Elektroporering av hindbrain att spåra axonal Trajectories och Synaptic Mål i Chick Embryo

Summary

Hur neuronala nätverk är etablerade i den embryonala hjärnan är en grundläggande fråga i utvecklingspsykologi neurobiologi. Här har vi kombinerat en elektro teknik med nya genetiska verktyg, såsom Cre / Lox-plasmider och piggyBac-medierad DNA införlivande systemet i aviär hindbrain att märka rygg interneurons och spåra sina axonal prognoser och synaptiska mål på olika utvecklingsstadier.

Abstract

Elektroporering av chick embryonala neuralröret har många fördelar såsom att vara snabb och effektiv för uttryck av främmande gener i neuronala celler. I detta manuskript ger vi en metod som visar entydigt hur man electroporate DNA i aviär hindbrain vid E2.75 i syfte att specifikt märka en delmängd av neuronala stamceller, och hur man kan följa sina axonal prognoser och synaptiska mål på mycket avancerade stadier av utveckling, upp till E14.5. Vi har använt nya genetiska verktyg inklusive specifika enhancerelement, Cre / Lox - baserade plasmider och piggyBac-medierad DNA införlivande systemet för att driva GFP uttryck i en subtyp av hindbrain celler (den dorsala mest undergrupp av interneuronen, DA1). Axonal banor och mål DA1 axoner följs på tidiga och sena embryonala stadier vid olika hjärnstammen regionerna. Denna strategi bidrar avancerade tekniker för att rikta celler av intresse för den embryonala hindbrain och för trasiering krets bildas på flera stadier av utveckling.

Introduction

Bakhjäman representerar en viktig relä navet i nervsystemet genom att kommunicera mellan de centrala och perifera nervsystemet via stigande och fallande neuronala nätverk. Det reglerar grundläggande funktioner, inklusive andning, medvetande, hörsel och motorik ^1-3. Under tidig fosterutveckling, är ryggradsdjurens hindbrain transient uppdelad längs dess anterior-posterior (AP) axeln i repetitiva rhombomeres, där distinkta neuronala celltyper bildas och generera flera hjärnstammen kärnor centra ^4. Bakhjäman är också uppdelad längs dess rygg-ventrala (DV) axeln i en basal och Alar plattan, där diskreta neuronala stamceller blir specificeras och differentiera i distinkta DV platser ^3,5,6. Hur tidigt AP och DV-specifika neuronala mönster som styr inrättandet av funktionella hjärnstammen circuitries är i stort sett okända.

Att få kunskap om denna grundläggandeFrågan är verktyg som krävs för att märka specifika delmängder av nervceller i den tidiga hindbrain och att spåra deras axonal banor och anslutningsmöjligheter på högre stadier. Vi har tidigare utnyttjat specifika förstärkarelement, och en Cre / LoxP-baserat villkorligt uttryck system för att följa axonal bana dorsala spinal interneuronen i början kycklingembryo ^7-9. I den aktuella manuskriptet vi har riktat bakhjäman och uppgraderade den experimentella paradigm för märkning sena embryonala hindbrain interneurons, axoner och deras synaptiska mål, med hjälp av en modifierad elektroporering strategi och piggyBac - medierad DNA införlivandet. Vår nya strategi tillåter taggning av distinkta neuronala subtyper i ena sidan av bakhjäman och spårning av deras axonal prognoser och synaptiska ställen vid olika embryonala stadier, från 2 upp till 12 dagar efter elektroporering. Baserat på denna metod, märkt vi den dorsal-mest undergrupp av hindbrain intemeuroner (dA1/Atoh1 ⁺ 10.

Kombinationen av chick elektroporation, genetisk spårning av nervceller och analys av projektion ställen vid mycket avancerade stadier av utveckling ger en unik plattform för att studera bildningen av neuronala nätverk i hjärnan och att klarlägga molekylära mekanismer som styr krets bildas.

Protocol

Ett. Hindbrain Elektroporering

1,1 Egg hantering

1. Placera äggen horisontellt i en fuktad inkubator (37-38,5 ° C). Embryon elektroporeras efter 65-70 h inkubation, när de når 16-17 (HH) stadium (25-30 somiter).
2. Ta äggen ur inkubatorn, de förblir i horisontellt läge.

1,2 Beredningar

1. Drag glaskapillärer (0,5 mm diameter).
2. Anslut böjda L-formade guld Genetrodes elektroder (3 mm diameter) med en adapter hållare till pulsgeneratorn. Elektroporering parametrar inkluderar 25 volt, 5 siffror puls, 45 ms pulslängd, 300 ms puls intervall.
3. Förbered en mun pipett 10 ml spruta nål, parafilm remsor, en mjuk borste, vassa dissekera sax och 25 ml steril PBS-lösning. Detta belopp är oftast tillräcklig för att hantera ett ägg bricka (18 ägg).
4. Förbered en adekvat blandning av DNA-plasmider (5 pg / pl vardera) ochtillsätt cirka 0,025% Fast Green färgämne för att visualisera DNA-injektion. Vanligtvis en volym av 4 pl är tillräcklig för injektion av en bricka.

1.3 Fönstring, Injection och elektroporation

1. Rengör äggskal med 70% etanol.
2. Handtag ett ägg i taget för att minimera embryonala exponeringstid för luft.
3. Gör ett hål i ägget polen med sax ändar och ta bort 3-4 ml av albumin med sprutan. Ta inte en större mängd albumin eftersom det minskar lönsamheten.
4. Öppna ett litet ovalt fönster (2,5 x 2 cm storlek) i övre mitten av äggskal med hjälp av dissekera sax.
5. Droppa några droppar PBS på toppen av embryot för att förhindra torrhet under hela processen.
6. Fyll på en liten mängd av DNA-blandningen in i glas kapillär med användning av en mun pipett.
7. Placera embryo med sin bakre ände mot dig. Inget bläck injektion krävs i detta skede eftersom embryot syns tydligt. Att undvika ökningar bläck injektionembryonal överlevnad. Penetrera caudal hindbrain genom att hålla kapillären vid ~ 45 °. Ta inte bort någon membran från runt embryot. Injicera DNA lösningen försiktigt i bakhjäman lumen och andas utan att bilda luftbubblor. DNA-lösning sprider anteriort.
8. Omedelbart efter DNA-injektion, placera parallella elektroder på exakt AP och DV hindbrain positionen du syftar till att rikta. Tryck elektroderna något ventralt utan att vidröra hjärtat, eftersom det kan minska lönsamheten. Puls elektroporator. Elektroderna bör täckas med bubblor för att indikera elektriska ledningsförmågan (Figur 1A).
9. Ta försiktigt bort elektroderna och droppa några droppar PBS att kyla embryot och att ta bort bubblor. Täta ägget öppnar ordentligt med en parafilm remsa för att förhindra uttorkning under inkubationstiden. Tvätta elektroderna i PBS med mjuk borste.
10. Placera ägget i inkubator under önskad tidslängd. Överlevnad av embryon är cirka 90% 2-3 dagar efterelektroporering, minskar och upp till 50% 12 dagar efter elektroporering.

2. Analys av embryon

2.1 Flat-mount förberedelse och immunofluorescens

1. Platt-mount preparat av hindbrain kan utföras upp till E6.5 att enkelt visualisera axoner under ett mikroskop eller en stereo-mikroskop.
2. Dissekera embryot försiktigt genom att den separeras från omgivande membran och blodkärl. Placera embryo i ett litet silikon - belagd petriskål med PBS. Fäst embryot till skålen med volfram stift vända dorsalt. Utför en rygg slits i bakhjäman tak-platta med skarpa glaskapillärer.
3. Med vassa pincett och mikro-sax håller den övre delen av huvudet och dra bakhjäman vävnaden mycket noga från rostralt till stjärtfenan. Efter separering av hindbrain avhjälpa återstående ventrala vävnader för att nå en ren beredning.
4. Inkubera hindbrain med fyra% Paraformaldehyd (PFA)-lösning under 1-2 timmar vid rumstemperatur (RT). Tvätta hindbrain med PBT (PBS/0.1% Triton X-100) för avlägsnande av PFA.
5. För Immunfluorescens i platt-monterade hindbrains tillsätt 500 pl blockeringslösning (5% av getserum i PBT och inkubera i 2 h vid RT Inkubera med en ^st antikropp PÅ vid 4 ° C. Tvätta med PBT (15 min x 3). Inkubera med ^{2: a} antikropp under 2 h vid RT. Tvätta med PBT (15 min x 3).
6. Placera hindbrain inför dorsalt på en glasskiva. Lägg fluorescerande montering media på hindbrain. Använd glaskapillärer eller nålar volfram att platta bakhjäman på bilden.
7. Lägg liten mängd fett i varje hörn för att förhindra klämning av vävnaden genom locket halka. Placera försiktigt ett täckglas ovanpå hindbrain och undvika luftbubblor. För följsamhet lägga nagellack för att täcka glas kanter.

2.2 Cryo-sektioner och Immunofluorescence

1. Cryo-delar av hjärnstammen can utföras i något skede att visualisera axonal banor. Ändå efter E6.5 detta bör vara den föredragna metoden på grund av svårigheten att visualisera axoner i systemet för fast monterad embryo, som blir för tjock. Dessutom kräver demonstration av synapser sektionering av vävnaden och en hög-förstoring vy under ett mikroskop.
2. Dissekera embryot och ta bort alla omgivande vävnader. Skölj med PBS. Skär embryot vid caudal delen av medulla använda mikro-sax och vassa pincett. Gör ett stort snitt mellan lillhjärnan och mellanhjärnan och ta bort hela hjärnstammen. Vävnaden bör innehålla märgen, pons och cerebellum.
3. Fäst hjärnstammen i 4% PFA över natten (ON) vid 4 ° C, sköljning med PBS (10 min x 3), och inkubera med 30% sackaros för TILL vid 4 ° C tills sjunka.
4. Bädda hindbrain i en Cryo-form med oktober (Optimal Cutting Temperature)-förening, och placera den vid -20 ° C fram till frysning, såsom beskrivs på annan plats ^11.
5. Torka glasen. Tillsätt 100 | il blockerande lösningen på varje objektglas under 2 timmar vid RT. Lägg 100 pl av antikroppar (utspädd i den blockerande lösningen till den önskade koncentrationen). Inkubationstiden för ^{1: a} och 2-antikroppar ^nd är PÅ vid 4 ° C eller 2 timmar vid rumstemperatur, respektive. För varje inkubationstid, försiktigt lägga parafilm remsa ovanpå bilden för att förhindra torrhet. Tvätta med PBS (10 min x 3) mellan antikroppar. Om det behövs, tillsätt 1:1,000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenylindol), utspädd i PBS under 20 min vid rumstemperatur. Skölj med PBS.
6. Montera bilden med fluorescerande montering media. Låt torka under 1 h före analys.

Representative Results

Detta protokoll användes nyligen för att avslöja axonal mönster och platser projektion av DA1 undergrupp av interneuronen i chick hindbrain ^10. För att specifikt märka dessa axoner, var ett förstärkarelement (Atoh1), som tidigare har betraktats som specifika för spinal DI1 nervceller ^8,12,13, bekräftade att uttryckas i hindbrain DA1 celler ^10. Elementet klonades uppströms till Crerekombinas och co-elektroporerades vid E2.75 tillsammans med en Cre beroende cytoplasma GFP reporter plasmid (pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP, Figur 1BI). Hindbrains analyserades 48 timmar efter elektroporering med platt-mount förberedelse och avslöjade två contra-laterala uppstigande axonal projektion mönster (Figur 2A), en tarmkanalen var uteslutande härrör från DA1 neuron belägna vid rhombomeres 6-7 som långsträckta i en dorsal funiculus, medan andra härstammar från rhombomeres 2-5 och förlängdes i en lateral funiculus.

14,15. En reporter Cre-villkorlig-myristoylerade-GFP (mGFP) kassett, klonad mellan de två PB armarna (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB), elektroporerades vid E2.75 tillsammans med Atoh1 :: Cre förstärkare och nämnda transposas vektorn (CAG :: PBase). I denna strategi är electroporated Cre-villkorlig mGFP integreras i chick kromosomer och därmed STOP kassetten avlägsnas endast i DA1 nervceller, som möjliggör långvarig uttryck av GFP i DA1 celler (Figur 1BII, ^10). Den myristoylerade formen av GFP tjuder det till membranet så att den är lokaliserad längs den axonal membranet i stället för att spädas i cytoplasman. Celler från hjärnstammen uppsamlades vid E13.5 och analyseras i sagittala sektioner (Figur 2B). DA1 axoner befanns ackumuleras i lillhjärnan och att sträcka sig mot den yttre gr ringformig skikt (EGL), som präglas av Zic1 ⁺ celler.

Synaptic mål för DA1 axoner i lillhjärnan analyserades också. E2.75 embryon elektroporerades med synaptic vesikelprotein 2 (SV2)-GFP reporter plasmid ^16,17, tillsammans med Atoh1 :: Cre förstärkare och PB transposaset (figur 1BIII). Denna metod gör att uttrycket av GFP reporter i de presynaptiska vesiklar av DA1 axonala termini. Lillhjärnan sektionerades vid E13.5 och färgades med den allmänna presynaptiska markör synaptotagmin ^18,19, liksom med calbindin som märker den Purkinje skiktet (figurerna 3A, 3B). SV2-GFP ⁺ synaptiska vesiklar upptäcktes i flera cerebellära regioner, inklusive Purkinje lagret, ange synapsförbindelser av DA1 hindbrain interneurons i lillhjärnan.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Figur 1 (A) Illustration av elektroporation tekniken i E2.75 chick hindbrain (B) har omfattats av plasmider som används för att villkorligt märka hindbrain DA1 interneurons, (I):.. Konstruktioner inkluderar Atoh1 förstärkarelementet klonad uppströms till Cre-rekombinas cDNA och en villkorad reporterplasmid, i vilken en transkriptionell STOPP kassetten införes mellan CAGG förstärkare / promotor-modulen och den cytoplasmatiska GFP-genen (cGFP). Den villkorade uttryck av GFP i DA1 neuroner drivs av Atoh1 :: Cre (II):. Det piggyBac införlivande metod för att konstitutivt märka hindbrain celler. Konstruktioner inkluderar Atoh1 :: Cre förstärkare plasmid, en Cre-villkorlig reporter kassett, i vilken myristoylerade GFP (mGFP) klonas mellan två PB armar (PB-CAG-LoxP-STOPLoxP-mGFP-PB) och en Pbase transposas plasmid. Denintegrering av rapportörgenen kassetten in i genomet hos DA1 neuroner drivs av CAG :: PBase och Atoh1 :: Cre vektorer. (III): En liknande piggyBac införlivande metod att märka synaptiska mål för hindbrain interneuroner. Cre-villkorlig reporter plasmid innehåller en synaptisk SV2-GFP flankerad mellan två PB armar (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Axonal banor DA1 interneurons (A):. En platt-monterade beredning av E4.5 hindbrain visar två stigande DA1 axonal skrifter (grön, pilar). Den neurofillament markör 3A10 (röd) används för att markera rhombomere gränser. (B) En sagittaldelen av lillhjärnan av E13.5 embryo visar DA1 axoner (grön) ansamlas i lillhjärnan. De EGL blodkroppar märks med Zic1 (röd). EGL, Extern Granulat Layer, är Scale bar märkt.

Figur 3. Synaptic mål för DA1 interneurons (A):. En sagittalsnitt av E13.5 lillhjärnan färgas med Calbindin (rosa) till märket Purkinje skikt och DAPI (blå) till etiketten kärnor. (B). En högre förstoring bild av det markerade området i A. SV2-GFP märkt DA1 synapser (grön) visas i Purkinje skiktet av lillhjärnan (rosa). Den allmänna presynaptiska markör synaptotagmin (röd) är co-uttrycks med SV2-GFP ⁺ synapser (gul, pilar). CALb, Calbindin, S-Tag, synaptotagmin. Skala barer är markerade.

Discussion

I ovo elektroporering är en genomförbar, pålitligt och effektivt verktyg för att undersöka cell specifikation och axonal vägledning under chick nervsystemets utveckling ^20. I detta protokoll beskriver vi ett läge av elektroporering i chick hindbrain vid E2.75 hjälp enhancerelement som möjliggör villkorliga märkning av särskilda interneurons. Denna strategi kombineras med piggyBac-medierad införlivande systemet sätta in främmande gener i chick-genomet, vilket möjliggör spårning av axonal vägar, projektioner och synaptiska platser i avancerade stadier av fosterutvecklingen.

Tidigare metoder att märka axoner / synapser i chick hindbrain ingår klassiska bakåtsträvande eller anterograd färgämne etikettering eller ympning experiment ^21-23. Dessa studier bidrar med betydande fynd på hindbrain stigande och fallande axonala trakter. Men vissa banor och prognoser förbises av dessa cellulära metoder. I addit ion, kunde molekylära identiteter undergrupper av nervceller som projiceras in i den rapporterade Funiculi inte avslöjas. Vår kombinerade metod för elektroporering och ihållande genetisk spårning ger en unik förmåga att följa utvecklingen av utvalda hindbrain nervceller från deras specifikation stadier till axonal navigering och mål utsprånget ^10. Noterbart var vår inställning som tidigare tillämpats för att spåra axonal banor spinal interneurons sladd rygg för kortare tidsperioder ^8,9.

De beskrivna verktygen kan också tjäna till att avslöja molekylära mekanismer som styr axonal prognoser, genetiska koder (t.ex. Lim homeopatika-domän-kod) var selektivt modifieras i en viss neuronal undergrupp med enhancer-Cre/Lox-based synsätt och påverkan av axonal tillväxt och anslutningsmöjligheter följdes ^8,10. Därför kan detta protokoll vara användbara inte bara för cellmärkning men också för genetiska manipulationer på önskade celler.

ve_content "> En av fördelarna med elektroporation som en in ovo genleverans metoden är snabbheten i uttrycket, som observeras redan inom 3 timmar efter elektroporation ^24. dock övergående uttryck av den införda genen bleknar bort med celldelningar vid senare utvecklande stadier. vill åsidosätta denna begränsning vi gjort användning av piggyBac införlivande metod för in ovo geninfogning. Verktyget möjliggör spårning av axoner och synapser på ett robust sätt för mycket avancerade stadier efter elektroporering, jämfört med tidigare metoder. Som vi lätt kunde upptäcka märkta nervceller upp till 12 dagar efter elektroporation (E14.5), är det mycket rimligt att använda denna metod även för längre tidsperioder, även efter kläckningen.

En annan fördel med Chick Neural reläerna rör elektropora på ensidiga inriktning av celler i en rumslig och tidsmässig begränsade sätt. Detta möjliggör spårning axonal banor på bÖvr sidor hindbrain i ett steg-för-steg basis, vilket är svårare att följa i däggdjur. Detta beror främst på könsstamceller transgenes resulterar i märkning av önskade celler i båda neuralrörsdefekter sidor, komplicerar möjligheten att spåra ensidiga prognoser och skilja mellan ursprung ipsi och kontraindikationer laterala axonal trakter. Ytterst bygger på hög grad av homologi mellan möss och chick hjärnstammen nervceller ^3,5, ger vår teknik ett kraftfullt verktyg för att vinna ny kunskap om montering av ledningar och nervceller i utvecklingsländerna ryggradsdjur hindbrain.

Om än fördelarna med vår teknik, till användningen av enhancerelement köra villkorligt uttryck av reporter gener i chick neuralrörsdefekter kräver noggrann utvärdering för cell-specificitet och tidpunkten för expression av förstärkare-GFP konstruktioner, införande av vissa enhancerelement hittades i vårt system för att köra ett fritt uttryck av GFP i hindbrain, medan någraandra gav ett icke-specifikt uttryck på tidigt, men inte sent, neuralrörsdefekter stadier (data visas ej). Dessutom har vår strategi för närvarande inte stödja en temporal-specifikt uttryck av reportergenen. Därför kan vi inte skilja mellan tidig eller senare födda undergrupper av DA1 intemeuroner, vilket eventuellt kan projicera olika axonal områden att rikta tydliga cerebellär områden. Genetisk konstruktion av ytterligare verktyg för att tillfälligt slå på / stänga av uttryck av GFP i hindbrain nervceller kommer att gynna följa mer noggrant utvecklingen av axonal banor och synapser i den embryonala / vuxen hjärnstammen. Slutligen är en teknisk nackdel med vår elektroporation strategi otillgänglighet av embryot till denna manipulation på skeden bortom E2.75-3, på grund av sin ställning i ägget, blodkärl och omgivande membran. Denna begränsning hindrar inriktningen på våra plasmider i ytterligare subtyper av hindbrain nervceller som är födda senare i utvecklingen.