Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l'embryon de poulet

Summary

Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.

Abstract

Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d'électroporation d'ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu'à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox - Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l'expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d'intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.

Introduction

Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l'audition et la coordination motrice ^1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral ^4. Le cerveau postérieur est également divisé le long de son axe dorso-ventral (DV) dans une plaque basale et Alar, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux distincts deviennent spécifiés et se différencient dans des endroits distincts DV ^3,5,6. Comment le début AP et spécifiques DV modèles neuronaux sont relatives à la création de circuits de tronc cérébral fonctionnel est largement inconnue.

D'acquérir des connaissances sur ce principe fondamentalquestion, des outils sont nécessaires pour étiqueter sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur au début et à retracer leurs trajectoires axonales et la connectivité à des stades plus avancés. Nous avons déjà utilisé des éléments activateurs spécifiques, et un système d'expression conditionnelle Cre / loxP-base pour le suivi de trajectoire des axones des interneurones spinaux dorsaux au début embryon de poulet ^7-9. Dans le manuscrit actuel, nous avons ciblé le cerveau postérieur et amélioré le paradigme expérimental pour l'étiquetage fin des interneurones du cerveau postérieur embryonnaire, les axones et leurs cibles synaptiques, en utilisant une stratégie d'électroporation modifié et le PiggyBac - transposition de l'ADN induite. Notre nouvelle stratégie permet le marquage des sous-types neuronaux distincts dans un côté du cerveau postérieur et le suivi de leurs projections axonales et les sites synaptiques à différents stades embryonnaires, à partir de 2 jusqu'à 12 jours après l'électroporation. Sur la base de cette méthode, nous avons appelé la dorsale la plus sous-groupe des interneurones du cerveau postérieur (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

La combinaison de poussin électroporation, génétique traçage des neurones et analyse des sites de projection à bien des stades avancés de développement fournit une plate-forme unique d'étudier la formation des réseaux neuronaux dans le cerveau et à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des circuits.

Protocol

1. électroporation Rhombencéphale

1.1 manipulation des oeufs

1. Placez les oeufs horizontalement dans un incubateur humidifié (37 à 38,5 ° C). Les embryons sont électroporation après 65-70 heures d'incubation, quand ils atteignent 16-17 (HH) stade (25-30 somites).
2. Retirer les oeufs de l'incubateur, ils restent en position horizontale.

1.2 Préparatifs

1. Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre).
2. Connexion pliées en forme de L Genetrodes électrodes d'or (3 mm de diamètre) avec un support d'adaptateur sur le générateur d'impulsions. paramètres d'électroporation comprennent 25 volts, 5 numéros d'impulsions, 45 msec longueur d'impulsion, 300 msec intervalles impulsions.
3. Préparer une pipette de bouche, 10 ml aiguille de la seringue, bandes parafilm, une brosse douce, des ciseaux de dissection tranchants et une solution de PBS stérile 25 ml. Cette quantité est habituellement suffisante pour gérer un plateau d'oeufs (18 oeufs).
4. Préparer un mélange adéquat de plasmides d'ADN (5 ug / ul chacun) etajouter environ 0,025% de colorant de vert rapide de visualiser injection d'ADN. Habituellement, un volume de 4 pi est suffisant pour l'injection d'un plateau.

1.3 fenêtrage, injection et l'électroporation

1. Nettoyer les coquilles d'œufs avec 70% d'éthanol.
2. Manipuler un oeuf à la fois pour réduire le temps d'exposition embryonnaire à l'air.
3. Faire un trou au niveau du pôle d'oeuf avec des ciseaux fins et retirer 3-4 ml d'albumine avec la seringue. Ne pas retirer une plus grande quantité d'albumine, car elle réduit la viabilité.
4. Ouvrir une petite fenêtre ovale (2,5 x 2 cm d'épaisseur) au centre supérieur de la coquille de l'oeuf à l'aide des ciseaux de dissection.
5. Goutte à goutte quelques gouttes de PBS sur le dessus de l'embryon pour prévenir la sécheresse durant tout le processus.
6. Charger une petite quantité du mélange d'ADN dans le capillaire en verre à l'aide d'une pipette de bouche.
7. Placez l'embryon avec son extrémité postérieure vers vous. Pas d'injection d'encre est nécessaire à ce stade que l'embryon est clairement visible. Éviter les augmentations d'injection d'encresurvie embryonnaire. Pénétrer dans le cerveau postérieur caudale en maintenant le capillaire à ~ 45 °. Ne pas enlever la membrane du monde embryon. Injecter la solution d'ADN soigneusement dans la lumière du cerveau postérieur et expirez sans former de bulles d'air. solution d'ADN se propage en avant.
8. Immédiatement après l'injection d'ADN, placer les électrodes parallèles à l'AP précise et DV position hindbrain vous visez à cibler. Poussez les électrodes légèrement ventrale sans toucher le cœur, car il peut réduire la viabilité. Pulser le électroporateur. Les électrodes doivent être couverts avec des bulles pour indiquer une conductivité électrique (figure 1A).
9. Retirez délicatement les électrodes et couler quelques gouttes de PBS pour refroidir l'embryon et pour éliminer les bulles. Sceller l'ouverture correctement avec une bande parafilm pour éviter le dessèchement pendant l'incubation oeuf. Lavez électrodes dans PBS avec la brosse douce.
10. Placer l'œuf dans l'incubateur pendant la durée souhaitée. La survie des embryons est d'environ 90% 2-3 jours aprèsélectroporation, et réduit jusqu'à 50% de 12 jours après l'électroporation.

2. Analyse des embryons

2.1 préparation Flat-mount et immunofluorescence

1. Préparations plat de montage du cerveau postérieur peuvent être effectuées jusqu'à E6.5 de visualiser facilement les axones sous un microscope ou un stéréo-microscope.
2. Disséquer l'embryon soigneusement en le séparant de membranes qui entourent et les vaisseaux sanguins. Placez l'embryon dans une petite silicone - boîte de Pétri contenant recouvert PBS. Fixez l'embryon dans le plat avec des épingles de tungstène face dorsale. Effectuer une fente dorsale dans le cerveau postérieur toit-plaque à l'aide forte capillaires en verre.
3. En utilisant des pinces pointues et des micro-ciseaux tenir la partie supérieure de la tête et tirez le tissu de cerveau postérieur très soigneusement de rostral à caudal. Après la séparation du cerveau postérieur éliminer les derniers tissus ventraux pour atteindre une préparation propre.
4. Incuber le cerveau postérieur avec 4% solution de paraformaldéhyde (PFA) pour 1-2 heures à température ambiante (RT). Laver le cerveau postérieur avec PBT (PBS contenant 0,1% de Triton X-100) pour enlever les PFA.
5. Pour immunofluorescence dans hindbrains plat montés ajouter 500 ul de solution de blocage (5% de sérum de chèvre en PBT et incuber pendant 2 heures à température ambiante incuber avec 1 ^m anticorps ON à 4 ° C. Laver avec de PBT (15 min x 3). Incubate avec 2 ^ème anticorps pendant 2 heures à température ambiante. Laver avec PBT (15 min x 3).
6. Placez le cerveau postérieur face dorsale sur une lame de verre. Ajouter milieux de montage fluorescentes sur le cerveau postérieur. Utilisez capillaires en verre ou des aiguilles de tungstène pour aplatir le cerveau postérieur sur la diapositive.
7. Ajoutez petite quantité de graisse à chaque coin pour éviter la compression des tissus par la lamelle. Placez délicatement une lamelle sur le dessus du cerveau postérieur et d'éviter les bulles d'air. Pour ajouter adhésion de vernis à ongles pour couvrir les bords du verre.

2.2 Cryo-sections et immunofluorescence

1. Cryo-sections du tronc cérébral can être effectuée à n'importe quel stade de visualiser les trajectoires axonales. Pourtant, après E6.5 ce devrait être la méthode privilégiée en raison de la difficulté à visualiser axones dans l'embryon plate-monté, qui devient trop épaisse. De plus, la démonstration de synapses nécessite la coupe du tissu et une vue à fort grossissement au microscope.
2. Disséquer l'embryon et enlever tous les tissus environnants. Rincer avec du PBS. Couper l'embryon à la partie caudale de la moelle aide de micro-ciseaux et des pinces acérées. Faire une large incision entre le cervelet et le mésencéphale et retirer l'ensemble du tronc cérébral. Le tissu doit contenir la moelle, la protubérance et le cervelet.
3. Fixer le tronc cérébral dans 4% PFA pour la nuit (ON) à 4 ° C, rincer avec du PBS (10 min x 3), et incuber à 30% de saccharose de ON à 4 ° C jusqu'à son naufrage.
4. Intégrer le cerveau postérieur dans un cryo-moule avec du composé OCT (Optimal Cutting Temperature), et placez-le à -20 ° C jusqu'à ce que le gel, comme décrit par ailleurs ^11.
5. Sécher les diapositives. Ajouter 100 ul de solution de blocage sur chaque diapositive pendant 2 heures à température ambiante. Ajouter 100 ul d'anticorps (dilué dans la solution de blocage à la concentration souhaitée). La période d'incubation de 1 ^ère et 2 ^ème anticorps est ON à 4 ° C ou 2 heures à température ambiante, respectivement. Pour chaque temps d'incubation, ajouter doucement la bande parafilm sur le dessus de la lame pour prévenir la sécheresse. Laver avec du PBS (10 min x 3) entre les anticorps. Si nécessaire, ajoutez 1:1000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-phenylindole), dilué dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. Rincer avec du PBS.
6. Monter la lame avec un milieu de montage fluorescentes. Laisser sécher pendant 1 heure avant l'analyse.

Representative Results

Ce protocole a été récemment utilisée pour découvrir les modèles axonales et les sites de projection de dA1 sous-groupe des interneurones dans le cerveau postérieur poussin ^10. Pour étiqueter spécifiquement ces axones, un élément activateur (Atoh1), qui a déjà été qualifiée de spécifique pour la colonne vertébrale EL1 neurones ^8,12,13, a été confirmée à exprimer en dA1 cellules cerveau postérieur ^10. L'élément a été cloné en amont de la recombinase Cre et co-électroporation à E2.75 avec un Cre dépendant rapporteur GFP plasmide cytoplasmique (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-CGFP; Figure 1BI). Hindbrains ont été analysées 48 h électroporation suivante préparation plate-mount et révélé deux modèles de projections axonales ascendantes controlatéral (figure 2A), un contrat a été exclusivement dérivé de dA1 neurones situés à rhombomères 6-7 que allongé dans une funiculus dorsale, tandis que le autres provenaient de rhombomères 2-5 et étendus dans un cordon latéral.

14,15. Un journaliste Cre-conditionnel-myristoylée-GFP (mGFP) cassette, clone entre les deux bras PB (PB-CAG-loxP-STOP-loxP-mGFP-PB), une électroporation à E2.75 avec le Atoh1 :: Cre activateur et le vecteur transposase (CAG :: PBase). Dans cette stratégie, le mGFP Cre-conditionnelle électroporé est intégré dans les chromosomes chiches et par conséquent la cassette STOP est retiré seulement dans dA1 neurones, permettant l'expression prolongée de la GFP dans les cellules dA1 (Figure 1BII; ^10). La forme myristoylée des attaches GFP elle à la membrane de telle sorte qu'il est localisée le long de la membrane axonale au lieu d'être diluée dans le cytoplasme. Tronc cérébral ont été prélevés à E13.5 et analysés dans les sections sagittal (figure 2B). dA1 axones ont été trouvés à s'accumuler dans le cervelet et à s'étendre vers l'extérieur gr couche annulaire (EGL), qui est marquée par ZIC1 ^{cellules +.}

Cibles synaptiques de dA1 axones dans le cervelet ont également été analysés. E2.75 embryons ont été électroporation avec des protéines des vésicules synaptiques 2 (SV2)-GFP plasmide rapporteur ^16,17, avec Atoh1 :: Cre activateur et le PB transposase (Figure 1BIII). Cette méthode permet l'expression du rapporteur GFP dans les vésicules présynaptiques de dA1 terminaisons axonales. Le cervelet a été sectionné à E13.5 et colorée avec le marqueur général pré-synaptique synaptotagmine ^18,19, ainsi qu'avec calbindin qui qualifie la couche Purkinje (figures 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ vésicules synaptiques ont été détectées dans plusieurs régions du cervelet, y compris la couche de Purkinje, en indiquant les connexions synaptiques de dA1 interneurones du cerveau postérieur dans le cervelet.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Figure 1 (A) Illustration de la technique d'électroporation dans E2.75 poussin cerveau postérieur (B) Schéma des plasmides utilisés pour étiqueter conditionnellement cerveau postérieur dA1 interneurones; (I):.. Constructions comprennent l'élément activateur Atoh1 cloné en amont de Cre recombinase ADNc et reporter conditionnelle plasmide, dans laquelle une cassette d'arrêt de la transcription est inséré entre le CAGG activateur / module promoteur et le gène de la GFP cytoplasmique (CGFP). L'expression conditionnelle de la GFP dans DA1 neurones est entraîné par Atoh1 :: Cre (II):. Procédé de transposition PiggyBac à étiqueter de manière constitutive des cellules du cerveau postérieur. Les constructions comprennent la Atoh1 :: Cre enhancer plasmide, une cassette rapporteur Cre-conditionnel, dans lequel la GFP myristoylée (mGFP) est cloné entre les deux bras (PB PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB), et une transposase Pbase plasmide. Lel'intégration de la cassette rapporteuse dans le génome de DA1 neurones est entraîné par le CAG :: PBase et Atoh1 :: vecteurs Cre. (III): méthode de transposition PiggyBac similaire à étiqueter cibles synaptiques des interneurones du cerveau postérieur. Le journaliste Cre-conditionnelle plasmide comprend un synaptique SV2-GFP flanquée entre deux bras PB (PB-loxP-STOP-loxP-SV2-GFP-PB). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Trajectoires axonales de dA1 interneurones (A):. Une préparation plat monté de E4.5 hindbrain démontre deux ascendants dA1 voies axonales (vert, flèches). Le marqueur 3A10 de neurofillament (rouge) est utilisé pour marquer les frontières rhombomère. (B) A sagittalsection du cervelet de E13.5 embryons démontre dA1 axones (vert) qui s'accumulent dans le cervelet. Les cellules EGL sont étiquetés avec ZIC1 (rouge). EGL, couche granulaire externe, barre d'échelle est marqué.

Figure 3. Cibles synaptiques de dA1 interneurones (A):. Une coupe sagittale de E13.5 cervelet teinté avec Calbindin (rose) pour marquer Purkinje couche et DAPI (bleu) aux noyaux d'étiquette. (B). Une vue d'un plus fort grossissement de la zone marquée en A. SV2-GFP étiqueté dA1 synapses (vert) sont présentés dans la couche de Purkinje du cervelet (rose). Le marqueur pré-synaptique synaptotagmine générale (rouge) est co-exprimé avec SV2-GFP ⁺ synapses (jaune, flèches). Calb, Calbindin; S-Tag, synaptotagmine. barres d'échelle sont marquées.

Discussion

En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux ^20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d'électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l'étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition PiggyBac médiation pour insérer des gènes étrangers dans le génome poussin, qui permet de suivre les voies axonales, les projections et les sites synaptiques à des stades avancés de l'embryogenèse.

Méthodes précédentes pour axones Label / synapses dans le cerveau postérieur de poulet inclus colorant rétrograde ou antérograde classique étiquetage ou expériences de greffage ^21-23. Ces études ont permis d'importantes découvertes sur le cerveau postérieur ascendantes et descendantes tracts axonales. Cependant, certaines trajectoires et les projections ont été négligés par ces approches cellulaires. En addit ion, les identités moléculaires de sous-groupes de neurones qui projettent dans la funiculi rapporté ne pouvaient pas être révélés. Notre méthode combinée de l'électroporation et soutenue traçage génétique offre la possibilité unique de suivre le développement des neurones du cerveau postérieur sélectionnés à partir de leurs étapes de spécification de navigation axonale et les objectifs de projection ^10. Notamment, notre approche a déjà été appliquée à retracer les trajectoires axonales des interneurones spinaux dorsaux de la moelle pour des périodes plus courtes ^8,9.

Les outils décrits peuvent aussi servir à découvrir des mécanismes moléculaires qui régissent les projections axonales; codes génétiques (comme le code homéo-domaine Lim) ont été modifiés de manière sélective dans un certain sous-groupe neuronale utilisant l'approche enhancer-Cre/Lox-based et l'impact de la croissance axonale et la connectivité a été suivie ^8,10. Par conséquent, ce protocole peut être utile non seulement pour le marquage cellulaire, mais également pour les manipulations génétiques sur les cellules souhaitées.

ve_content "> Un des avantages de l'électroporation comme une méthode de transfert de gènes in ovo est la rapidité d'expression, qui est déjà observée dans les 3 heures suivant l'électroporation ^24. Toutefois, l'expression transitoire de les fondus de gènes introduits loin avec les divisions cellulaires au plus tard le développement étapes. Pour outrepasser cette limitation nous ont fait usage de la méthode de transposition PiggyBac par insertion du gène ovo. Cet outil permet le suivi des axones et des synapses de manière robuste pour beaucoup un stade avancé après l'électroporation, par rapport aux méthodes précédentes. Comme nous avons pu détecter facilement étiqueté neurones jusqu'à 12 jours après l'électroporation (E14.5), il est fort plausible d'utiliser cette approche, même pour de longues périodes de temps, y compris après l'éclosion.

Un autre avantage du poussin du tube neural relais d'électroporation sur le ciblage unilatérale de cellules dans une spatiales et temporelles manières restreints. Cela permet de tracer des trajectoires axonales sur bOTH côtés du cerveau postérieur dans une base étape par étape, ce qui est plus difficile à suivre chez les mammifères. C'est surtout parce que la lignée germinale résultats de transgénèse dans l'étiquetage des cellules souhaitées dans les deux côtés du tube neural, ce qui complique la capacité de retracer projections unilatérales et de séparer entre l'origine de l'IPSI et des voies axonales controlatéral. En fin de compte, basée sur le degré élevé d'homologie entre la souris et le poussin tronc cérébral neurones ^3,5, notre technique fournit un outil puissant pour acquérir de nouvelles connaissances sur l'ensemble du câblage et des neurones dans le cerveau postérieur de vertébrés en développement.

Quoique les avantages de notre technique, l'utilisation des éléments activateurs pour conduire l'expression conditionnelle de gènes rapporteurs dans le poussin tube neural nécessite une évaluation minutieuse de spécificité cellulaire et le moment de l'expression des constructions enhancer-GFP, l'introduction de certains éléments amplificateurs ont été trouvés dans notre système de conduire une expression sans restriction de la GFP dans le cerveau postérieur, tandis que quelques-unsd'autres ont donné une expression non spécifique au début, mais pas la fin, les étapes du tube neural (données non présentées). Par ailleurs, notre stratégie ne prend pas en charge une expression temporelle spécifique du gène rapporteur. Par conséquent, nous ne pouvons pas faire la distinction entre les sous-groupes au début ou plus tard-né de dA1 interneurones, qui peut éventuellement projeter différentes voies axonales pour cibler des zones distinctes du cervelet. Construction génétique des outils supplémentaires pour passer temporairement sous / hors tension l'expression de la GFP dans les neurones du cerveau postérieur sera bénéfique pour suivre plus précisément l'évolution des trajectoires axonales et des synapses dans le tronc cérébral embryonnaire / adulte. Enfin, un inconvénient technique de notre stratégie d'électroporation est l'inaccessibilité de l'embryon à cette manipulation à des stades au-delà E2.75-3, en raison de sa position dans l'œuf, les vaisseaux sanguins et les membranes enveloppant. Cette limitation empêche le ciblage de nos plasmides en sous-types supplémentaires de neurones du cerveau postérieur qui sont nés plus tard dans le développement.