبي (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، لا يدعم استراتيجيتنا حاليا تعبير الزمنية محددة من الجين المراسل. وبالتالي، لا يمكننا التمييز بين المجموعات الفرعية في وقت مبكر أو في وقت لاحق المولد من DA1 interneurons، والتي قد توقع ربما مساحات محور عصبي مختلفة لاستهداف مناطق المخيخ متميزة. سوف البناء الجيني للأدوات إضافية للتبديل مؤقتا على / قبالة التعبير عن GFP في الخلايا العصبية الدماغ المؤخر تكون مفيدة لمتابعة أدق لتطوير مسارات محور عصبي ونقاط الاشتباك العصبي في الدماغ الجنينية / الكبار. أخيرا، العيب التقني من استراتيجية electroporation لدينا هو عدم إمكانية الوصول إلى الجنين إلى هذا التلاعب في مراحل ما بعد E2.75-3، نظرا لموقعها في البيض، والأوعية الدموية والأغشية. هذا القيد يمنع استهداف البلازميدات لدينا إلى أنماط فرعية إضافية من الخلايا العصبية الدماغ المؤخر الذي يولدون في وقت لاحق في عملية التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Tags

علم الأعصاب، العدد 75، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأحياء التطوري، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الوراثة، Electroporation، الفرخ، الدماغ المؤخر، اكسون، عصبون، DA1، PiggyBac، محسن، المشبك، الخلايا العصبية، محاور عصبية، GFP التعبير،
Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A.,… More

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter