Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Published: May 29, 2013 doi: 10.3791/50136
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Abstract

Piliç embriyonik nöral tüpün elektroporasyon gibi nöronal hücrelerde yabancı genlerin sentezlenmesi için hızlı ve verimli olması gibi birçok avantajı vardır. Bu yazıda biz, özel olarak nöronal ataları bir alt etiket için E2.75 de kuş Beyin içine DNA electroporate nasıl benzersiz gösteriyor yöntemi ve ne gelişme çok ileri evrelerde kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri takip etmek sağlamak kadar E14.5 için. Tabanlı plazmid ve arka beyin hücreleri (internöronlar, dA1 dorsal en alt grubu) bir alt GFP ifade sürücü piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi - Biz özel resim geliştirme elemanları, Cre / Lox dahil olmak üzere yeni genetik araçları kullanmış olurlar. Aksonal yörüngeleri ve dA1 akson hedefleri çeşitli beyin bölgelerinde erken ve geç embriyonik aşamalarında takip edilmektedir. Bu strateji embriyonik Beyin ilgi hücreleri hedef için ve tra için gelişmiş teknikler katkıdagelişim çeşitli aşamalarında devre oluşumu dans ediyorum.

Introduction

Beyin artan ve nöron ağları inen ile merkezi ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişim kurarak sinir sisteminin önemli bir röle merkezi temsil eder. Bu solunum, bilinç, işitme ve motor koordinasyon 1-3 gibi temel fonksiyonlarını düzenler. Erken embriyonik gelişimi sırasında, omurgalı Beyin geçici farklı nöronal hücre tipleri oluşan ve çoklu beyin sapı çekirdekleri merkezleri 4 oluşturmak olduğu tekrarlayan rhombomeres, içine ön-arka (AP) ekseni boyunca bölünmüştür. Beyin de ayrık nöronal ataları belirtilen olmak ve farklı DV yerlerde 3,5,6 ayırt hangi bir bazal ve alar plaka, içine dorsal-ventral (DV) ekseni boyunca ayrılmıştır. Erken AP ve DV özel nöronal modelleri fonksiyonel beyin devrelerin kurulması yöneten nasıl büyük ölçüde bilinmemektedir.

Bu temel üzerinde bilgi sahibi olmaksoru, araçları erken Beyin nöronların belirli alt etiketlemek için ve daha ileri aşamalarında kendi aksonal yörüngeleri ve bağlantı takip etmek için gereklidir. Daha önce özel resim geliştirme elemanları kullanılan ve erken civciv embriyo 7-9 dorsal spinal internöron aksonal yörünge takip etmek için Cre / LoxP tabanlı koşullu ifade sistemi var. Mevcut yazıda; Beyin hedef ve değiştirilmiş bir elektroporasyon stratejisi ve piggyBac kullanarak, geç embriyonik arka beyin internöronlar, akson ve sinaptik hedefleri etiketleme için deneysel paradigma yükseltilmiş - aracılı DNA aktarılması. Yeni strateji 2 en fazla 12 gün arka beyin ve aksonal projeksiyonlar ve çeşitli embriyonik aşamalarında sinaptik sitelerin takibi bir tarafında belirgin nöronal alt tiplerinin etiketleme, elektroporasyon takip sağlar. Bu yöntem dayanarak, arka beyin internöronlar dorsal-en alt (dA1/Atoh1 + etiketli 10 çok katmanlı form sinaps bulunmuştur.

Civciv elektroporasyon kombinasyonu, genetik nöronlar ve gelişme çok daha ileri aşamalarında projeksiyon sitelerinin analiz izleme beyindeki nöronal ağların oluşması ile çalışma ve devre oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için benzersiz bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beyin Elektroporasyon

1.1 Yumurta taşıma

  1. Nemlendirilmiş bir inkübatör (37-38,5 ° C) yatay olarak yumurta yerleştirin. Embriyolar onlar 16-17 (HH) evre (25-30 Somitlerin) ulaştığınızda, inkübasyon 65-70 saat sonra electroporated vardır.
  2. Inkübatör yumurta kaldırmak, onlar yatay konumda kalır.

