Summary
막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
막 단백질의 지질 내장 된 알파 - 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.
Introduction
이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 - 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 - 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 - 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4 또는 heterodimeric의 αβ 인테그린 단지 5,6.
같은 지방질에서 파생 된 것과 같은 매우 소수성 펩타이드 시퀀스 이중층 - 스패닝 TM 단백질의 일부 것은 생화학 및 biophysical 연구 대단히 어려운 과목입니다. 표준 단백질과 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하는 것은 매우 어려운 것뿐만 아니라, 그들은 종종 세포에 매우 독성이 있으므로 recombinantly 생산하기가 어렵습니다. 우리 7,8 등 9-11이 가지고에서 프레임 카르복시 - 터미널로 세균 이러한 어려운 펩타이드 시퀀스를 표현 상당한 성공E.에서 파생 된 ΔtrpLE1413 순서의 수정 된 버전 fusions 대장균 TRP 오페론 12. 이 시퀀스로 인코딩 ~ 13 kDa trpLE 폴리펩티드는 T7 프로모터에 따라 높은 수준의 생산 할 수 있으며 완전히 독성 및 / 또는 불안정에 관한 문제가 피할 아르 포함 단체로 지역화되어 있습니다. 아미노 터미널 9 히스티딘 태그 13 trpLE 순서에서 내부 메티오닌과 시스테인 잔류 물을 제거 금속 이온 친화도 크로마토 그래피에 의해 정화되고 소화 할 14 수 trpLE - 펩타이드 fusions는 시안 브로마이드 (CNBr을 사용하는 추가하여 순서의 변경 ) 원하는 펩타이드 시퀀스를 공개합니다. 우리는 성공적으로 많은 사 등의 TM 도메인을 포함 멤브레인 단백질 조각을 대표 trpLE fusions 등의 12 개의 시퀀스 이상을 표현하기 위해이 시스템을 사용하면 (7,8 및 게시되지 않은 결과, 또한 토론 섹션을 참조).
이 프로토콜의 주요 혁신은 구조화 매우 저조한 용해 trpLE-TM fusions 효율적으로 간소화 된 워크 플로우의 맥락에서 이황화 - 가교가 될 수있는 아래의 조건을 식별합니다. 높은 수율 표현, 취급 및 펩타이드 제품의 정화의 여러 측면은 철저하게 최적화하고, 여기에서 제시 한 권고는 비 이황화 - 가교 (monomeric) TM 펩타이드 제품의 생산을위한 동등하게 관련이되어 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 복제 및 구조 설계
HindIII와 BamHI 제한 사이트를 (그림 1 참조)를 사용하여 pMM-펩타이드 벡터 (이 요청시 제공 될 수 있습니다)에 관심 시퀀스를 복제. 이중 좌초 된 DNA의 삽입은 다음과 같은 순서로, 통합해야 HindIII 사이트, CNBr의 절단에 대한 단일 메티오닌 코돈, E.를 순서를 코딩 대장균 코돈 최적화 된 펩타이드, 정지 코돈, BamHI 사이트입니다. 펩타이드의 다른 모든 methionines는 제거해야하고 또한 산성 조건에서 흘리고 될 것 같은 dipeptide 순서 ASP-PRO는 피해야한다.
독특한 시스테인 잔류 물은 최종 단지에 이황화 crosslink의 원하는 위치에 따라 각 펩타이드 순서로 소개하고, 다른 모든 cysteines는 세린에게 변형해야합니다. 플라스미드은 선택 kanamycin 저항 카세트를 수행합니다.
2. trpLE - pepti의 표현드 퓨전
- (0.1 MM CaCl 2, 2 MM MgSO 4, 3g / L KH 2 PO 4, 7.5 g / L 오세영 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, 화장 및 살균 필터 M9/Kan 최소한의 성장 매체 1g / L NH 4 CIA 같으니, 4 G / L 포도당, 50 MG / L kanamycin 황산). 불용성 물질과 살균 필터 오렌지 표면에 뜨는을 제거하려면 30 분, 원심 분리기에 대한 혼합 40 ML H 2 O에 1 타블렛을 분해 :.와 Centrum은 완전한 B-비타민과 추적 금속을 제공하는 아연을 보충 최대 2 주와 M9 4 ML / L를 사용하는을위한 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 재고 솔루션입니다.
참고 : 원하는 경우 15 N 강화 NH 4 CIA 같으니, 13 C-농축 포도당 또는 기타 안정적-동위 원소 - 라벨 전구체이 단계에서 M9 매체에 포함 할 수 있습니다. - 갓 변형 BL21 (DE3) 변형 E.에서 100 ML 스타터 문화의 예방 M9/Kan 매체에서 대장균. 200 rpm으로 흔들어와 37 ° C에서 하루 아침에 성장.
- 다음날 아침, 스타터 문화의 OD 600 확인 -이 2 이상의 범위에 있어야합니다. Centrum은 - 보충 M9 매체의 1 L 총 볼륨에 100 ML 스타터 문화를 희석. , 2 L 당황 플라스크 (각 플라스크 500 ML 문화)로 분할하고 37 성장 ° C OD 600 0.6에 도달 할 때까지 140 rpm으로 흔들어.
- 18 흔드는 온도를 설정 ° C와 문화가 유도되기 전에 완전히 냉각 할 수 있도록 1 시간에 떨고 계속 진행합니다.
- (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액)의 SDS-PAGE 분석을위한 사전 유도 샘플을 채취 한 후, trpLE - 펩타이드 융합의 표현을 유도하기 위해 0.1 mm까지 최종 농도에 IPTG 추가 할 수 있습니다. 18 ° IPTG 유도에 따라 하루 아침에 C/140 RPM (16-20 시간)로 성장하고 계속합니다.
3. 포함 바디 준비 및 니켈 매트릭스 바인딩
- 최소한의 중간에서 하룻밤 표현 문화의 최종 OD 600 변수와 우입니다uld 2.5 및 5.0 사이. SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 채취 (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액) 5,000 X g에서 20 분을 위해 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- Resuspend 세포 펠렛 50 ML의 용해 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL 산도 7.5, 20 MM β-ME, 0.2 M NaCl) 1 L 문화에서. 세포 현탁액은 나중에 처리하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다.
- 5 분을위한 얼음 1 분과 휴식을위한 최대 출력에서 얼음에 sonication으로 세포를 Lyse. 우리는 ½ 인치 높은 강도 교체 팁과 Misonix의 Sonicator 3000 (최대 출력 600w)을 사용합니다. sonication / 3주기위한 냉각을 반복합니다.
- 20,000 XG 15 분 동안 원심 분리하여 불용성 포함 본체 (IB) 자료를 수집하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 가벼운 색의 세포 파편의 느슨한, 얇은 층은 울창한 IB 펠릿의 상단에 표시 될 수 있으며,이 방법은 부드러운 교반과 물이나 버퍼를 사용하여 씻겨 할 수 있습니다. 단계 3.3 및 3.4은 IB 분율의 순도를 향상시키기 위해 반복 될 수 있습니다 경우 desi붉은 색. 펠렛 및 표면에 뜨는 물질의 샘플이 포함 기관에 trpLE-TM 퓨전 현지화를 확인 SDS-PAGE 분석에주의해야한다.
- 처리 문화의 리터 당 25-50 ML을 사용하여, 구아니딘 솔루션 (6 M 구아니딘 HCL, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 5 MM β-ME)에 IB 알약을 분해. 이 단계는 교반 및 비정기 온화한 sonication과 함께 몇 시간을 필요로합니다.
- 75,000-100,000 XG에서 1 시간 20 ° C.에 대해 원심 분리하여 IB lysate를 삭제합니다 0.2 μm 막 통해 표면에 뜨는 및 필터를 가만히 따르다.
- 50 ML 원뿔 튜브에서 삭제 IB lysate, 또는 물과 구아니딘 솔루션에 equilibrated로 세척 된 니켈 친화 수지와 함께 안전하게 폐쇄 할 수있는 큰 그릇이 조화를 이루고 있습니다. trpLE - DAP12TM는 (그림 3, 차선 2) 여기에 표시된대로 비슷한 정도 표현 fusions을 위해 처리 문화의 리터 당 3-4 ML 해결 수지를 사용하십시오. 객실 t에서 밤새 잠복기에 의해 배치 바인드 부드러운 혼합과 emperature.
4. 온 열 산화에 Crosslinking
- 전체 볼륨을 통해 유동 될 때까지 지속적으로 추가, 다공질 베드 지원 빈 중력 흐름 열에 IB의 lysate / 니켈 수지 정지를로드합니다. 수집하고 여전히 언 바운드 융합 단백질을 포함 할 수 있습니다 flowthrough을 따로 넣어.
- β-ME 5 MM를 포함하는 우레아 용액의 5 침대 볼륨 (8 M의 우레아, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl)과 중력 흐름에 의해 니켈 수지를 씻으십시오.
- β-ME없이 우레아 용액의 5 침대 볼륨으로 다시 니켈 수지를 씻으십시오.
- 20 μM CuSO 4, 글루타티온을 산화 두 음을 보충 된 우레아 용액의 5 침대 볼륨과 니켈 수지에게 세 번 씻으십시오. 이 세척 후, 열 배출구를 닫고 최대 이황화 결합 형성을 허용하도록 실온에서 30 분을 품다.
5. TFA의 용출 및 Quantitation
내용은 ">주의 : Trifluoroacetic 산 (TFA)은 피부와 가스와 접촉에 심각한 화상을 원인은 매우 자극 아르 집중 TFA는 눈 보호와 비 라텍스 장갑과 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에만 사용되어야합니다 모든 화학 호환성을 확인하십시오.. 자료는 사용, 폴리 프로필렌은이 프로토콜의 모든 단계와 호환됩니다.- 물 10 침대 볼륨으로 산화 우레아 용액을 깨끗이 씻어 열 콘센트에 진공 라인을 적용하여 열 침대를 건조.
- 열 배출구를 닫고 단정 (99~100%) TFA의 1.5 침대 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 산에도 노출을 보장하고 5 분에 품다 할 수있는 작은 주걱으로 니켈 수지를 젓는다. 열 배출구를 열고 액체를 모두 밀어 필요한 경우 주사기 또는 압축 공기 라인 부드럽게 pressurizing, 산성 eluate를 수집합니다.
- 깔끔한 TFA의 또 다른 1.5 침대 볼륨있는 산 용출 단계를 반복합니다. beade의 완전한 해체를 방지하기 위해이 단계에서 빠르게 작업D 아가로 오스 행렬. 단백질 수율은 맥주 램버트 방정식과 trpLE - 펩타이드 시퀀스의 이론적 몰 흡광 계수에 따라이 시점에서 결정될 수있다. trifluoroethanol의 TFA의 eluate (1시 20분에서 1시 50분까지) (TFE)의 샘플을 희석하고 빈과 같은 희석에 TFA / TFE를 사용하여, 280 nm의에서 흡광도를 측정합니다.
6. CNBr의 소화
주의 : 시안 브로마이드 (CNBr)는 매우 독성 만 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에서 처리해야합니다. 안전 안경, 실험실 코트와 비 라텍스 장갑 등의 보호구가 절대적으로 필요합니다. CNBr는 습기에 반응하고 열기 전에 실내 온도에 가져해야합니다. 중화 / CNBr 오염 된 솔루션 및 자료의 폐기 방법에 대한 안내는 기관의 안전 사무소에 문의하십시오.
- 부드럽게 혼합하면서 물 dropwise 추가하여 80% 최종 TFA 농도에 산 eluate을 희석. 석출물 형태의 경우DD는 다시 단정 TFA의 작은 볼륨 (0.5-1 ML) 솔루션은 물 80 % 재 올바른 다음, 분명히까지. 액체 질소에 동결 즉시 샘플을 lyophilizing, SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 미리 알림 견본을보세요.
- 폐쇄, 사전 무게 튜브에 안전하게 독성 화학 물질을 체중 돌봐 또는 화학 퓸 후드 내부의 균형을 사용하여 약 0.2 g / ML에 CNBr 크리스탈을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 섞는다. 플러시와 불활성 가스 (질소 또는 아르곤 스트림)에서 반응 용기를 밀봉하여 빛으로부터 보호, 실온에서 3-4 시간을 품다.
- SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 후 다이제스트 샘플을 가지고 고정 즉시 lyophilize. 예상 펩타이드 단지의 크기에 따라 3.5 kDa 이하의 분자량의 컷오프와 재생 셀룰로오스 투석 카세트 나 튜브 (셀룰로스 아세테이트이 집중 산성에 용해 됨)로 요약 반응을 전송합니다. 에 물 4 L로 하루 아침에 Dialyze화학 연기 후드는 TFA 농도를 감소하고 unreacted CNBr을 분해합니다. 야간 투석시 볼륨이 크게 증가 (만큼 3 배 두에로)에 대한 투석 카세트 나 튜브의 방을 둡니다.
- 투석 카세트 나 튜브 (단백질의 대부분은 TFA 농도가 감소 할 때 침전 됨)에서 일시 중지 침전물과 dialyzed 반응 용액을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 정지 전송합니다. 고정 물과 CNBr / TFA의 흔적을 제거하는 lyophilize. 이 단계는 몇 일이 필요 할 가능성이 있습니다.
주의 : dialyzed 알림 반응과 투석 물을 모두 독성 및 적절한 예방 조치와 함께 처리 / 처리 된 것으로 간주 계속해야합니다. - 사전 유도하고 수확 단계, 포함 몸 표면에 뜨는 및 펠렛, TFA의 eluate 및 CNBr - 소화 물질의 문화의 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분석 될 수있다. 95 가열하여 샘플을 준비 Invitrogen NuPAGE LDS sampl에 ° C전자 버퍼. TFA의 eluate 및 다이제스트 샘플은 산화 crosslinking의 제품 식별 및 평가를 촉진하기 줄이고 비 절감 두 조건에서 준비되어야한다.
- 가장 작은 다이제스트 제품의 최적 해상도 MES-SDS 실행 버퍼를 사용하여 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 샘플을 분리합니다.
7. 이황화 - 가교 펩타이드 복합 단지의 반전 상 HPLC 정화
- 예비 규모로 2-3 ML 단정 개미의 산성, 부하 (21.2 X 150mm)에 동결 건조 된 다이제스트 제품의 100 밀리그램까지 분해 애질런트 ZORBAX SB-300 용매의 C3 PrepHT 열 A (일반적으로 10~20%의 아세토 니트릴 5 0.1 % TFA와 물에 이소프로판올 -10 %).
- 적어도 5 열 권 이상의 용매 B의 기울기 (0.1 % TFA로 아세토 니트릴 또는 이소프로판올)에 요약 제품을 Elute. 다른 펩타이드 시퀀스에 대한 최적의 기울기 조건의 선택에 대한 제안 토론을 참조하십시오.
- 보세요SDS-PAGE 분석 및 동결 즉시 lyophilize 각 HPLC 분율 50-100 μl 샘플. HPLC의 용매의 제거는 빠른 것입니다 1-2 시간에 완료해야합니다.
- 더 환원제와 Invitrogen NuPAGE LDS 샘플 버퍼에 95 ° C로 가열하여 SDS-PAGE에 동결 건조 된 HPLC 샘플을 준비합니다. 시원하고 그들과 다시 난방 간단히 중 하나에 100 밀리미터 DTT를 추가 균등이 microcentrifuge 튜브에 각각의 샘플을 분할.
- MES-SDS는 위의 버퍼를 실행과 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 감소와 비 감소 HPLC 샘플을 분리합니다. 소형, 소수성 펩티드는 종종 Coomassie 잘 얼룩 차지하지 않고 예상 분자량에서 실행되지 않을 수 있습니다. 그러나, 감소 및 비 감소 시료의 비교 가교 펩타이드 제품과 순도 평가의 식별을 용이하게한다.
- 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 시간의 비행 (든-TO하여 후보 펩타이드 함유 분수를 분석F) 질량 분석법은 (토론 참조) 관심있는 종을 확인하고 예상 질량을 확인합니다.
- , 결합 순수, 가교 TM 펩타이드 단지를 포함하는 HPLC의 분수를 고정하고 lyophilize 및 수율을 결정하는 최종 제품의 건조 중량을. 높은 이소프로판올 콘텐츠와 분수는 냉동 상태로 유지되지 않을 수 있습니다. 펩타이드 분수 오히려 보송 보송 한 동결 건조 제품보다 필름으로 건조하면, 순수 hexafluoroisopropanol (HFIP)의 작은 볼륨에서 완전히 필름을 다시 분해 정지 한 후 다시 lyophilize. HFIP - 처리 제품은 쉽게 나올 팁과 무거워 작은 흰색 콘해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
trpLE fusions에 달성 표현의 수준은 변수 첨부 된 펩타이드의 아미노 산 순서에 크게 의존한다. 그림 3은 사전 유도의 SDS-PAGE 분석 (차선 1) 시간의 수확 (차선 2) 표시 문화 1 리터과 4 ML의 니켈 매트릭스에서 순수한 그대로 trpLE-DAP12TM 융합의 약 120 밀리그램이 나왔고 문화에서 샘플. trpLE - DAP12TM 융합의 모든으로 표면에 뜨는 (레인 3)에 반대 포함 몸 펠릿 (레인 4)로 번역되었습니다.
니켈 - 정화 trpLE-DAP12TM 융합의 약 70 % dimeric 양식 (: TFA의 eluate의 비 감소 및 감소 된 샘플 그림 3, 레인 5, 6)에 이황화 - 가교했다. 이 trpLE-DAP12TM 융합을위한 일반적인 결과이지만, crosslinking 효율은 엔지니어링 cysteines의 위치와 다릅니다. DAP12TM의 펩타이드 제품은 총 CNBr 알림 샘플 (레인 7 및 8),에 쉽게 식별 할 수 없습니다하지만 감소 요약 샘플에있는 그대로 융합 trpLE 조각 밴드 (레인 8)의 비교는 융합의 소화가 ~ 60 % 완료했습니다 나타냅니다.
도 4는 예비 규모의 C3 열 (총 구속력 용량 ~ 단백질 200 밀리그램)을 사용하여 뒤집 상 HPLC로 요약 제품의 분리를 보여줍니다. 융합의 아로마 내용이 부족하기 때문에 우리는 일반적으로 214 나노 미터보다 280 나노 미터에서 흡광도를 모니터링 할 수 있습니다. 산화의 실행 90 MG를 들어, CNBr - 소화 trpLE-DAP12TM 융합은 3 ML 깔끔한 개미의 산성에 용해 된 100 % 용매 (60 % H 2 O, 40 % 아세토 니트릴, 0.1 % TFA)에 열에로드. 바운드 제품은 10 ML / 분의 유량으로 60~90% 용매 B (75 % 이소프로판올, 25 % 아세토 니트릴, 0.1 % TFA) 다음 0-60%의 2 단계 기울기에 용출되었다. SDS-PAGE 분석 (그림 5)에 따라 각 분획에 포함 된 주요 제품은 코드 아씨를 사용하여 크로마토 그램 위에 표시됩니다그림 2에 gned. 다른 펩타이드 시퀀스에 대한 기울기 조건을 최적화에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에서 HPLC 기울기 용리의 최적화를 참조하십시오.
펩타이드 제품은 SDS-PAGE (그림 5)와 든 - TOF (그림 6) 주요 HPLC의 분수의 분석에서 쉽게 확인할 수있다. DAP12TM의 펩티드하며, 우리의 경험에서 많은 다른 소수성 TM 펩티드는 예상 분자량 (여기에 표시된 15 N-라벨 종에 대한 3366 달톤 단량체 및 6730 달톤 이량 체)에 비해 크게 감소 마이그레이션 속도로 실행합니다. 로드 금액 (데이터가 게재되지 않음) 다양되기 때문에이 문제는 직접 겉보기 분자량의 연속에 젤과 결과에로드 펩타이드의 양에 관련되어 있습니다. 그러나, 100 밀리미터 DTT (레인 7, 8을 비교)를 감소시 최고 5 전기 영동의 변경은 가교 펩타이드로를 식별제품입니다. 든 - TOF MS 분석은 6729.2 Daltons에서 주요 정상과 dimeric 펩타이드의 신원을 확인하고 다른 주요 제품 (그림 6) 알 수 없습니다. 이 준비의 순수한 이황화 - 가교 DAP12TM 펩타이드 homodimer의 최종 수율은 문화의 리터 당 7.5 밀리그램했다.
1 그림. 의 아미노산 번역 trpLE-DAP12TM 코딩 지역의 DNA 순서가. 폴리펩티드 순서의 주요 영역은 강조 표시하고 오른쪽에 레이블 색으로. 시안 브로마이드 (CNBr) 절단 및 산화 crosslinking에 대한 고유 한 내부 메티오닌 (메트로폴리스)과 시스테인 (Cys) 잔류가 각각 시안과 보라색으로 표시됩니다. HindIII와 BamHI 제한 사이트 (굵게 밑줄)은 플라스미드 및 mA의 고유y는 관심의 또 다른 시퀀스를 TM 펩타이드 시퀀스를 대체하는 데 사용할 수.
그림 2. 절차의 개략도는. 프로토콜의 주요 단계는 텍스트 레이블에 표시됩니다. trpLE - DAP12TM 융합의 주요 세그먼트는 그림 1에서와 같이 색으로되어 있습니다. crosslinking 및 요약 단계에서 주요 폴리펩티드 제품은 AF 표시하고 자신의 설명 및 예상 분자량 (15 N-표시)을 여기에 나열되어 있습니다 : [A] trpLE 조각 : 13,769 Daltons, [B] 그대로 trpLE-DAP12TM 융합 : 17,118 Daltons , [C] 그대로 trpLE - DAP12TM 융합 이량 체 : 34,233 Daltons, [D] 단일 흘리고 trpLE - DAP12TM 융합 이량 체 : 20,482 Daltons, [E] monomeric DAP12TM 펩타이드 : 3366 Daltons, [F] dimeric DAP12TM 펩타이드 : 6730 Daltons. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. trpLE - DAP12TM 표현, 정화, crosslinking와 소화 단계 SDS-PAGE 분석 문화 샘플 (레인 1, 사전에 유도 단계 2.5, 레인 2, 수확, 스텝 3.1). 및 포함 바디 사립 샘플 (레인 3, 표면에 뜨는, 차선이 4, 펠렛, 단계 3.4)이 100 밀리미터 DTT로 감소했다. 및 사후 CNBr 샘플 (레인 7, 8, 단계 6.3), 니켈 열 (단계 6.1 레인 5, 6)에서 TFA의 eluate이 (NR) 비 감소 실행 및 100 MM DTT (R)으로 감소 된 것은 아니라 확인을 위해 표시 제품을 이황화 - 가교. * Monomeric 및 dimeric 펩타이드 제품S E와 F는 Coomassie의 착색에 의해 제대로 시각화하고 따라서이 젤에 감지되지 않습니다.
4 그림. DAP12TM 이황화 - 가교 이량 체의 반전 상 HPLC 정화는. 애질런트 ZORBAX SB-300 C3 PrepHT에 CNBr - 소화, 산화 및 trpLE - DAP12TM 융합 제품을 동결 건조 (90 밀리그램) 3 ML 개미의 산 (100 %)에 용해되었으며로드 (21.2 X 150mm) 용매의 열 (60 % H 2 O, 40 % 아세토 니트릴, 0.1 % TFA). 60-90% 용매 B (75 % 이소프로판올, 25 % 아세토 니트릴, 0.1 % TFA) 다음 0-60%의 2 단계 기울기는 10 ML / 바인딩 제품을 elute하는 분의 유량에 실행되었다. 임의 해제 : 분수는 (AU 흐름을 통해으로 수집 (FT)와 네 개의 주요 봉우리는 214 nm의 흡광도를 추적 위에 표시됩니다의) 각 일부에 포함 된 주요 제품은 그림 2에 할당 된 코드를 사용하여 표시됩니다. 원하는 DAP12TM 가교 제품 피크가 음영 처리됩니다.
그림 5. 반대로 상 HPLC 제품의 SDS-PAGE 분석. 흐름 -을 통해 (FT)와 최대 한 샘플은 비 감소 실행되었습니다. 피크 2, 3, 4 샘플은 모두 비 감소 (NR) 실행하고 이황화 가교 제품의 신원을 확인하기 위해 100 MM DTT (R) 치료에 의해 감소되었다. 각 분수의 주요 제품 (그림 2에 할당 된 자신의 코드와는) [FT, Pk1]했다 : A, trpLE 조각, [Pk2] : B, 그대로 trpLE - DAP12TM 융합 모노머와 C, 그대로 퓨전 이량 체, [Pk3] : D, 단일 흘리고 trpLE-DAP12TM 이량 체와 E, monomeric DAP12TM 펩타이드, [Pk4] : F, 이황화-가교 DAP12TM의 이량. 두 제품은 monomeric 펩타이드에도 불구하고 *로 (대표 REULTS 참조) 논의, 이동성의 농도에 의존 근무 시간이 Pk3 (NR 및 R) 및 Pk4 (R)의 낮은 MW 제품을 만들어 서로 다른 분자량 것 같습니다.
6 그림. HPLC-정화 DAP12TM 펩타이드 이량 체의 든 - TOF 질량 spectrometric 분석. HPLC 분율 네 (1 μl)의 샘플은 아세토 니트릴에 sinapinic 산 (SA) 모체의 포화 용액으로 1:1 혼합 얇은 층의 상단에 발견되었습니다 에탄올에 준비 포화 용액에서의 건조 SA 행렬. 든 - TOF 분석은 이량 체 질량을 가교 예상 DAP12TM의 펩타이드에서 제품을 공개6730 Daltons (6729.2098, 15 N-라벨)의뿐만 아니라 3365.7105에서 미성년자 제품, 가능성이 가장 높은 두 번 이온화 종. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 15 참조)의 핵심 촉매 조각은 표현의 범위에서 최저를 나타냅니다 레벨 동안 밀접 범위 (게시되지 않은 데이터)의 최고 끝을 나타내는 여기에 사용 된 순서에 관한 DAP12TM 변종. 최적의 IPTG의 농도는 각각의 새로운 순서에 대해 실험적으로 결정해야합니다. 우리 표준은 0.1 MM, 높은 농도 (최대 1 ㎜) 보통 모두 낮은 표현 수준에 따라 크게 감소 수율 및 낮은 문화 밀도의 결과입니다t의 수확 (참조 7 예를 들어 그림 1A에 대한 참조).
제시 프로토콜에 유사. 프로토콜 여기서 설명은 이황화 - 가교 TM 펩타이드 복잡한 DAP12TM homodimer 8의 생산을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 쉽게 환원제 제거하고 바인딩 된 제품을 (4.3 및 4.4) 산화하기위한 두 세척 단계를 생략하여 monomeric 펩티드를 생성하도록 구성된다. 우리는 이전 절차의 또 다른 대안 trimeric DAP12-DAP12 - NKG2C TM 어셈블리를 (참조 8 안에 설명 방법을 참조) 대표 covalently 안정화 TM 펩타이드 복합를 생산하려면 여기를보고 사용했습니다. 이 응용 프로그램에서는 1 TM trpLE-DAP12 융합과 2 TM trpLE-DAP12-NKG2C 융합이 포함 바디 준비 (단계 3.1-3.2) 이전에 문화의 수확 단계에서 혼합 하였다. 절차는 trpLE을 가교 heterodimeric를 분리하는 별도의 HPLC 단계를 포함CNBr 다이제스트 전에 산 eluate (단계 5.3)에서 퓨전 제품입니다. 펩타이드 제품의 C3 정화 한 가닥이의 프레임 C-터미널 융합으로 NKG2C TM 도메인을 수행하는 이황화 - 가교 DAP12TM의 이량 체의 복구있었습니다. 세제 micelles이 복합 솔루션 NMR 구조는 NKG2C TM의 도메인을 기본, 반 평행 방향으로 8 DAP12 조립 것으로 확인되었습니다. 이 대안의 추가 단계는 크게 최종 제품의 수율을 감소 : 전형적인 준비는 두 번째의 과잉과 함께 한 융합 4L에서 펩타이드 'trimer "의 8-10 밀리그램이 나왔고. 이 대안은 서로 다른 두 가지 TM 시퀀스를 포함하는 이황화 - 안정화 단지를 생산하고자하는 연구자에 대한 좋은 시작 프로토콜을 나타냅니다.
니켈 화성 정화주의 사항이 있습니다. 집중 산을 사용하여 건조 니켈 항목에서 단백질의 용출은 특별한 절차이며, 다시 의무가 없습니다니켈 행렬의 사용. 이미 다졸 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하여 매우 소수성 trpLE-TM fusions을 elute하려고 시도 단백질 불완전 복구를 높이고 가교 종 우선적으로 열 (게시되지 않은 결과)에 보존되었다. 니켈 매트릭스와 야간 배치 바인딩 프로토콜의 권장 수량은 신중하게 trpLE-TM 단백질로 행렬을 포화함으로써 오염 물질의 공동 정화를 최소화하기 위해 최적화되었습니다. 우리는 정기적으로 크게 시그마 HIS의 선택 니켈 동질 매트릭스 (15-20 MG / ML 수지)의 보급 바인딩 용량을 초과 수익률과 매우 순수한 제품을 복구합니다. NMR을위한 고가의 안정된 - 동위 원소의 시약과 라벨을 특히 때 산 용출은 더 오프셋 니켈 매트릭스의 비용보다 CNBr 알림으로 전환하는 데 필요한 중간 단계, 그리고 가교 제품의 증가 수율을 제거합니다.
시안 브로마이드 알림 조건.의 출시반응 속도와 단백질 용해도가 모두 이러한 조건에서 매우 유리한이기 때문에 CNBr의 trpLE에서 융합 TM 펩티드는 일반적으로 용매로 70% 개미의 산성을 사용하여 수행됩니다. 그러나, 치료 시간은 세린과 트레오닌 잔류 16,17의 포르 밀 에스테르 화을 피하기 위해 (알림 1 시간 미만) 비교적 짧게 유지해야하고 가능한 트립토판 잔류 18, 그의 관찰 된 대량 종 등의 대량 분석법에 의해 감지 아르 수정 I-formylation 예상 질량에 비해 28 (n)이 Daltons입니다. 여기에 설명 된대로 TFA에 대한 우리의 환경 설정은 모두 이러한 수정 사항을 방지합니다. 1 % 안에 요소 XA 단백 분해 효소를 사용하여 trpLE-TM 융합의 효소 절단 튼 X-100는 11을보고 있지만, 대부분의 trpLE-TM fusions 및 세제 micelles의 절단 사이트 어려움의 합병증의 가난한 용해도는 아마의 일반적인 유틸리티를 제한되었습니다 이 접근 방법.
