ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Summary

発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre / LOX-プラスミドおよび背側介在ニューロンにラベルを付け、様々な発達段階でそれらの軸索投射やシナプスの標的を追跡する鳥類の後脳におけるpiggyBacを媒介DNA転位システムなどの小説の遺伝的なツール、とエレクトロポレーション技術を組み合わせた。

Abstract

ニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションは、例えば、神経細胞への外来遺伝子の発現のための迅速かつ効率的なものとして多くの利点を有する。本稿で我々は、特に神経前駆細胞のサブセットにラベルを付けるために、E2.75で鳥類の後脳にDNAをエレクトロする方法を一意に示し方法、どのように開発のより高度な段階で、その軸索投射やシナプスの目標に従うことを提供しますまでE14.5まで。ベースのプラスミドおよび後脳細胞（ニューロン、DA1の背最もサブグループ）のサブタイプでGFPの発現を駆動するpiggyBacを媒介DNA転位システム - 私たちは、特定のエンハンサーエレメント、Creを/ロックス含む小説遺伝のツールを利用してきた。 DA1軸索の軸索軌道と目標は、さまざまな脳幹領域に初期および後期胚の段階で続いている。この戦略は、胚後脳における目的の細胞を標的とするためとTRAのための高度な技術に貢献開発の複数の段階での回路形成をcing。

Introduction

後脳は、神経回路網を昇順と降順を介して、中枢および末梢神経系の間で通信することにより、神経系の主要な中継ハブを表しています。それは呼吸、意識、聴覚、およびモータ協調^1-3を含む基本的な機能を調節する。初期胚発生時には、脊椎動物の後脳を一過異なる神経細胞型が形成され、複数の脳幹核センター^4が生成されている反復的な菱へとその前後（AP）軸に沿って分割されます。後脳はまた、個別の神経前駆細胞は、指定されたとなり、明確なDVの場所^3,5,6で分化れる基底とエイラープレートにその背腹（DV）軸に沿って分割されています。どのように早期のAPとDV固有ニューロンのパターンが機能脳幹回路網の確立を支配していることはあまり知られていない。

この基本的な知識を得るために質問、ツールは早い後脳の神経細胞の特定のサブセットにラベルを付けると、より高度な段階でそれらの軸索の軌道と接続性をトレースするために必要です。我々は以前、特定のエンハンサーエレメント、および早期のニワトリ胚^7-9に背側脊髄介在ニューロンの軸索軌道を追跡するためのCre /のLoxPベースの条件式のシステムを利用してきた。現在の原稿では、後脳を対象とし、修正されたエレクトロポレーション戦略とpiggyBacを使用して、後期胚後脳ニューロン、軸索とそのシナプスの標的を標識するための実験的なパラダイムをアップグレードした - 媒介DNAの転置を。私たちの新しい戦略は、エレクトロポレーション後2までの12日から、後脳の片側に異なる神経細胞サブタイプのタグ付け、様々な胚の段階でそれらの軸索投射やシナプスのサイトのトラッキングを可能にします。この方法に基づき、我々は後脳ニューロン（dA1/Atoh1 ⁺の背ほとんどサブグループのラベルが付いた10の複数の層のフォームシナプスに発見された。

ひよこのエレクトロポレーションの組み合わせは、遺伝的にはニューロンと開発の多くの先進的な段階で投影サイトの分析のトレース、脳内の神経ネットワークの形成を研究するために、回路形成を支配する分子メカニズムを解明するユニークなプラットフォームを提供します。

Protocol

1。後脳のエレクトロ

1.1卵の取り扱い

1. 加湿インキュベーター（37から38.5℃）に水平に卵を置きます。胚は、彼らは16-17（HH）ステージ（25〜30体節）に達したときに、インキュベーションの65-70時間後にエレクトロポレーションされています。
2. インキュベーターから卵を外し、彼らは水平位置に残ります。