1.2 Hazırlıklar

  1. Cam kılcal (0.5 mm çapında) çekin.
  2. Puls üreteci için bir adaptör sahibi ile bükülmüş L şeklinde altın Genetrodes elektrotlar (3 mm çapında) bağlayın. Elektroporasyon parametreleri 25 volt, 5 darbe sayısının, 45 msn darbe uzunluğu, 300 msn darbe aralıklarla içerir.
  3. Bir ağız pipet, 10 ml şırınga iğnesi, parafilm şeritler, yumuşak bir fırça, keskin diseksiyon makas ve 25 ml steril PBS çözeltisi hazırlayın. Bu miktar genellikle yumurta kabı (18 yumurta) işlemek için yeterlidir.
  4. DNA plazmid yeterli bir karışımı (5 mg / ml her biri) hazırlayın veDNA enjeksiyon görselleştirmek için 0.025% Hızlı Yeşil boya hakkında ekleyin. Ortalama 4 ul bir hacmi bir tepsi enjeksiyon için yeterlidir.

1.3 Pencereleme, Enjeksiyon ve Elektroporasyon

  1. % 70 etanol ile yumurta kabukları temizleyin.
  2. Havaya embriyonik maruz kalma süresi en aza indirmek için her seferinde bir yumurta tutun.
  3. Makas uçları ile yumurta kutbunda bir delik açın ve şırınga ile albumin 3-4 ml kaldırın. Bu canlılığı azaltır olarak albümin daha büyük bir miktarda çıkarmayın.
  4. Diseksiyon makas kullanarak yumurta kabuğu üst merkezinde küçük bir oval pencere (2,5 x 2 cm boyutlarında) açın.
  5. Tüm süreç boyunca kuruyana önlemek için embriyonun üst PBS birkaç damla damla.
  6. Bardağa DNA karışımı, az miktarda yük bir ağız pipet kullanarak kılcal.
  7. Eğer yönelik arka ucu ile embriyo yerleştirin. Embriyo açıkça görünür olduğu gibi mürekkep püskürtme bu aşamada gereklidir. Mürekkep püskürtme artar kaçınmakembriyonik hayatta. ~ 45 ° kılcal tutarak kuyruk arka beyin nüfuz. Embriyo etrafında herhangi bir membran çıkarmayın. Hava kabarcığı oluşturmadan Beyin lümen ve nefes dikkatle DNA çözümü enjekte edilir. DNA çözüm öne yayılır.
  8. Hemen DNA enjeksiyonu sonrası, kesin AP ve hedef hedefliyoruz DV Beyin pozisyonda paralel elektrotlar yerleştirin. Bu canlılığı azaltabilir gibi, kalp dokunmadan biraz ventral elektrotlar itin. Elektroporatör darbe. Elektrotlar (Şekil 1A) elektriksel iletkenlik belirtmek için kabarcıkları ile örtülmelidir.
  9. Dikkatlice elektrotlar ve embriyo soğutmak için ve kabarcıklarını çıkarmak için PBS birkaç damla damla. Inkübasyon sırasında kurumasını önlemek için bir parafilm şeridi düzgün açılması yumurta Seal. Yumuşak bir fırça ile PBS içinde elektrotlar yıkayın.
  10. Istenen zaman uzunluğu için inkübatör yumurta yerleştirin. Embriyoların hayatta kalma 2-3 gün sonra yaklaşık% 90elektroporasyon, ve 50% elektroporasyon takip eden 12 gün öncesine kadar azaltır.

