Summary
Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.
Abstract
Fysieke interactie tussen het lipide-ingebedde alpha-helix domeinen van membraaneiwitten spelen een cruciale rol in vouwing en assemblage van membraaneiwit complexen en dynamische processen zoals transmembraan (TM) signalisatie en regulatie van celoppervlak eiwitniveaus. Begrijpen van de structurele kenmerken de associatie van een bepaalde sequenties vereist geavanceerde biofysische en biochemische analyses van TM peptide complexen. De extreme hydrofobiciteit van TM domeinen maakt ze zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard peptide chemische technieken en productie van geschikte studiemateriaal blijkt vaak onbetaalbaar uitdaging. Het identificeren van de voorwaarden waaronder peptiden kan aannemen stabiele spiraalvormige conformaties en vorm complexen spontaan voegt een extra moeilijkheidsgraad. Hier wordt een procedure voor de productie van homo-of hetero-dimere TM peptide complexen uit materialen die worden uitgedrukt in E. coli, zodat opname van stabiele isotooplabels voor nucleaire magnetische resonantie (NMR) of niet-natuurlijke aminozuren voor andere toepassingen relatief goedkoop. De belangrijkste innovatie in deze methode is dat TM complexen worden geproduceerd en gezuiverd zoals covalent verbonden (disulfide-verknoopte) samenstellingen die vormen stabiele, homogene en stoichiometrische structuren na reconstitutie in detergent, lipide of andere membraan-mimetische materiaal. We presenteren ook zorgvuldig geoptimaliseerde procedures voor expressie en zuivering die evenzeer van toepassing of het produceren van een TM-domeinen of verknoopt complexen en geven advies voor de aanpassing van deze methoden om nieuwe TM sequenties.
Introduction
Dit protocol gegevens een procedure we hebben ontwikkeld om disulfide-gestabiliseerde complexen van transmembraan (TM) peptiden voor structurele studies met oplossing NMR produceren. De procedure maakt gebruik van de robuuste expressie geboden door de ΔtrpLE1413 fusiesysteem (zie hieronder) en kunnen TM peptide complexen gedefinieerde samenstelling worden gegenereerd met behulp van geavanceerde stabiele isotopen labeltechnieken voor moderne multi-dimensionale NMR experimenten. Wij hebben gebruik gemaakt van deze technieken naar verschillende NMR structuren die belangrijke nieuwe informatie over hoe lymfocyt-activerende immunoreceptors zijn opgebouwd uit meerdere membraan eiwitsubeenheden door interacties tussen de TM-domeinen (recent beoordeeld in 1) geopenbaard te bepalen. Deze technieken zijn van toepassing op vele andere membraaneiwit systemen alsmede diverse downstream analysemethoden naast oplossing NMR. Terwijl de hier gegeven voorbeeld maakt gebruik van inheemse cysteïnerestenom een complex dat de natuurlijk disulfide-gebonden eiwit nabootst, het ontwerp is ook geschikt voor het maken van kunstmatige disulfide bindingen met complexen die normaal worden bijeengehouden door zwakkere niet-covalente interacties, zoals homo-en hetero-dimere TM complexen stabiliseren epidermale groeifactor receptor (EGFR)-familie eiwitten 2-4 of heterodimere αβ integrine complexen 5,6.
Zeer hydrofoob peptide sequenties zoals die afgeleid van de lipide dubbellaag omspannende delen van TM eiwitten zijn bijzonder moeilijk onderwerpen voor biochemische en biofysische studies. Behalve zeer moeilijk te manipuleren met behulp van standaard eiwitten en peptiden chemische technieken, ze zijn vaak toxisch voor cellen en zijn daarom moeilijk recombinant produceren. We 7,8 en anderen negen-elf hebben gehad groot succes uitdrukken zulke moeilijke peptidesequenties in bacteriën als in-frame carboxyterminalefusies met een aangepaste versie van de ΔtrpLE1413 sequentie afgeleid uit de E. coli trp operon 12. De ~ 13 kDa trpLE polypeptide gecodeerd door deze sequentie worden geproduceerd met hoge niveaus onder een T7 promoter en geheel gelokaliseerd insluitingslichamen waar problemen inzake toxiciteit en / of instabiliteit worden omzeild. Wijziging van de sequentie door toevoeging van een amino-terminale histidine tag 9-13 en eliminatie van interne methionine en cysteine residuen van de sequentie 14 trpLE toegestaan trpLE-peptide fusies gezuiverd worden door metaal-ion affiniteitschromatografie en geknipt met cyanogeenbromide (CNBr ) om de gewenste peptidesequentie vrij. We hebben met succes gebruikt dit systeem om de meer dan een dozijn verschillende sequenties als trpLE fusies die membraaneiwit fragmenten die maar liefst vier TM-domeinen bevatten uiten (7,8 en niet gepubliceerde resultaten, zie ook DISCUSSIE sectie).
Debelangrijke innovatie in dit protocol is de identificatie van de voorwaarden waaronder de ongestructureerde en zeer slecht oplosbaar trpLE-TM fusies kan efficiënt disulfide-verknoopt in het kader van een gestroomlijnde workflow. Verschillende aspecten van high-yield expressie, behandeling en zuivering van peptide producten zijn ook goed geoptimaliseerd en de aanbevelingen hier gepresenteerde even relevant voor de productie van niet-disulfide-verknoopte (monomeer) TM peptide producten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonen en Construct Ontwerp
Kloon de sequenties van interesse in de vector pMM-peptide (die kan zijn voorzien op aanvraag) met HindIII en BamHI restrictieplaatsen (zie figuur 1). Het dubbelstrengs DNA insert, opgenomen in de volgende volgorde: een HindIII-plaats, een methionine codon voor CNBr splitsing, de E. coli codon-geoptimaliseerde coderende sequentie, een stopcodon, een BamHI site. Alle andere methionines in het peptide worden geëlimineerd en de sequentie dipeptide Asp-Pro moet worden vermeden, deze zal worden gesplitst onder zure omstandigheden.
Een unieke cysteïnerest worden ingebracht in elk peptide sequentie volgens de gewenste positionering van de disulfide verknoping in het uiteindelijke complex en alle andere cysteines worden gemuteerd tot serine. Het plasmide draagt een kanamycine resistentie cassette voor selectie.
2. Expressie van trpLE-peptide Fusion
- Maken en steriele filter M9/Kan minimale groei medium (0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 3 g / L KH 2PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / L NH4Cl, 4 g / L glucose, 50 mg / L kanamycine sulfaat). Supplement bij het Centrum Compleet van A tot Zink om B-vitamines en sporenelementen zorgen voor: los 1 tablet in 40 ml H 2 O met het mengen gedurende 30 minuten, centrifuge om onoplosbaar materiaal en steriele filter de oranje supernatant te verwijderen. Store stock oplossing bij 4 ° C in het donker tot 2 weken en met 4 ml / L in M9.
OPMERKING: 15 N-verrijkte NH4Cl, 13C-verrijkte glucose of andere stabiele-isotoop-gemerkte precursors worden in M9 medium op dit moment indien gewenst. - Inoculeren van 100 ml startercultuur van vers getransformeerde BL21 (DE3) E. stam coli in M9/Kan medium. Groeien bij 37 ° C onder schudden bij 200 rpm.
- De volgende ochtend controleren OD 600 van de starterkweek - dit moet in het traject van 2 of hoger. Verdun de 100 ml zuursel in 1 L totaal volume van Centrum-aangevuld M9 medium. Opgesplitst in twee kolven 2 L war (500 ml kweek in elke kolf) en groeien bij 37 ° C onder schudden bij 140 rpm tot de OD600 0,6 bereikt.
- Stel de shaker temperatuur tot 18 ° C en verder gedurende 1 uur geschud, waardoor culturen volledig afkoelen alvorens inductie.
- Neem een pre-inductie monster SDS-PAGE analyse (equivalent van 50 pi van een cultuur van OD600 = 1), voeg IPTG tot 0,1 mM eindconcentratie om expressie van het fusie-peptide trpLE induceren. Blijven groeien bij 18 ° C/140 rpm 's nachts (16-20 uur) onder IPTG-inductie.
3. Insluitingslichaam Voorbereiding en Nikkel Matrix Binding
- De uiteindelijke OD 600 van 's nachts expressie culturen in minimaal medium is variabel en should tussen 2,5 en 5,0. Neem een monster voor SDS-PAGE-analyse (equivalent van 50 pi van een cultuur van OD600 = 1) en verzamelen cellen door centrifugatie gedurende 20 min bij 5.000 x g.
- Hersuspendeer celpellet van 1 L cultuur in 50 ml lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Celsuspensies worden bevroren opgeslagen voor latere verwerking.
- Lyse cellen door sonicatie op ijs in de hoogste stand gedurende 1 minuut en rust op ijs gedurende 5 minuten. We gebruiken een Misonix sonicator 3000 (max. vermogen 600 watt) met een ½-inch high-intensity vervangbare tip. Herhaal sonicatie / koeling voor drie cycli.
- Verzamel onoplosbare inclusielichamen (IB) materiaal door centrifugatie gedurende 15 min bij 20.000 xg en verwijder het supernatant. Een losse, dunne laag lichter gekleurde celresten kunnen zichtbaar bovenop de dichte IB pellet, dit kan worden weggespoeld met water of buffer onder zacht schudden. Stappen 3.3 en 3.4 kan worden herhaald om de zuiverheid van de fractie IB verbeteren als desirood. Monsters van pellet en supernatant materiaal moet worden genomen voor SDS-PAGE analyse trpLE-fusie TM lokalisatie bevestigen insluitingslichamen.
- Los IB pellets in guanidine oplossing (6 M guanidine HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), met 25-50 ml per liter kweek verwerkt. Deze stap vereist verscheidene uren onder roeren en af en toe lichte sonicatie.
- Verwijder de IB lysaat door centrifugatie gedurende 1 uur bij 75,000-100,000 xg en 20 ° C. Giet het supernatant en filtreer door een 0,2 urn membraan.
- Combineer het gezuiverde lysaat IB, in een 50 ml conische buis of een groter vat die veilig kan worden, afgesloten met nikkel affiniteitshars dat gewassen met water en geëquilibreerd met guanidine oplossing. Gebruik 3-4 ml vaste hars per liter kweek verwerkt fusies die uitdrukken in dezelfde mate als trpLE-DAP12TM here (Figuur 3, kolom 2). Batch binden door incubatie overnacht bij kamertemperatuur t emperatuur met voorzichtig mengen.
4. Op de kolom oxidatieve verknoping
- Laad het IB lysaat / nikkel hars ophanging in een lege zwaartekracht kolom met poreuze bed steun, toe te voegen continu totdat het volledige volume stroomt door. Verzamel en opzij zetten de doorstroomsysteem, die nog kunnen bevatten ongebonden fusie-eiwit.
- Was de nikkel hars door zwaartekracht met 5 bed volumes ureumoplossing (8 M ureum, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) met 5 mM β-ME.
- Nogmaals Was de nikkel hars met 5 bedvolumes ureumoplossing zonder β-ME.
- Was de nikkel hars een derde keer met 5 bed volumes ureumoplossing die is aangevuld met 20 pM CuSO 4 en 2 mM geoxideerd glutathion. Hierna was, sluit de kolomuitlaat en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur maximale disulfide bindingen mogelijk te maken.
5. Elutie TFA en kwantificering
content "> LET OP: Trifluorazijnzuur (TFA) veroorzaakt ernstige brandwonden bij contact met de huid en dampen zijn zeer irriterend Geconcentreerde TFA mag alleen worden gebruikt in een goedgekeurde zuurkast met oogbescherming en non-latex handschoenen Controleer de chemische compatibiliteit van alle.. gebruikte materialen; polypropyleen is compatibel met alle stappen van dit protocol.- Spoel de oxiderende ureumoplossing met 10 bedvolumes water en droog de kolom bed door het toepassen van een vacuüm lijn naar de kolom stopcontact.
- Sluit de kolomuitlaat en voeg 1,5 bedvolumes nette (99-100%) TFA. Roer het nikkel hars met een kleine spatel een gelijkmatige blootstelling aan zuur zorgen en incubeer gedurende 5 minuten. Open de kolomuitlaat en verzamel de zure eluaat druk voorzichtig met een injectiespuit of persleiding zonodig te duwen alle vloeistof.
- Herhaal de zure elutie stap met nog eens 1,5 bedvolumes nette TFA. Werken snel in deze fase om de volledige oplossing van het voorkomen Beaded agarose matrix. Eiwitrendement worden bepaald op dit punt volgens de Beer-Lambert vergelijking en de theoretische molaire extinctiecoëfficiënt van de trpLE-peptidesequentie. Verdun een monster van het eluaat TFA (1:20-1:50) in trifluorethanol (TFE) en meet de absorptie bij 280 nm, met TFA / TFE bij dezelfde verdunning als blanco.
6. CNBr Spijsvertering
LET OP: cyanogeenbromide (CNBr) is uiterst giftig en mag uitsluitend behandeld in een goedgekeurde chemische dampkap worden. Persoonlijke beschermingsmiddelen inclusief veiligheidsbril, laboratoriumjas en niet-latex handschoenen zijn absoluut noodzakelijk. CNBr is voor vocht en reactieve worden gebracht kamertemperatuur opening. Neem contact op met de institutionele veiligheid kantoor voor meer informatie over neutralisatie / verkoop van CNBr-verontreinigde oplossingen en materialen.
- Verdun het zuur eluaat tot 80% uiteindelijke TFA concentratie door druppelsgewijze toevoeging van water onder mengen langzaam. Indien een neerslag wordt gevormd, eendd terug een klein volume (0,5 tot 1 ml) van nette TFA tot de oplossing helder, dan weer juist tot 80% met water. Ongeveer 5 pi pre-digest monster SDS-PAGE analyse bevriezen in vloeibare stikstof en vriesdrogen van het monster onmiddellijk.
- Voeg CNBr kristallen tot ongeveer 0,2 g / ml, zorg ervoor dat de giftige chemische veilig wegen in gesloten, pre-gewogen buizen of met behulp van een evenwicht in de chemische dampkap. Meng voorzichtig tot het volledig opgelost. Spoel en verzegelen reactievat onder inert gas (stikstof of argon stroom) en 3-4 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Neem een 5 ul post-digest monster voor SDS-PAGE-analyse en bevriezen en lyofiliseren onmiddellijk. Breng het digest reactie op een geregenereerde cellulose dialyse cassette of buis (celluloseacetaat oplost in geconcentreerd zoutzuur) met een molecuulgewicht van 3,5 kDa cutoff of minder, afhankelijk van de grootte van het verwachte peptide complex. Dialyseer overnacht op 4 liter water in dezuurkast aan de TFA concentratie te verminderen en ontleden elke gereageerd CNBr. Laat ruimte in de cassette dialyse of slang een aanzienlijke toename in volume (wel twee tot drie maal) gedurende een nacht dialyse.
- Verwijder de gedialyseerde reactieoplossing met gesuspendeerde precipitaat uit de cassette dialyse of buis (meestal eiwit precipiteren wanneer de TFA concentratie wordt verminderd) en breng de 50 ml conische buizen. Bevriezen en lyofiliseren om water en sporen van CNBr / TFA te verwijderen. Deze stap vereist wellicht enkele dagen.
LET OP: Zowel de gedialyseerde digest reactie en de dialyse water verder moet worden behandeld als giftig en behandeld / afgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen. - Monsters van culturen van pre-inductie en oogst fasen insluitingslichaam supernatant en pellet, TFA eluaat en CNBr-verteerd materiaal kunnen worden geanalyseerd door SDS-PAGE. Bereid monsters door verhitting tot 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample-buffer. TFA eluaat en verteren monsters dienen te worden opgesteld in zowel reducerende en niet-reducerende omstandigheden naar het product identificatie en evaluatie van oxidatieve verknoping vergemakkelijken.
- Scheid de monsters op een 12% NuPAGE bis-tris prefab acrylamide gel met MES SDS-loopbuffer voor optimale resolutie van de kleinste digest producten.
7. Omgekeerde-fase HPLC Zuivering van Disulfide-verknoopte peptide complexen
- Los tot 100 mg gelyofiliseerd digest producten in 2-3 ml mierenzuur en netjes laden op een preparatieve schaal (21,2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 kolom C3 PrepHT in oplosmiddel A (typisch 10-20% acetonitril of 5 -10% isopropanol in water met 0,1% TFA).
- Elueer het digest producten in een gradiënt van oplosmiddel B (acetonitril of isopropanol met 0,1% TFA) over tenminste 5 kolomvolumes. Zie discussie suggesties over de selectie van optimale gradiëntomstandigheden voor verschillende peptidesequenties.
- Nemen50-100 pi monsters van elke fractie HPLC voor SDS-PAGE analyse en bevriezen en lyofiliseren onmiddellijk. Verwijdering van HPLC oplosmiddelen snel en moet volledig in 1-2 uur.
- Bereid gevriesdroogd HPLC monsters voor SDS-PAGE door verwarmen tot 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-monsterbuffer zonder reducerend middel. Koel af en split elk monster gelijkmatig in 2 microcentrifugebuisjes, het toevoegen van 100 mM DTT aan een van hen en re-verwarming kort.
- Scheid de gereduceerde en niet-gereduceerde monsters op een HPLC 12% NuPAGE bis-tris prefab acrylamide gel met MES-SDS lopende buffer zoals hierboven. Kleine, hydrofobe peptiden vaak niet nemen Coomassie goed vlekken en kan niet draaien op hun verwachte molecuulgewichten. Moet echter vergelijking van gereduceerde en niet-gereduceerde monsters eerder herkennen van de verknoopte peptide producten en beoordeling van zuiverheid.
- Analyseer de kandidaat-peptide fracties by matrix-assisted laser desorptie ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie (zie bespreking) om de soorten van belang vast te stellen en te bevestigen de verwachte massa.
- Combineer, invriezen en lyofiliseren HPLC fracties met het zuivere, verknoopte TM peptide complex en neemt een drooggewicht van het eindproduct te bepalen opbrengst. Fracties met een hoog isopropanol inhoud kan niet blijven bevroren. Als peptidefracties beneden drogen tot een film dan een pluizig gevriesdroogd product, volledig opnieuw oplossen van de film in een klein volume zuiver hexafluorisopropanol (HFIP), invriezen en lyofiliseren weer. De HFIP behandelde product moet een kleine, witte kegel die gemakkelijk wordt getipt uit en gewogen worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het expressieniveau bereikt trpLE fusies is variabel en sterk afhankelijk van de aminozuursequentie van de bijgevoegde peptide. Figuur 3 toont de SDS-PAGE analyse van pre-inductie (laan 1) en time-of-oogst (laan 2) monsters uit een cultuur die ongeveer 120 mg zuivere, intacte trpLE-DAP12TM fusie van 1 liter cultuur en 4 ml nikkel matrix opgeleverd. Alle trpLE-fusie DAP12TM was gelokaliseerd in het insluitingslichaam pellet (baan 4) tegenover supernatant (laan 3).
Ongeveer 70% van het nikkel gezuiverde trpLE-fusie was DAP12TM disulfide-verknoopt aan de dimere vorm (Figuur 3, lanen 5 en 6: niet-gereduceerde en gereduceerde monsters TFA eluaat). Dit is een typisch resultaat trpLE-fusie DAP12TM, maar crosslinking efficiency zal variëren met de plaatsing van gemanipuleerde cysteïnes. De DAP12TM peptide producten zijn niet scherp omlijnd in totaal CNBr digest monsters (lanen 7 en 8),maar vergelijking van de intacte fusie en trpLE fragment bands in het gereduceerde digest monster (laan 8) geeft aan dat afbraak van het fusie was ongeveer 60% voltooid.
Figuur 4 toont de scheiding van digest producten door omgekeerde fase HPLC met een preparatieve C3 kolom (totaal bindend vermogen ~ 200 mg eiwit). Omdat het aromatengehalte van het fusie is typisch laag we controleren de absorptie bij 214 nm in plaats van 280 nm. Voor deze run 90 mg van geoxideerd werd CNBr-verteerd trpLE-fusie DAP12TM opgelost in 3 ml mierenzuur en netjes op de kolom geladen in 100% oplosmiddel A (60% H2O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). Gebonden producten werden geëlueerd in twee fasen gradiënt van 0-60%, gevolgd door 60-90% solvent B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) met een stroomsnelheid van 10 ml / min. De belangrijkste producten in elke fractie volgens SDS-PAGE analyse (Figuur 5) worden aangegeven boven de chromatogram met de codes assikenden in figuur 2. Zie Optimalisatie van HPLC-gradiënt elutie in de discussie sectie voor meer informatie over het optimaliseren van gradiënt voorwaarden voor verschillende peptidesequenties.
Peptide producten zijn herkenbaar in de SDS-PAGE (figuur 5) en MALDI-TOF (figuur 6) analyse van de belangrijkste HPLC fracties. DAP12TM peptiden en, in onze ervaring, vele andere hydrofobe TM peptiden, uitgevoerd met aanzienlijk verminderd migratie tarieven in vergelijking met de verwachte molecuulgewicht (3366 Dalton monomeer en 6730 Dalton dimeer voor de 15 N-gelabelde soorten hier afgebeeld). Dit gedrag is direct gerelateerd aan de hoeveelheid peptide geladen op de gel en resulteert in een continuüm van schijnbare molecuulgewichten zoals geladen bedrag wordt gevarieerd (data niet getoond). De wijziging in elektroforetische mobiliteit van piek 5 na reductie met 100 mM DTT (vergelijk lanen 7 en 8) geeft dit als verknoopte peptideproduct. MALDI-TOF MS analyse bevestigt de identiteit van het dimeer peptide met de grote piek bij 6729,2 Dalton en toont geen andere belangrijke producten (figuur 6). De uiteindelijke opbrengst van pure disulfide verknoopte DAP12TM peptide homodimeer van dit preparaat was 7,5 mg per liter kweek.
Figuur 1. DNA sequentie van het trpLE-DAP12TM coderende gebied met de aminozuur vertaling. Key gebieden van de polypeptidesequentie zijn gemarkeerd en kleurcodering met labels naar rechts. De unieke interne methionine (Met) en cysteine (Cys) resten van cyanogeenbromide (CNBr) splitsing en oxidatieve verknoping worden benadrukt in cyaan en paars respectievelijk. HindIII en BamHI restrictieplaatsen (vet en onderstreept) zijn uniek in de plasmide en may gebruikt om de TM peptide sequentie vervangen door een andere sequentie van belang.
Figuur 2. Schematische weergave van de procedure. De hoofdstappen in het protocol worden in tekstlabels. Belangrijke segmenten van de trpLE-DAP12TM fusie zijn kleur-gecodeerd als in figuur 1. Bekende polypeptide producten uit de verknoping en digest stappen gelabeld AF en worden hier vermeld met hun beschrijving en verwachte molecuulgewicht (15N gemerkt): [A] trpLE fragment: 13.769 Daltons, [B] intact trpLE-fusie DAP12TM: 17.118 Daltons ; [C] intact trpLE-DAP12TM fusion dimeer: 34.233 Daltons; [D] single-gekloofd trpLE-DAP12TM fusion dimeer: 20.482 Daltons; [E] monomere DAP12TM peptide: 3366 Dalton; [F] dimeer DAP12TM peptide: 6730 Dalton. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. SDS-PAGE analyse van trpLE-DAP12TM expressie, zuivering en crosslinking digest stappen kweekmonsters (laan 1, pre-inductie stap 2,5, baan 2, oogsten, stap 3.1). Inclusion body en prep samples (baan 3 supernatant; lane 4, pellet, stap 3.4) verminderd met 100 mM DTT. TFA eluaat van nikkel kolom (lanen 5 en 6, stap 6.1) en post-CNBr sample (banen 7 en 8, stap 6.3) werden gelopen niet-gereduceerde (NR) en gereduceerd met 100 mM DTT (R) zoals het bevestigen disulfide-verknoopte producten. * Monomere en dimere product peptides E en F zijn slecht zichtbaar gemaakt door Coomassie kleuring en worden daarom niet detecteerbaar op deze gel.
Figuur 4. Omgekeerde-fase HPLC zuivering van DAP12TM disulfide verknoopte dimeer. Geoxideerd, CNBr-verteerd en gevriesdroogd trpLE-DAP12TM fusieprodukten (90 mg) werden opgelost in 3 ml mierenzuur (100%) en geladen op een Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT (21,2 x 150 mm) kolom in oplosmiddel A (60% H2O, 40% acetonitril, 0,1% TFA). Tweetraps gradiënt van 0-60%, gevolgd door 60-90% solvent B (75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1% TFA) werd uitgevoerd bij een stroomsnelheid van 10 ml / min om gebonden producten elueren. Fracties verzameld als doorstroom (FT) en vier grote pieken worden aangegeven boven de 214 nm absorptie trace (AU: willekeurige unzijn) en de belangrijkste producten in elke fractie worden aangeduid met de code toegewezen in figuur 2. De gewenste DAP12TM verknoopt product piek is in de schaduw.
Figuur 5. SDS-PAGE analyse van reversed-phase HPLC producten. Doorstroomcel (FT) en piek 1 monsters werden niet gereduceerd. Piek 2, 3 en 4 monsters werden zowel niet-gereduceerde (NR) en verminderd door behandeling met 100 mM DTT (R) de identiteit van disulfide verknoopte producten te verifiëren. De belangrijkste producten in elke fractie (met codes toegekend in figuur 2) waren [FT, PK1]: A, trpLE fragment; [pK2]: B, intact trpLE-fusie DAP12TM monomeer en C, intact fusie-dimeer; [PK3]: D, single-gekloofd trpLE-DAP12TM dimeer en E, monomere DAP12TM peptide; [PK4]: F, disulfide verknoopte DAP12TM dimeer. * Zoals (zie representatieve REULTS), een concentratieafhankelijke verschuiving in mobiliteit maakt de lage MW producten in PK3 (NR en R) en PK4 (R) blijken verschillende molecuulgewichten, hoewel beide producten monomere peptide.
Figuur 6. MALDI-TOF massaspectrometrische analyse van HPLC gezuiverd DAP12TM dimeer. Een monster van HPLC fractie 4 (1 pi) werd 1:1 gemengd met een verzadigde oplossing van sinapinezuur (SA) matrix in acetonitril en gespot op een dunne laag gedroogde SA matrix van een verzadigde oplossing bereid in ethanol. MALDI-TOF analyse onthult een product op de verwachte DAP12TM peptide verknoopt dimeer massavan 6730 Daltons (6729,2098; 15N gemerkt) en een kleine product 3365,7105, waarschijnlijk de dubbele geïoniseerde species. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Expressie van TM trpLE-fusies. Onze ervaring is trpLE-TM fusies slecht uitgedrukt in rijke kweekmedium bij 37 ° C en de kweekomstandigheden hier beschreven zijn effectief gebleken voor verschillende sequenties die een tot vier domeinen met TM opbrengsten variërend 50 tot 150 mg / L zuiver, intact fusie. Fusies coderen drie of vier TM GPCR fragmenten (humane CCR5-TM1 TM3 en TM4-TM7 respectievelijk) of een kern katalytisch fragment van humaan signaalpeptide peptidase (vier domeinen TM, zie ref 15) het laagste in deze reeks uitdrukking niveau terwijl DAP12TM varianten nauw verwant aan de sequentie die hier vertegenwoordigen het hoogste einde van het gebied (ongepubliceerde gegevens). De optimale concentratie IPTG proefondervindelijk worden bepaald voor elke nieuwe sequentie. Onze standaard is 0,1 mM, en hogere concentraties (tot 1 mM) meestal resulteren in een significant verminderde opbrengst door zowel lagere expressie en lagere kweekdichtheid eent oogst (zie bijvoorbeeld figuur 1A in referentie 7).
Variaties op de gepresenteerde protocol. Geschetste protocol beschrijft de productie van een disulfide-verknoopte TM peptide complex, de DAP12TM homodimeer 8. Als alternatief wordt het protocol eenvoudig aan monomere peptiden door het weglaten van de twee wasstappen ontworpen voor het verwijderen reductiemiddel en de gebonden producten (4.3 en 4.4) oxideren. We hebben eerder een andere variant van de hier beschreven procedure een covalent gestabiliseerde TM peptide complex die de trimere DAP12-DAP12-NKG2C TM samenstel (zie referentie 8 en werkwijzen hierin beschreven) te produceren. In deze aanvrage werd een 1-TM trpLE-fusie DAP12 en een 2-TM trpLE-fusie DAP12-NKG2C gemengd in de cultuur oogst fase voor inclusion body preparaat (stap 3,1 tot 3,2). De procedure omvatte een extra HPLC stap om het heterodimere verknoopte trpLE isolerenfusieproduct van het zuur eluaat (stap 5.3) voor CNBr digest. C3 zuivering van het peptide producten in een opleving van een disulfide-verknoopte DAP12TM dimeer waarin een streng de NKG2C TM domein overgedragen als een in-frame C-terminale fusie. De oplossing NMR structuur van dit complex in detergent micellen bevestigd dat de NKG2C TM domein samengevoegd met DAP12 in zijn natieve, antiparallelle oriëntatie 8. De extra stappen in deze variant verminderde de opbrengst van het eindproduct: een typisch preparaat leverde 8-10 mg van peptide "trimeer" van 4L van een fusie in combinatie met een overmaat van het tweede. Deze variatie is een goed uitgangspunt protocol voor onderzoekers die disulfide-gestabiliseerde complexen die twee verschillende TM sequenties te produceren.
Toelichting nikkel-affiniteitszuivering. De elutie van eiwit van de gedroogde nikkel kolom met geconcentreerd zoutzuur is een ongewone procedure en is niet vatbaar opnieuwGebruik van de nikkel matrix. Pogingen om de extreem hydrofobe trpLE-TM fusies met imidazool of EDTA elueren een onvolledige herstel van eiwit en de verknoopte species zijn bij voorkeur op de kolom (ongepubliceerde resultaten). De aanbevolen hoeveelheid nikkel matrix en de nachtelijke batch-bindend protocol zijn zorgvuldig geoptimaliseerd om de matrix te verzadigen met trpLE-TM-eiwit en daarmee het minimaliseren van de co-zuivering van verontreinigingen. We routinematig te herstellen zeer zuivere producten met opbrengsten die aanzienlijk hoger zijn dan de geadverteerde bindingscapaciteit van de Sigma HIS-Select Nikkel affiniteitsmatrix (15-20 mg / ml hars). De zuurelutie schaft ook tussenstappen om de overgang naar de CNBr digest en de verhoogde opbrengst van verknoopte producten meer dan compenseert de kosten van de nikkel matrix, met name bij het labelen met stabiele isotopen dure reagentia voor NMR.
Cyanogeenbromide digest omstandigheden. Vrijgave van defused TM peptiden uit trpLE in CNBr wordt doorgaans uitgevoerd met 70% mierenzuur als het oplosmiddel omdat zowel de reactiesnelheid en oplosbaarheid zeer gunstig onder deze omstandigheden. Echter, moet de behandeling voortdurend worden gehouden in relatief korte (minder dan 1 uur voor digest) om formyl verestering van serine en threonine-residuen 16,17 vermijden en eventueel I-formylering van tryptofaanresiduen 18, wijzigingen die worden gedetecteerd met behulp van massaspectrometrie als soorten waarvan de waargenomen massa is +28 (n) Daltons opzichte van de verwachte massa. Onze voorkeur voor TFA zoals beschreven vermijdt deze wijzigingen geheel. Enzymatische splitsing van een trpLE-TM fusie met factor Xa protease in 1% Triton X-100 is beschreven 11 maar de slechte oplosbaarheid van de meeste trpLE-TM fusies en de complicatie van splitsingsplaats ontoegankelijkheid in detergent micellen waarschijnlijk beperken de algemene bruikbaarheid van deze benadering.
Omgekeerde-fase HPLC zuivering van peptide producten van de CNBr digest is de meest uitdagende stap in deze procedure en zal waarschijnlijk optimalisatie voor elke nieuwe trpLE-TM volgorde vereisen. De volgende opmerkingen komen uit het verwerken van veel verschillende sequenties en waarschijnlijk gaan voor de meeste trpLE-TM fusies:
Selectie van stationaire fase We vinden Agilent ZORBAX Stable Bond-C3 kolommen (300 A poriegrootte, 5 urn deeltjesgrootte). Een superieure stationaire fase in termen van selectiviteit, oplossend vermogen en stabiliteit onder zware blootstelling aan geconcentreerd zuur. Semi-preparatieve (9,4 mm diameter) en preparatieve schaal (21,2 mm diameter) maten beschikbaar zijn en hebben zeer goed gepresteerd in onze handen. C4, difenyl en cyanopropyl stationaire fasen kunnen ook nuttige alternatief peptide selectiviteit in een vergelijkbare hydrofobiciteit bereik vergeleken met C3.
Voorbereiding van digest producten voor HPLC. Ontbinding van gevriesdroogde CNBr digest producten in keurige voormic Acid geeft de beste resultaten voor HPLC-scheiding. Bereiding in TFA of organische oplosmiddelen zoals acetonitril, dimethylformamide en trifluorethanol resulteert vaak in lagere oplosbaarheid, verlaagde kolom binding en / of elutie van producten in brede pieken met meerdere soorten. Zorg moet worden genomen om producten direct bereiden mierenzuur voor kolom loading omdat langdurige blootstelling kan leiden tot modificatie van formyl peptide zijketens 16-18 zoals hierboven besproken.
Optimalisering van HPLC gradiëntelutie. We beginnen gewoonlijk met 10-20% acetonitril of 5-10% isopropanol in water met 0,1% TFA als solvent A. TrpLE-TM fusies en hun producten digest opgelost in mierenzuur is binden C3 kolom als tot 40% acetonitril als hier getoond (Figuur 4). Veel van het vrijgemaakte fragment trpLE kan doorstromen onder deze omstandigheden (NB trpLE fragment is het enige eiwit product in de FTfractie: Figuur 5, laan 1), en we hebben gebruik gemaakt van deze waarneming de totale bindingscapaciteit van de kolom voor de gewenste producten te verhogen. Acetonitril en isopropanol zijn zeer effectief als gradient oplosmiddelen en we vaak tot onze laatste gradiëntomstandigheden door mengen bestaande oplosmiddel oplossingen elutieprofielen wijzigen, waardoor soms vreemde maar effectieve recepten zoals de 75% isopropanol, 25% acetonitril, 0,1 % TFA oplossing die als oplossing B voor de zuivering DAP12TM hier. Extreem hydrofobe producten waren problemen zijn geëlueerd met acetonitril of isopropanol met toevoeging van maximaal 10% trifluorethanol (TFE) en verhoogde concentraties van TFA (maximaal 0,3%) in A en B (ongepubliceerde resultaten). Anderen hebben goede resultaten met butanol / azijnzuur mobiele fasen met een stationaire fase C4 9.
Analyse van de digest producten. Zowel van de belangrijkste analysetechnieks hier gebruikt, SDS-PAGE en MALDI-TOF MS, kan worden gecompliceerd door de uiterst hydrofobe aard van trpLE-TM producten. Gevriesdroogde monsters voor analyse van CNBr / TFA digest reacties en HPLC fracties soms lopen zo hoog moleculair gewicht aggregaten op SDS-PAGE gels. We merken dat behandeling van gevriesdroogde monsters met een klein volume HFIP en opnieuw lyofilisatie voor de bereiding van SDS-PAGE vaak verhelpt dit probleem. TM peptide sequenties kunnen ook niet gemakkelijk ioniseren bij MALDI-TOF MS analyse en kan daarom zeer zwakke signalen. We hebben gebruik gemaakt van een geoptimaliseerde werkwijze voor het bereiden TM peptide monsters waarin een verzadigde oplossing van sinapinezuur (SA) in ethanol eerst gespot op de plaat en gedroogd tot een uniform dunne laag matrix maken. Een monster van peptide bevattende HPLC fractie 1:1 gemengd met een verzadigde oplossing van SA in acetonitril wordt vervolgens gespot bovenop de gedroogde matrixlaag. In onze handen Deze methode levert tussen twee en zes maal hoger signaal-ruis vergelijkend om het spotten van de peptide: SA mengsel direct op een schone MALDI plaat.
Stroomafwaarts toepassingen. Methoden voor het reconstrueren TM peptide complexen in lipide of schoonmaakmiddel systemen voor oplossing NMR en andere downstream-toepassingen lopen sterk uiteen en moet meestal zorgvuldig worden aangepast voor elke nieuwe systemen en toepassingen. Een volledige bespreking van de betrokken parameters derhalve buiten het bestek van dit protocol artikel. Voor details van monstervoorbereiding van succesvolle applicaties met behulp van NMR-oplossing, verwijzen we de lezer naar deze recente beoordelingen over het onderwerp 1,19 en referenties daarin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De financiering voor dit werk wordt geleverd door de National Health en Medical Research Council van Australië (NHMRC projectsubsidie 1011352 naar MEC en MJC; onafhankelijke onderzoeksinstituten Infrastructure Support Scheme [IRIISS] subsidie aan WEHI) en de Victoriaanse regering (Veski Innovation Fellowship aan MEC; Victoriaanse Deelstaatoverheid operationele infrastructuur te ondersteunen om WEHI). MEC is een Koningin Elizabeth II Fellow van de Australian Research Council. EFXB erkent steun van de Norma Hilda Schuster Scholarship Program aan de Universiteit van Melbourne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