1.2準備

1. ガラスキャピラリー（直径0.5mm）を引き出します。
2. パルス発生器にアダプタ保持して屈曲L字状の金Genetrodes電極（直径3mm）を接続する。エレクトロポレーション·パラメータは、25ボルト、5パルス数、45ミリ秒のパルス長、300ミリ秒パルス間隔が含まれています。
3. 口のピペット、10ミリリットルの注射針、パラフィルムストリップ、柔らかいブラシ、鋭い解剖はさみ、25 mlの滅菌PBS溶液を準備します。この量は、通常、卵トレイ（18卵）を処理するのに十分である。
4. DNAプラスミドの適切な混合物（5μgの/μlのそれぞれ）を準備し、DNA注入を可視化するために約0.025％ファストグリーン染料を追加します。通常4μLの容積は、トレイの注射のために十分である。

1.3ウィンドウイング、注射とエレクトロ

1. 70％エタノールで卵の殻をきれいにします。
2. 空気に胚の露光時間を最小限にするために一つずつ卵を扱う。
3. はさみ両端卵ポールに穴を作り、シリンジでアルブミン3-4ミリリットル取り除く。それは可能性を減少させるのでアルブミン多量のを削除しないでください。
4. 解剖ハサミを使って卵の殻の上部中央にある小さな楕円形の窓（2.5×2センチサイズ）を開きます。
5. 全体のプロセス中に乾燥を防ぐために、胚の上にPBSを数滴垂らし。
6. ガラス中にDNA混合物の少量を読み込む口のピペットを用いてキャピラリ。
7. あなたに向かって、その後端に胚を置きます。胚がはっきり見えるようにインク噴射がこの段階で必要とされない。インク注入が増大を回避すること胚の生存。 〜45°でキャピラリーを保持することによって尾後脳に浸透。胚の周りからの膜を除去しないでください。気泡を形成することなく、後脳内腔と呼気に慎重にDNA溶液を注入する。 DNA溶液は、前方に広がる。
8. すぐにDNA注入後、ターゲットを目指して正確なAPとDV後脳の位置で平行電極を配置。それは可能性を減らす可能性があるので、心に触れることなく少し腹の電極を押してください。エレクトロをパルス。電極（ 図1A）電気伝導性を示すために、泡で覆われるべきである。
9. 慎重に電極を除去し、胚を冷却するために、泡を除去するためにPBSを数滴垂らし。インキュベーション中に乾燥を防ぐためにパラフィルムストリップで正しく開く卵を密封。柔らかいブラシで、PBS中の電極を洗浄します。
10. 時間の希望の長さのためにインキュベーターに卵を置きます。胚の生存率は約90％の2-3日後ですエレクトロポレーション、およびエレクトロポレーション後に50％の12日まで減少します。

2。胚の分析

2.1フラットマウントの準備と免疫

1. 後脳のフラットマウントの準備が簡単に顕微鏡やステレオ顕微鏡下で軸索を可視化するためにE6.5まで行うことができます。
2. 膜及び血管周囲から分離によって注意深く胚を解剖。 PBSを含むコーティングされたペトリ皿-小さなシリコーンで胚を置きます。背側に面しタングステンピンと皿に胚を取り付けます。後脳鋭いガラスキャピラリーを用いた屋根板に背スリットを実行します。
3. 鋭いピンセットとマイクロはさみを使用すると、頭の上部を保持し、吻側から尾側に非常に慎重に後脳組織を引っ張る。後脳を分離した後、クリーン準備に達するために、残りの腹側組織を削除します。
4. 4と後脳をインキュベート％パラホルムアルデヒド（PFA）室温（RT）で1〜2時間のためのソリューション。 PFAを削除するには、PBT（PBS/0.1％トリトンX-100）と後脳を洗ってください。
5. フラットマウントhindbrainsは4でON 1 ^回目の抗体°PBTとで洗浄（15分×3）でRTインキュベートで2時間PBTとインキュベートでブロッキング溶液を500μl（ヤギ血清の5％を追加します。インキュベートで免疫用室温で2時間で2 ^回目の抗体。PBT（15分×3）で洗うこと。
6. スライドガラス上に背側に面し後脳を置きます。後脳の上に蛍光灯取り付けメディアを追加します。スライド上に後脳を平らにガラスキャピラリーやタングステン針を使用してください。
7. カバースリップによる組織の圧搾を防止するために、各角部にグリースを少量加える。後脳の上にカバースリップを慎重に配置し、気泡を避ける。遵守のためのガラスのエッジをカバーするためにマニキュアを追加します。

2.2クライオセクションと免疫

1. 脳幹CAのクライオセクションnは軸索軌道を可視化する任意の段階で行われる。しかし、E6.5後これはあまりにも厚くなり、フラットマウント胚で軸索を可視化することが困難であるため好ましい方法でなければなりません。また、シナプスのデモは、組織と顕微鏡下で高倍率ビューの切片が必要です。
2. 胚を解剖し、すべての周囲の組織を削除します。 PBSですすいでください。マイクロはさみと鋭いピンセットを使用して延髄の尾部分に胚をカットします。小脳と中脳の間に広い切開を行い、全体の脳幹を削除します。組織が髄質、橋と小脳を含むべきである。
3. PBS（10分×3）ですすぎ、4℃で一晩4％PFA（ON）°Cで脳幹を修正し、ON 4℃で沈没するまで、30％ショ糖でインキュベート。
4. 10月（最適切削温度）化合物と低温型で後脳を埋め込 ​​むと、他の場所で¹¹説明されているように、凍結まで-20°Cでそれを配置します。
5. スライドを乾燥させます。室温で2時間、各スライドに100μlのブロッキング溶液を追加。抗体100μlの（所望の濃度にブロッキング溶液で希釈した）を追加します。 ¹回目と2 ^回目の抗体についての潜伏期間は4でONになっているそれぞれRT℃でまたは2時間、。それぞれのインキュベーション時間は、穏やかに乾燥を防ぐために、スライドの上にパラフィルムストリップを追加します。抗体間のPBS（10分×3）で洗浄します。必要に応じて、RTで20分間PBSで希釈1:1000 DAPI（4'-6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）を加える。 PBSですすいでください。
6. 蛍光灯取り付けメディアとスライドをマウントします。分析の前に1時間乾燥させます。

Representative Results

このプロトコルは、最近ニワトリ後脳¹⁰におけるニューロンのDA1サブグループの軸索パターンと投影サイトを発見するために使用された。具体的には、これらの軸索を標識するために、予め脊髄ニューロン^8,12,13 DI1に特異として特徴付けられているエンハンサーエレメント（ATOH1）は、後脳DA1セル¹⁰で発現することが確認された。要素は、CreリコンビナーゼとプラスミドのCre依存細胞質GFPレポーター（; 図1BI pCAGG-のLoxP-ストップのLoxP-CGFP）とともにE2.75でCOは、エレクトロの上流にクローニングした。 Hindbrainsは、フラットマウントの準備で48時間以下のエレクトロポレーションを分析し、2対側昇順軸索投射パターン（ 図2A）を明らかにした;、一方の管はもっぱら、後索に細長いこと6-7菱に位置DA1ニューロンから派生したもう一つは、菱2-5由来および横索に延長。

14,15を適用した。 2 PBアーム（PB-CAG-のLoxP-STOP-のLoxP-MGFP-PB）との間で複製された記者のCre-条件付き-ミリストイル-GFP（MGFP）カセットは、ATOH1とともにE2.75でエレクトロた:: Creをエンハンサー及びトランスポザーゼベクトル（CAG :: PBASE）。この戦略では、エレクトロポCRE-条件付きMGFPはニワトリ染色体に組み込まれており、結果的にSTOPカセットがDA1細胞（ 図1BII; ^10）でGFPの長期発現が可能、DA1ニューロンでのみ削除されます。それはむしろ、細胞質中で希釈されているよりも軸索の膜に沿って局在しているように、膜へのGFPテザーそのミリストイル形。 Brainstemsは、E13.5で収集し、矢状部（ 図2B）で分析した。 DA1軸索は、小脳に蓄積すると、外部グラムに向かって延びることが見出された Zic1 ^+細胞によってマークされanular層（EGL）、。

小脳におけるDA1軸索のシナプス標的も分析した。 E2.75胚は、シナプス小胞タンパク質2（SV2）-GFPのATOH1 :: CreをエンハンサーとPBトランスポザーゼ（ 図1BIII）と一緒にレポータープラスミド^16,17、でエレクトロポレーションした。この方法は、DA1軸索末端のシナプス小胞にGFPレポーターの発現を可能にします。小脳は、E13.5で切片であった一般的なプレシナプスマーカーシナプトタグミン^18,19、同様とプルキンエ層（ 図3A、3B）をラベルカルビンジンで染色した。 SV2-GFP ⁺シナプス小胞は、小脳のDA1後脳ニューロンのシナプス結合を示す、プルキンエ層を含む複数の小脳地域で検出された。

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図1（A）E2.75ニワトリ後脳内エレクトロポレーション技術のイラスト（B）条件付きで後脳DA1介在ニューロンを標識するために使用されるプラスミドのスキーム、（I）：コンストラクトのCre-リコンビナーゼcDNAの上流にクローニングしたATOH1エンハンサー要素を含む転写STOPカセットがCAGGエンハンサー/プロモーターモジュールおよび細胞質GFP遺伝子（CGFP）との間に挿入されたプラスミドと条件レポーター。 DA1ニューロンにおけるGFPの条件式がATOH1によって駆動さ:: Creを（II）：。恒常後脳の細胞を標識するためにpiggyBacを転置法。構築は、プラスミドATOH1 :: Creをエンハンサー、CRE-条件レポーターカセット、ミリストイル化​​GFP（MGFP）は2 PBアーム（PB-CAG-のLoxP-STOPLoxP-MGFP-PB）の間にクローニングされている、とPBASEのトランスポザーゼプラスミドが含まれています。ザDA1神経細胞のゲノムへのレポーターカセットの統合はCAG :: PBASEおよびATOH1 :: Creのベクトルによって駆動される。 （III）：後脳ニューロンのシナプス標的にラベルを付けるために同様piggyBacを転置法。プラスミドCRE-条件記者は2 PBアーム（PB-のLoxP-STOP-のLoxP-SV2-GFP-PB）との間で挟まれたシナプスSV2-GFPを含む。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。 DA1ニューロンの軸索軌道（）：。E4.5後脳のフラットマウントの準備には、2つの昇順DA1軸索路を（緑の矢印）を示しています。 neurofillamentマーカー3A10（赤）rhombomere境界をマークするために使用されます。 （B）矢E13.5胚の小脳のセクションには、小脳に蓄積DA1軸索（緑）を示しています。 EGL細胞はZic1（赤）で標識されています。 EGL、外顆粒層は、スケールバーはマークされます。

図3。 DA1介在ニューロンのシナプス標的（）：。ラベル核にプルキンエ層およびDAPI（青）をマークするカルビンジンとE13.5小脳染色（ピンク）の矢状セクション。 （B）。 A. SV2-GFPでマークされた領域の高倍率ビューがDA1シナプスをラベル（緑）小脳のプルキンエ層（ピンク）に示されている。一般的な前シナプスマーカーシナプトタグミン（赤）SV2-GFP ⁺シナプス（イエロー、矢印）と共発現される。 CALB、カルビンジン、Sタグ、シナプトタグミン。スケールバーはマークされています。

Discussion

OVOエレクトロポレーションでひよこ神経系の発達の間に²⁰セルの仕様と軸索ガイダンスを検査するために、実現可能な信頼性の高い、効果的なツールです。このプロトコルでは、特定のニューロンの条件付きラベルを有効にエンハンサーエレメントを使用してE2.75でニワトリ後脳におけるエレクトロポレーションのモードを説明します。この戦略は、胚発生の高度な段階で軸索経路、予測とシナプスのサイトの追跡可能ニワトリゲノムに外来遺伝子を挿入するためにpiggyBacを媒介転置システムと組み合わされています。

ニワトリ後脳におけるラベル軸索/シナプス前の方法は実験^21-23をラベルまたは移植古典逆行や順行性染料が含まれていた。これらの研究は、軸索路を昇順と降順の後脳の重要な発見を提供してくれました。しかし、いくつかの軌道と予測は、これらの細胞のアプローチが見落としていた。 ADDITでイオン、報告funiculusの複数形に投影ニューロンのサブグループの分子身元が明らかにすることができませんでした。当社組み合わせエレクトロポレーションの方法と遺伝トレースを持続的には軸索ナビゲーションと投影目標¹⁰にそれらの仕様の段階から選択された後脳ニューロンの開発をフォローする独自の機能を提供します。特に、我々のアプローチは、以前の時間^8,9の短い期間の脊髄背側のニューロンの軸索軌道をトレースするために適用された。

説明するツールはまた、軸索投射を支配する分子機構を明らかにするために役立つことができる、遺伝コードは、（このようなリムホメオドメインコードなど）を選択的に軸索の成長enhancer-Cre/Lox-basedアプローチとインパクトを使用して特定の神経細胞のサブグループで変更されたそして接続が^{8,10を追っ}た。したがって、このプロトコルは、細胞標識のためだけでなく、所望の細胞に遺伝子操作のためだけでなく、役に立つかもしれません。

ve_content ">エレクトロポレーションの利点の1つ卵遺伝子送達方法で 3時間以下のエレクトロ²⁴内にすでに観察された式の速さ、そのままですが、後の発達における細胞分裂と離れて導入遺伝子のフェードの一過性発現ステージ。我々は卵遺伝子挿入に用piggyBacを転置法を利用したこのツールは、従来の方法に比べて、エレクトロポレーションした後、ずっと進行した段階のための堅牢な方法で、軸索とシナプスの追跡を可能にします。我々は簡単に検出できるように、この制限をオーバーライドすることエレクトロポレーション（E14.5）後12日以内にニューロンまでラベル、それも孵化した後も含め、時間の長い期間のためのこのアプローチを使用することが極めて妥当である。

空間的および時間的制限の方法で細胞の一方的なターゲティングにひよこ神経管エレクトロリレーのもう一つの利点。これはBの軸索軌道をトレースすることができます哺乳類に従うことが困難であるステージでステージごとに後脳のOTH側面。これは主に一方的な投影をトレースするとIPSIと対側軸索路の原点の間に分離する機能を複雑にし、両方の神経管の両側に所望の細胞を標識するために生殖系列遺伝子導入結果です。最終的には、マウスやニワトリ脳幹ニューロン^3,5間に高度の相同性に基づいて、我々の手法は、配線や開発脊椎動物の後脳のニューロンのアセンブリ上に新しい知識を得るための強力なツールを提供します。

本手法の利点にもかかわらず、ニワトリ神経管のレポーター遺伝子の条件的発現を駆動するためのエンハンサーエレメントの使用量はエンハンサー-GFP構築物の発現の細胞特異性およびタイミング慎重な評価を必要とし、いくつかのエンハンサーエレメントの導入で発見された私たちのシステムはいくつかのに対し、後脳におけるGFPの非制限された発現を駆動する他の非特異的早期に式ではなく、遅く、神経管段（データは示さず）を得た。さらに、我々の戦略は、現在のところ、レポーター遺伝子の時間的な特異的発現をサポートしていません。したがって、我々は、おそらく異なる小脳領域をターゲットにするために、異なる軸索路を投影することがDA1ニューロンの初期以降生まれのサブグループを区別することはできません。一時的に後脳ニューロンにGFPの発現をオン/オフを切り替えるには、追加ツールの遺伝的構造は、より正確に、胚/成人脳幹における軸索軌道とシナプスの開発をフォローすることは有益であろう。最後に、我々のエレクトロポレーション戦略の技術的な欠点は、卵、血管やエンベロープ膜内での位置に起因しE2.75-3を超えた段階で、この操作に胚の到達不能です。この制限は、開発の後半に生まれて後脳ニューロンの追加のサブタイプに当社のプラスミドのターゲティングを防ぎます。