2. Embriyolar Analizi

2.1 Düz montaj hazırlanması ve immunofloresan

  1. Beyin düz-montaj hazırlıkları kolayca bir mikroskop ya da stereo-mikroskop altında aksonlar görselleştirmek için E6.5 kadar yapılabilir.
  2. Zarlarında ve kan damarları ayrılarak dikkatlice embriyo ayır. PBS içeren kaplı Petri kabı - küçük bir silikon embriyo yerleştirin. Dorsal karşı karşıya tungsten işaretçilerine ile çanak embriyo takın. Beyin keskin cam kapilerleri kullanarak çatı plakalı bir dorsal yarık gerçekleştirin.
  3. Keskin cımbız ve mikro-makas kullanılarak başın üst kısmını tutun ve rostral gelen kaudal çok dikkatli bir şekilde arka beyin dokusu çekin. Beyin ayrılmasından sonra temiz bir hazırlık ulaşmak için kalan ventral doku çıkarın.
  4. 4 Beyin inkübeOda sıcaklığında 1-2 saat boyunca% paraformaldehid (PFA) çözeltisi (RT). PFA kaldırmak için PBT (PBS/0.1% Triton X-100) ile arka beyin yıkayın.
  5. Düz monte hindbrains içinde İmmünofloresan için engelleme çözüm 500 ul (4 ON 1. antikor ° PBT ile C Yıkama (15 dakika x 3) ile oda sıcaklığında inkübe az 2 saat PBT ve inkübe keçi serumu% 5 ekleyin. Inkübe oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 nci antikor ile. PBT (15 dakika x 3) ile yıkayın.
  6. Bir cam slayt dorsal bakan arka beyin yerleştirin. Beyin üzerine floresan montaj medya ekleyin. Slaytta arka beyin düzleştirmek için cam kapiller veya tungsten iğne kullanın.
  7. Kapak kayma ile doku sıkma önlemek için her köşesinde yağ az miktarda ekleyin. Beyin üstüne bir kapak kayma dikkatlice yerleştirin ve hava kabarcıkları kaçının. Yapışma için cam kenarlarını kaplayacak şekilde tırnak cilası ekleyin.

2.2 Cryo-bölümleri ve İmmünofloresan

  1. Beyin sapı ca Cryo-bölümlerin aksonal yörüngeleri görselleştirmek için herhangi bir aşamada gerçekleştirilebilir. Ancak, E6.5 sonra bu çok kalın olur düz monte edilmiş embriyo, içinde aksonlar görselleştirmek için zorluk nedeniyle tercih edilen yöntem olmalıdır. Ayrıca, sinaps gösteri doku ve mikroskop altında bir yüksek büyütme bakış kesit gerektirir.
  2. Embriyo incelemek ve tüm çevre dokulara çıkarın. PBS ile durulayın. Mikro-makas ve keskin cımbız kullanarak medulla kuyruk kısmında embriyo kesin. Beyincik ve orta beyin arasında geniş bir kesi yapmak ve tüm beyin sapı çıkarın. Doku medulla, pons ve beyincik içermelidir.
  3. PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın, 4 gece için% 4 PFA (ON) ° C beyin sapı düzeltmek ve ON 4 ° C batan kadar% 30 sakaroz ile kuluçkaya yatmaktadır.
  4. OCT (Optimal Kesme Sıcaklık) bileşik bir cryo-kalıp Beyin Embed ve dondurma gibi başka bir yerde 11 açıklandığı kadar -20 ° C'de yerleştirin.
  5. Slaytlar kurulayın. Oda sıcaklığında 2 saat için her bir slayt üzerine 100 ul blokaj solüsyonu eklenir. Antikor 100 ul (istenen konsantrasyonu için engelleme çözeltisi içinde seyreltilmiş) ilave edilir. 1. ve 2. antikorlar için kuluçka süresi 4 de AÇIK sırasıyla oda sıcaklığında ° C veya 2 saat,. Her inkübasyon süresi için, hafifçe kuruluğu önlemek için slayt üstüne parafilm şeridi ekleyin. Antikorlar arasında PBS (10 dakika x 3) ile yıkayın. Gerekirse, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde 1:1000 seyreltilmiş Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenilindol) ekleyin. PBS ile durulayın.
  6. Floresan montaj medya ile slayt monte edin. Analizden önce 1 saat kurumasını bekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol son zamanlarda civciv Beyin 10 internöron dA1 alt grubu aksonal desen ve projeksiyon siteleri ortaya çıkarmak için kullanıldı. Özellikle bu aksonlar etiketlemek için, önce spinal DI1 nöronlar 8,12,13 için özel olarak karakterize edilmiş bir arttırıcı elemanı (Atoh1), arka beyin dA1 hücreleri 10 olarak ifade edilmesi doğrulandı. Eleman Cre recombinase ve plazmid bir Cre bağımlı sitoplazmik GFP muhabiri (; Şekil 1BI pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP) ile birlikte E2.75 de ortak electroporated için yukarı klonlandı. Hindbrains düz montaj hazırlık 48 saat aşağıdaki elektroporasyon analiz ve iki kontra-yanal artan aksonal projeksiyon modelleri (Şekil 2A) ortaya çıkarılmıştır; bir sistem sadece bir sırt kordon içinde uzamış bu 6-7 rhombomeres bulunan dA1 nöronlar elde edildi, süre diğer rhombomeres 2-5 ve yan kordon genişletilmiştir kaynaklanmıştır.

14,15 uygulanmıştır. İki PB silah (PB-CAG-LoxP-STOP-LoxP-mGFP-PB) arasındaki klonlanmış bir gazeteci Cre-koşullu-miristollenmiş-GFP (mGFP) kaset, Atoh1 ile birlikte E2.75 de electroporated oldu :: Cre arttırıcı ve transposase vektör (CAG :: PBase). Bu stratejide, Electroporated Cre-koşullu mGFP civciv kromozom entegre edilmiştir ve sonuç olarak DUR kaset dA1 hücreleri (Şekil 1BII, 10) GFP uzun süre ifade sağlayan, sadece dA1 nöronlarda kaldırılır. Daha çok, sitoplazma içinde seyreltilmiş daha aksonal zarı boyunca lokalize olduğu gibi membrana GFP iplerini bunun miristollenmiş formu. Brainstems E13.5 toplanır ve sagital kesitler (Şekil 2B) içinde analiz edilmiştir. dA1 aksonlar beyincik birikir ve harici gr doğru uzanan bulunmuştur Zic1 + hücreleri ile işaretlenir anular katmanı (EGL).

Beyincik dA1 akson sinaptik hedefleri de analiz edilmiştir. E2.75 embriyo sinaptik vezikül protein 2 (SV2)-GFP Atoh1 :: Cre arttırıcı ve PB transposase (Şekil 1BIII) ile birlikte plazmid muhabiri 16,17 ile electroporated. Bu yöntem, dA1 aksonal termini presinaptik veziküllerinde GFP raportör ekspresyonu sağlar. Beyincik E13.5 kesitli ve genel pre-sinaptik işaretleyici synaptotagmin 18,19 yanı sıra ile Purkinje katmanı (Şekil 3A, 3B), etiketler kalbindin ile boyandı. SV2-GFP + sinaptik veziküller beyincik dA1 Beyin internöron sinaptik bağlantıları gösteren, Purkinje tabakası dahil olmak üzere birden serebellar bölgelerde tespit edildi.

tp_upload/50136/50136fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50136/50136fig1.jpg "/>
Şekil 1 (A), E2.75 civciv arka beyin içinde elektroporasyon tekniği gösteren örnek (B) arka beyin dA1 internöron şartlı etiketlemek için kullanılan plasmidler Şema (I):.. Oluşumlar kre-rekombinazı cDNA akıntıya klonlanmış Atoh1 arttırıcı bir eleman içerir ve bir transkripsiyonel duruş kaseti CAGG artırıcı / promotor modülünü ve sitoplazmik GFP geninin (cGFP) arasına yerleştirilmiş olduğu plazmit, bir koşullu muhabir. . DA1 nöronlarda GFP koşullu ifadesi ile Atoh1 :: Cre (II) sürülür: yapısal arka beyin hücreleri etiketlemek için piggyBac aktarılması yöntemi. Yapılar plazmid Atoh1 :: Cre Arttırıcı, Kre-koşullu muhabir kaseti, miristollenmiş GFP (mGFP) PB iki kol (PB-CAG-loxP-STOPLoxP-mGFP-PB) arasında klonlanan edildiği ve bir Pbase Transposase plazmid içerir.dA1 nöronların genomuna raportör kasetinin entegre CAG :: PBase ve Atoh1 :: Cre vektörleri ile tahrik edilir. (III): Beyin internöron sinaptik hedefleri etiketlemek için benzer bir piggyBac aktarılması yöntemi. Plazmid Cre-koşullu muhabiri iki PB silah (PB-LoxP-STOP-LoxP-SV2-GFP-PB) arasındaki çevrili bir sinaptik SV2-GFP içerir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. DA1 internöron aksonal yörüngeleri (A):. E4.5 Beyin bir düz monte hazırlık iki artan dA1 aksonal yolları (yeşil, oklar) göstermektedir. Neurofillament işaretleyici 3A10 (kırmızı) rhombomere sınırları işaretlemek için kullanılır. (B) sagitalE13.5 embriyo beyincik bölümünde beyincik biriken dA1 akson (yeşil) göstermektedir. EGL hücreleri Zic1 (kırmızı) ile etiketlenir. EGL, Dış Granül Katman, Ölçek çubuğu işaretlenir.

Şekil 3,
Şekil 3,. DA1 internöron sinaptik hedefleri (A):. Etiket çekirdekleri için işareti Purkinje tabakası ve DAPI için Calbindin ile E13.5 beyincik lekeli bir sagital bölümü (pembe) (mavi). (B). A. SV2-GFP işaretli alana daha yüksek büyütme dA1 sinaps (yeşil) beyincik Purkinje tabakası (pembe) gösterilmiştir etiketli. Genel pre-sinaptik işaretleyici synaptotagmin (kırmızı) SV2-GFP + sinaps (sarı, oklar) ile birlikte ifade edilir. Calb, Calbindin, S-Tag, synaptotagmin. Ölçek bar işaretlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ovo elektroporasyon civciv sinir sistemi gelişimi 20 sırasında hücre özellikleri ve aksonal rehberlik incelemek için uygun bir, güvenilir ve etkili bir araçtır. Bu protokolde özel internöronlar koşullu etiketlenmesini sağlayan güçlendirici elemanlar kullanarak E2.75 de civciv Beyin içinde elektroporasyon bir modunu tanımlamak. Bu strateji embriyogenez ileri aşamalarında aksonal yolları, projeksiyonlar ve sinaptik siteleri izleme sağlayan civciv genom, yabancı genlerin eklemek için piggyBac aracılı transpozisyon sistemi ile birleştirilmiştir.

Civciv Beyin etiket akson / sinaps Bir önceki yöntem etiketleme ve deneylerde 21-23 aşılama klasik retrograd veya anterograd boya dahil. Bu çalışmalar Beyin artan ve aksonal yolları inen üzerinde önemli bulgular katkıda bulunmuştur. Ancak, bazı yörüngeleri ve projeksiyonlar bu hücresel yaklaşımlarla gözardı. Addit olarak iyon, rapor funiculi yansıdığı nöronların alt gruplarının moleküler kimliklerini ortaya olamazdı. Bizim kombine elektroporasyon yöntemi ve genetik izleme sürekli aksonal navigasyon ve projeksiyon hedefleri 10 kendi özellikleri aşamalarında seçilmiş arka beyin nöron gelişimini takip için benzersiz yeteneği sağlar. Özellikle, bizim yaklaşım daha önce zaman 8,9 kısa süreli omurilik dorsal internöron aksonal yörüngeleri takip uygulanmıştır.

Açıklanan araçları da aksonal projeksiyonlar yöneten moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için hizmet edebilir; Genetik kodları (örneğin Lim homeo alan kodu olarak) seçici aksonal büyüme enhancer-Cre/Lox-based yaklaşımı ve etkisi ile belirli bir nöronal alt modifiye edildi ve bağlantı 8,10 izledi. Bu nedenle, bu protokol hücre etiketlenmesi için değil, aynı zamanda arzu edilen hücreler, genetik manipülasyonlar için sadece yararlı olabilir.

ve_content "ovo gen dağıtım yöntemi bir olarak elektroporasyon yararlarından> bir elektroporasyon 24 takip eden 3 saat içinde zaten görülmektedir ifade, bir hız olduğunu. Ancak, daha sonra gelişim de hücre bölünmeleri ortadan tanıttı gen kaybolur geçici ifadesi aşamaları. Bu sınırlama geçersiz kılmak için biz ovo gen ekleme en çok piggyBac aktarılması yöntemi kullandı. Bu araç önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyon sonra çok ileri aşamalarında için sağlam bir şekilde akson ve sinapsların izleme sağlar. kolayca tespit edebileceği gibi elektroporasyon (E14.5) takip eden 12 gün için nöronlar kadar etiketli, hatta yumurtadan sonra da dahil olmak üzere daha uzun süre, bu yaklaşımı kullanmak için son derece makul.

Bir mekansal ve zamansal sınırlı şekillerde hücrelerin tek taraflı hedefleme üzerinde civciv nöral tüp elektroporasyon röleleri diğer yararı. Bu b aksonal yörüngeleri izleme sağlarbir sahne-by-aşamalı bazında Beyin kenarlarında oth, hangi memelilerde takip zordur. Bu, çoğunlukla tek taraflı projeksiyonları izlemek ve ipsi ve kontra-yan aksonal yolları kökeni arasında ayırmak için yeteneği zorlaştıran, her iki nöral tüp tarafta da istenen hücre etiketleme nedeniyle germ-line transgenesis sonuçlanır. Sonuçta, fare ve civciv beyin nöronlar 3,5 arasındaki homoloji yüksek derecesine göre, bizim teknik kablolama ve gelişmekte olan omurgalı Beyin nöronların montaj yeni bilgi elde etmek için güçlü bir araç sağlar.

Bizim teknik avantajları olsa artırıcı unsurların kullanımı nöral tüp hücre-özgüllük ve arttırıcı-GFP yapıları ifade zamanlaması için dikkatli bir değerlendirme gerektirir civciv içinde muhabiri genlerin koşullu ifade sürücü, bazıları artırıcı elementlerin giriş bulundu Sistemimiz birkaç ise, arka beyin GFP olmayan bir kısıtlı ifade sürücüdiğerleri spesifik olmayan erken de ifade değil, geç, nöral tüp aşamaları (veriler gösterilmemiştir) vermiştir. Ayrıca, stratejisi şu haberci genin bir zamansal özgü ifade desteklemez. Bu nedenle, biz muhtemelen farklı serebellar alanları hedef için farklı aksonal yolları proje olabilir dA1 internöronlar, erken ya da geç doğumlu alt gruplar arasında ayrım yapamaz. Geçici olarak açma / kapama Beyin nöronlarda GFP ifade değiştirmek için ek araçlar genetik yapı daha doğrusu embriyonik / yetişkin beyin aksonal yörüngeleri ve sinaps gelişimini takip etmek yararlı olacaktır. Son olarak, elektroporasyon stratejisinin bir teknik dezavantajı yumurta, kan damarları ve saran zarlar konumunu nedeniyle E2.75-3 ötesinde aşamalarında bu manipülasyon için embriyonun erişilememesi vardır. Bu sınırlama, daha sonra gelişme doğan arka beyin nöron ek alt içine plazmid hedefleme önler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Tags

Nörobilim Sayı 75 Nörobiyoloji Gelişim Biyolojisi Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Anatomi Fizyoloji Genetik Elektroporasyon Chick arka beyin Akson Interneuron dA1 piggyBac Artırıcı Synapse nöronlar aksonlar GFP ifade, Embriyonik arka beyin beyin hayvan modeli
Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A.,… More

Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter