Elektroporation af baghjerne at spore axonale baner og Synaptic Mål i Chick Embryo

Summary

Hvor neuronale netværk er etableret i embryonale hjernen er et grundlæggende spørgsmål i udviklingspsykologi neurobiologi. Her har vi kombineret en elektroporation teknik med nye genetiske værktøjer, såsom Cre / Lox-plasmider og PiggyBac-medieret DNA gennemførelse system i aviær baghjerne at mærke dorsale interneuroner og spore deres axonale fremskrivninger og synaptiske mål på forskellige udviklingsstadier.

Abstract

Elektroporation af kylling embryonale neuralrøret har mange fordele, såsom at være hurtig og effektiv for ekspressionen af ​​fremmede gener i neuronale celler. I dette manuskript giver vi en metode, der viser entydigt, hvordan man elektroporere DNA i aviær baghjerne på E2.75 for at specifikt mærke en delmængde af neuronale stamceller og hvordan man følge deres axonale fremskrivninger og synaptiske mål til meget fremskredne stadier af udvikling, op til E14.5. Vi har udnyttet nye genetiske værktøjer, herunder specifikke enhancerelementer, Cre / Lox - baserede plasmider og PiggyBac-medieret DNA gennemførelse system til at drive GFP udtryk i en undertype af baghjernen celler (dorsale mest undergruppe af interneuroner, DA1). Axonale baner og mål for DA1 axoner følges på tidlige og sene embryonale stadier på forskellige hjernestammen regioner. Denne strategi bidrager avancerede teknikker til at målrette celler af interesse i den embryonale baghjerne og trasiering kredsløb dannelse på flere stadier af udvikling.

Introduction

Baghjerne repræsenterer en vigtig relay hub af nervesystemet ved at kommunikere mellem de centrale og perifere nervesystem via stigende og faldende neuronale netværk. Det regulerer de grundlæggende funktioner, herunder respiration, bevidsthed, hørelse og motorik ^1-3. I den tidlige fosterudvikling, er hvirveldyr baghjerne forbigående opdelt langs dens anterior-posterior (AP) akse i gentagne rhombomeres, hvor distinkte neuronale celletyper dannes og generere flere hjernestammen kerner centre ^4.. Baghjerne er også opdelt langs dens ryg-ventrale (DV) akse i et basal og Alar plade, hvor diskrete neuronale forfædre bliver specificeret og differentiere forskellige DV steder ^3,5,6. Hvordan den tidlige AP og DV-specifikke neuronale mønstre for oprettelse af funktionelle hjernestammen circuitries er stort set ukendt.

At få viden om denne grundlæggendeSpørgsmålet er værktøjer der kræves for at mærke specifikke delmængder af neuroner i den tidlige baghjerne og spore deres axonale baner og tilslutningsmuligheder til mere fremskredne stadier. Vi har tidligere anvendt specifikke enhancerelementer, og en Cre / LoxP-baserede betinget ekspressionssystem til sporing axonal bane af dorsale spinale interneuroner i det tidlige hønseembryo ^7-9. I den nuværende manuskript, vi har målrettet baghjerne og opgraderet den eksperimentelle paradigme for mærkning sene embryonale baghjernen interneuroner, axoner og deres synaptiske mål, ved hjælp af en modificeret elektroporation strategien og PiggyBac - medieret DNA gennemførelse. Vores nye strategi giver mulighed for mærkning af distinkte neuronale undertyper i den ene side af baghjerne og sporing af deres axonale fremskrivninger og synaptiske sites på forskellige fosterstadiet, fra 2 op til 12 dage efter elektroporation. Baseret på denne metode, mærkede vi den dorsale-de fleste undergruppe af baghjernen interneuroner (dA1/Atoh1 ⁺ 10..

Kombinationen af ​​chick elektroporation, genetiske sporing af neuroner og analyse af projektions steder på meget fremskredne stadier af udvikling giver en unik platform for at studere dannelsen af ​​neuronale netværk i hjernen og at belyse molekylære mekanismer, som regulerer kredsløb dannelse.

Protocol

1.. Baghjernen Elektroporation

1.1 Egg håndtering

1. Placer æggene vandret i en befugtet inkubator (37 til 38,5 ° C). Embryoner elektroporeres efter 65-70 timers inkubation når de når 16-17 (HH) etape (25-30 somitter).
2. Tag æggene fra rugemaskinen, de forbliver i vandret position.

1.2 Forberedelser

1. Træk glaskapillarer (0,5 mm i diameter).
2. Slut bøjede L-formede guld Genetrodes elektroder (3 mm diameter) med en adapter holderen til impulsgeneratoren. Elektroporeringsteknikker parametre omfatter 25 volt, 5 puls numre, 45 msek puls længde, 300 msek puls intervaller.
3. Forbered en mund pipette 10 ml sprøjte nål, parafilm strips, en blød børste, skarpe dissekere saks og 25 ml sterilt PBS løsning. Dette beløb er normalt tilstrækkeligt til at håndtere en æggebakke (18 æg).
4. Forbered et passende blanding af DNA-plasmider (5 mg / ul hver) ogtilsættes ca 0,025% Fast Green farvestof til at visualisere DNA-injektion. Normalt et volumen på 4 pi er tilstrækkelig til injektion af en bakke.

1.3 Windowing, Injection og Elektroporation

1. Rens æggeskaller med 70% ethanol.
2. Håndtag ét æg ad gangen for at minimere embryonale eksponeringstid for luft.
3. Lav et hul i ægget pole med saks ender og fjerne 3-4 ml albumin med sprøjten. Fjern ikke en større mængde albumin, da det reducerer levedygtighed.
4. Åbne en lille ovale vindue (2,5 x 2 cm størrelse) i øverste centrum af æggeskallen ved hjælp af dissekere saks.
5. Dryp få dråber PBS på toppen af ​​embryonet at undgå tørhed under hele processen.
6. Indlæse en lille mængde af DNA-blandingen i glasset kapillar med en mund pipette.
7. Placer embryo med sin bageste ende mod dig. Ingen blæk injektion er nødvendig på nuværende tidspunkt, da fosteret er klart synlig. Undgå blæk injektion øgesembryo-overlevelse. Trænge ind i caudale baghjerne ved at holde kapillarrøret på ~ 45 °. Fjern ikke membran fra hele embryoet. Sprøjt DNA løsning forsigtigt ind i baghjerne lumen og udånder uden at danne luftbobler. DNA-opløsning spreder anteriort.
8. Umiddelbart efter DNA-injektion, skal du placere de parallelle elektroder på det præcise AP og DV baghjerne stilling, du har til formål at målrette. Skub elektroderne lidt ventralt uden at røre hjertet, da det kan reducere levedygtighed. Impuls elektroporator. Elektroder bør dækkes med bobler at indikere elektrisk ledeevne (figur 1A).
9. Fjern forsigtigt elektroderne og dryppe nogle få dråber PBS for at afkøle embryo og fjerne bobler. Seal ægget åbner ordentligt med en parafilm strimmel for at forhindre udtørring under inkubation. Vask elektroderne i PBS med blød børste.
10. Placer æg i inkubatoren i den ønskede længde af tid. Overlevelse af embryoer er ca 90% 2-3 dage efterelektroporation, og reducerer op til 50% 12 dage efter elektroporering.

2.. Analyse af embryoner

2.1 Flat-mount forberedelse og immunofluorescens

1. Fladskærms-mount præparater af baghjerne kan udføres op til E6.5 nemt visualisere axoner under et mikroskop eller et stereomikroskop.
2. Dissekere embryo omhyggeligt ved at adskille det fra omgivende membraner og blodkar. Placer embryo i en lille silikone - belagt petriskål indeholdende PBS. Fastgør embryonet til fadet med wolfram stifter vender dorsalt. Udfør en dorsal slids i baghjerne tag-pladen ved hjælp af skarpe glas kapillærer.
3. Brug skarpe pincet og mikro-saks holder den øverste del af hovedet og træk baghjerne væv meget omhyggeligt fra rostral til kaudal. Efter separation af baghjerne fjerne de resterende ventrale væv for at nå en ren præparat.
4. Inkuber baghjerne med 4% Paraformaldehyd (PFA) opløsning til 1-2 timer ved stuetemperatur (RT). Vask baghjerne med PBT (PBS/0.1% Triton X-100) for at fjerne PFA.
5. For Immunofluorescens i fast monterede hindbrains tilsættes 500 pi blokerende opløsning (5% af gedeserum i PBT og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur Inkuber med ^1. antistof på ved 4 ° C. Vask med PBT (15 min x 3). Inkuber med ^2. antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Vask med PBT (15 min x 3).
6. Placer baghjerne vender dorsalt på en glasplade. Tilføj fluorescerende monteringsmedie på baghjerne. Brug glaskapillarer eller wolfram nåle at flade baghjerne på diaset.
7. Tilføj lille mængde fedt i hvert hjørne for at forhindre klemning af vævet ved dækglasset. Omhyggeligt placere en dækglas på toppen af ​​baghjerne og undgå luftbobler. For tilslutning tilføje neglelak til at dække glas kanter.

2.2 cryo-sektioner, og Immunofluorescens

1. Cryo-profiler af hjernestammen can udføres på noget tidspunkt at visualisere axonale baner. Men efter E6.5 dette bør være den foretrukne metode på grund af vanskelighederne ved at visualisere axoner i det flade monteret embryo, som bliver for tyk. Desuden demonstration af synapser kræver sektionering af vævet og en høj forstørrelse visning under et mikroskop.
2. Dissekere embryoner og fjerne alle omkringliggende væv. Skyl med PBS. Skær embryo på bageste del af medulla ved hjælp af mikro-saks og skarpe pincet. Lav et bredt snit mellem lillehjernen og midthjernen og fjerne hele hjernestammen. Vævet skal indeholde medulla, pons og cerebellum.
3. Fastgør hjernestammen i 4% PFA for overnight (ON) ved 4 ° C, skylles med PBS (10 min x 3), og inkuberes med 30% sucrose ON ved 4 ° C indtil synke.
4. Integrer baghjerne i en cryo-form med oktober (Optimal Cutting Temperatur) sammensatte, og placer den ved -20 ° C indtil frysning, som beskrevet andetsteds ^11..
5. Tør dias. Tilsæt 100 pi blokerende opløsning på hvert objektglas i 2 timer ved stuetemperatur. Tilføj 100 pi af antistoffer (fortyndet i den blokerende opløsning til den ønskede koncentration). Inkubationstiden for ^1. og ^2. antistoffer er ON ved 4 ° C eller 2 timer ved stuetemperatur, hhv. For hver inkubationstid tilsættes forsigtigt parafilm stribe på toppen af ​​slæden for at forhindre tørhed. Vask med PBS (10 min x 3) mellem antistoffer. Hvis det er nødvendigt, tilsættes 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-phenylindol), fortyndet i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur. Skyl med PBS.
6. Monter slide med fluorescerende monteringsmedie. Lad tørre i 1 time før analysen.

Representative Results

Denne protokol blev for nylig anvendt til at afdække de axonale mønstre og projektion lokaliteter af DA1 undergruppe af interneuroner i chick baghjerne ^10.. Til specifikt mærke disse axoner blev et enhancerelement (Atoh1), der tidligere har været karakteriseret som specifikke for spinal DI1 neuroner ^8,12,13, bekræftede at blive udtrykt i baghjernen DA1 celler ^10. Elementet blev klonet opstrøms til Cre rekombinase og co-elektroporeres på E2.75 sammen med en Cre afhængig cytoplasmatisk GFP reporter plasmid (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP, figur 1BI). Hindbrains blev analyseret 48 timer efter elektroporation af flat-mount forberedelse og afslørede to kontra-laterale opstigende axonale projektion mønstre (figur 2A), en tarmkanalen var udelukkende stammer fra DA1 neuroner placeret på rhombomeres 6-7, at aflange i en dorsal funiculus, mens andre stammer fra rhombomeres 2-5 og udvidet i en lateral funiculus.

14,15. En reporter Cre-betingede-Myristoylated-GFP (mGFP) kassette, klonet mellem de to PB arme (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), blev elektroporeret ved E2.75 sammen med Atoh1 :: Cre forstærker og transposasen vektoren (CAG :: PBase). I denne strategi er elektroporerede Cre-betinget mGFP integreret i chick kromosomer og dermed STOP kassetten kun fjernes i DA1 neuroner, så langvarig ekspression af GFP i DA1-celler (figur 1BII, ^10). Den Myristoylated form GFP tøjrene den til membranen, således at det er lokaliseret langs den axonal membran snarere end at blive fortyndet i cytoplasmaet. Brainstems blev indsamlet E13.5 og analyseres i sagittale sektioner (Figur 2B). DA1 axoner blev fundet at akkumulere i lillehjernen og at strække sig mod ydre gr anular lag (EGL), der er præget af Zic1 ^+-celler.

Synaptiske mål DA1 axoner i lillehjernen blev også analyseret. E2.75 embryoner blev elektroporeret med synaptiske vesikel protein 2 (SV2)-GFP reporter plasmid ^16,17, sammen med Atoh1 :: Cre enhanceren og PB transposasen (figur 1BIII). Denne metode giver udtryk for GFP reporter i præsynaptiske vesikler DA1 axonale termini. Cerebellum var udskåret på E13.5 og farvet med den generelle præsynaptiske markør synaptotagmin ^18,19, samt med calbindin som mærker Purkinje lag (fig. 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ synaptiske vesikler blev påvist i flere cerebellære regioner, herunder Purkinje lag med angivelse synaptiske forbindelser i DA1 baghjernen interneurons i lillehjernen.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Figur 1 (A) Illustration af elektroporation teknik i E2.75 chick baghjerne (B) Ordning af de plasmider, der anvendes til betinget mærke baghjernen DA1 interneuroner, (I):.. Konstruktioner omfatter Atoh1 enhancerelement klonet opstrøms for Cre-rekombinase-cDNA og en betinget reporter plasmid, hvori en transkriptionel STOP kassette indsættes mellem CAGG enhancer / promotor modul og cytoplasmatiske GFP-genet (cGFP). Den betingede ekspression af GFP i DA1 neuroner er drevet af Atoh1 :: Cre (II):. Den PiggyBac gennemførelse metode til konstitutivt mærke baghjernen celler. Konstruktioner omfatter Atoh1 :: Cre forstærker plasmid, en Cre-betinget reporter kassette, hvor Myristoylated GFP (mGFP) klones mellem to PB arme (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), og en Pbase transposasen plasmid. Denintegration af reporter kassetten i genomet af DA1 neuroner er drevet af CAG :: PBase og Atoh1 :: Cre vektorer. (III): En lignende PiggyBac gennemførelse metode til at mærke synaptiske mål baghjernen interneuroner. Cre-betingede reporterplasmid omfatter en synaptisk SV2-GFP flankeret mellem to PB arme (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Klik her for at se større figur .

Figur 2. Axonale baner DA1 interneuroner (A):. En flad monteret forberedelse af E4.5 baghjerne viser to opstigende DA1 axonale skrifter (grøn, pile). Den neurofillament markør 3A10 (rød) bruges til at markere rhombomere grænser. (B) En sagittalsektion af lillehjernen af ​​E13.5 embryo viser DA1 axoner (grøn) akkumuleres i lillehjernen. EGL celler mærkes med Zic1 (rød). EGL, Ekstern Granular Layer er Scale bar markeret.

Figur 3. Synaptiske mål for DA1 interneuroner (A):. En sagittal sektion af E13.5 lillehjernen farves med calbindin (lyserød) til mark Purkinje lag og DAPI (blå) til at mærke kerner. (B). En højere forstørrelse visning af det markerede område i A. SV2-GFP mærket DA1 synapser (grøn) er vist i Purkinje lag af lillehjernen (lyserød). Den generelle præsynaptiske markør synaptotagmin (rød) er co-udtrykkes med SV2-GFP ⁺ synapser (gul, pile). CALB, calbindin, S-Tag, synaptotagmin. Skalapanelerne er markeret.

Discussion

I ovo elektroporation er en realistisk, pålidelig og effektivt redskab til at undersøge celle specifikation og axonal vejledning i chick nervesystem udvikling ^20.. I denne protokol beskriver vi en tilstand af elektroporation i chick baghjerne på E2.75 hjælp enhancerelementer som muliggør den betingede mærkning af specifikke interneuroner. Denne strategi er kombineret med det PiggyBac-medierede gennemførelse system til at indsætte fremmede gener i chick genomet, hvilket muliggør sporing af axonale ruter, projektioner og synaptiske sites på fremskredne stadier af embryogenese.

Tidligere metoder til mærkning axoner / synapser i chick baghjerne inkluderet klassisk retrograd eller anterograd farvestof etikettering eller podning eksperimenter ^21-23. Disse undersøgelser har bidraget signifikante fund på baghjerne stigende og faldende axonale skrifter. Men nogle baner og fremskrivninger overset af disse cellulære metoder. I Addit ion, kunne molekylære identitet undergrupper af neuroner, der projiceres ind i den rapporterede funiculi ikke blive afsløret. Vores kombineret metode til elektroporation og vedvarende genetiske sporing giver den unikke evne til at følge udviklingen af udvalgte baghjernen neuroner fra deres specifikation faser for at aksonal navigation og projektion mål ^10. Især blev vores tilgang tidligere anvendte at spore axonale baner af rygmarv dorsale interneurons for kortere perioder ^8,9.

De beskrevne værktøjer kan også tjene til at afdække molekylære mekanismer, som regulerer aksonal fremskrivningerne Genetiske koder (såsom Lim homøopatiske-domæne kode) blev modificeres selektivt i en vis neuronal undergruppe med enhancer-Cre/Lox-based tilgang og virkningen af ​​axonal vækst og tilslutningsmuligheder blev fulgt ^8,10. Derfor kan denne protokol være nyttig, ikke kun for cellemærkning, men også for genetiske manipulationer på ønskede celler.

ve_content "> En af fordelene ved elektroporation som en in ovo gen levering metode er den hurtige udtryk, som er observeret allerede indenfor 3 hr efter elektroporation ^24.. Men den forbigående ekspression af det indførte gen forsvinder med celledelinger på et senere udviklingsmæssige etaper. at tilsidesætte denne begrænsning, vi gjort brug af den PiggyBac gennemførelse metode til in ovo geninsertion. Dette værktøj gør det muligt at spore axoner og synapser på en konsekvent måde for meget fremskredne stadier efter elektroporation i forhold til tidligere metoder. Som vi nemt kunne registrere mærkede neuroner op til 12 dage efter elektroporation (E14.5), er det yderst plausibelt at bruge denne fremgangsmåde, selv for længere perioder, herunder efter klækning.

En anden fordel af chick neuralrørsdefekter elektroporation relæer på den ensidige målretning af celler i en rumlig og tidsmæssig begrænsede manerer. Dette gør det muligt at spore axonale baner på be to sider af baghjerne i en fase for etape grundlag, som er sværere at følge i pattedyr. Det er mest fordi kim-line transgenese resulterer i mærkning af ønskede celler i begge neuralrørsdefekter sider, hvilket komplicerer muligheden for at spore ensidige fremskrivninger og at adskille mellem oprindelsen af ​​ipsi og contra-laterale axonale skrifter. I sidste ende, er baseret på den høje grad af homologi mellem mus og chick hjernestammen neuroner ^3,5, vores teknik giver et kraftfuldt værktøj til at få ny viden om samlingen af ledninger og neuroner i udviklingslandene hvirveldyr baghjerne.

Omend fordelene ved vores teknik, at brugen af ​​enhancerelementer drive betinget ekspression af reportergener i chick neuralrøret kræver omhyggelig vurdering af celle-specificitet og timingen af ​​ekspression af forstærker-GFP-konstruktioner, indførelse af enhancerelementer blev fundet i vores system til at drive en ikke-begrænset ekspression af GFP i baghjerne, mens kun fåandre gav en ikke-specifik ekspression på et tidligt, men ikke sent, neuralrørsdefekter etaper (data ikke vist). Desuden betyder vores strategi i øjeblikket ikke støtte en tidsmæssig-specifikt udtryk for det reporter genet. Derfor kan vi ikke skelne mellem tidlige eller senere fødte undergrupper af DA1 interneuroner, hvilket muligvis vil projicere forskellige axonale skrifter til at målrette forskellige cerebellare områder. Genetisk konstruktion af yderligere værktøjer til at timeligt tænde / slukke udtryk af GFP i baghjernen neuroner vil være gavnligt at følge mere præcist udviklingen af ​​axonale baner og synapser i embryonale / voksne hjernestammen. Endelig en teknisk ulempe ved vores elektroporation strategi er den manglende adgang til foster til denne manipulation på etaper over E2.75-3, på grund af sin placering i ægget, blodkar og tilstødende membraner. Denne begrænsning forhindrer målretning af vores plasmider ind yderligere undertyper af baghjernen neuroner, der er født senere i udvikling.