pepti의 반전 상 HPLC 정화CNBr 알림에서 드 제품은이 절차에서 가장 어려운 단계이며, 각각의 새로운 trpLE-TM 순서에 대한 최적화를 필요로 할 가능성이 있습니다. 다음 관찰은 다양한 시퀀스를 처리에서 온 가장 trpLE-TM fusions에 대한 진정한 보유 할 가능성이 있습니다
고정 단계의 선택 우리는 애질런트 ZORBAX 안정 - 본드 C3 열을 (300 Å의 구멍 크기, 5 μm의 입자 크기)을 찾습니다. 농축 산에 무거운 노출에 따라 선택성 측면에서 우수한 고정 단계, 해결 능력과 안정성이되는 것입니다. 세미 예비 (9.4 mm 직경)와 예비 규모 (21.2 mm 직경) 크기를 사용할 수 있습니다 우리의 손에 잘 수행했습니다. C4, 디 페닐 및 cyanopropyl 고정 단계는 C3에 비해 비슷한 소수성 범위에서 유용한 대안 펩타이드 선택성을 제공 할 수 있습니다.
에 대한 깔끔한에서 동결 건조 된 CNBr 요약 제품의 HPLC에 대한 요약 제품의 준비. 해산마이크 산성 HPLC 분리에 대한 최상의 결과를 제공합니다. TFA 또는 아세토 니트릴, trifluoroethanol 및 dimethylformamide 낮은 용해도에 종종 같은 유기 용제의 준비, 여러 종을 포함하는 광범위한 봉우리에서 열 바인딩 및 / 또는 제품의 용출 감소. 위의 설명과 같이 장시간 노출 펩타이드 sidechains 16-18의 포르 밀 변경 될 수 있기 때문에주의가 열을로드하기 전에 바로 개미의 산에 제품을 준비하기 위해 이동해야합니다.
HPLC 기울기 용리의 최적화. 우리는 보통 10~20%의 아세토 니트릴 또는 5~10% 개미의 산성에 용해 용매 A. TrpLE-TM의 fusions 및 다이제스트 제품으로 0.1 % TFA와 물에 이소프로판올로 시작하는로 C3 열을 바인딩합니다 여기에 표시된대로만큼 40% 아세토 니트릴 (그림 4). 대부분 해방 trpLE 조각의은 (trpLE 조각은 FT 유일의 단백질 제품이 오니, 이용에 참고하여 이러한 조건을 통해 흐를 수 있습니다비율 : 그림 5, 차선 1), 우리는 원하는 제품에 대한 열의 전체 바인딩 용량을 증가이 관찰의 장점을 취했습니다. 아세토 니트릴 및 이소프로판올은 기울기 용매로 매우 효과적입니다, 우리는 종종 75% 이소프로판올로 때때로 이상한하지만 효과적인 조리법, 25 % 아세토 니트릴, 0.1의 결과, 용출 프로파일을 수정하는 기존의 용매 솔루션을 혼합하여 최종 기울기 조건에 도착 %의 TFA 솔루션은 여기에 표시된 DAP12TM 정화에 대한 솔루션을 B로 사용. 문제가있는 것으로 매우 소수성 제품은 10 % trifluoroethanol (TFE)와 A와 B 모두에서 TFA의 증가 농도 (최대 0.3 %) (게시되지 않은 결과)까지 추가로 아세토 니트릴 또는 이소프로판올을 사용하여 용출되었습니다. 기타 C4 고정 단계 9 부탄올 / 아세트산 모바일 단계를 사용하여 좋은 결과를보고했습니다.
요약 제품의 분석. 주요 분석 기법의 두S는 여기에 사용 SDS-PAGE와 든 - TOF MS는 trpLE-TM 제품의 매우 소수성 자연 복잡 할 수 있습니다. CNBr / TFA 다이제스트 반응 및 HPLC의 분수에서 동결 건조 된 분석 샘플은 때때로 SDS-PAGE 젤에 대한 높은 분자 - 중량을 합산로 실행합니다. 우리는 SDS-PAGE 자주 구제 문제를 준비하기 전에 HFIP 재 lyophilization의 작은 볼륨으로 동결 건조 된 샘플의 치료를 찾으십시오. TM 펩타이드 시퀀스도 쉽게 든 - TOF MS 분석시 이온화되지 않을 수 있습니다, 따라서 매우 약한 신호를 제공 할 수 있습니다. 우리는 에탄올의 sinapinic 산 (SA)의 포화 용액이 처음 플레이트와 매트릭스의 균일 한 얇은 층을 만들 건조에 발견되는 TM 펩타이드 샘플을 준비하기위한 최적화 된 절차를 사용했습니다. 아세토 니트릴의 SA의 포화 용액으로 1:1 혼합 펩타이드 함유 HPLC 분율의 샘플을 다음 건조 매트릭스 레이어의 상단에 발견된다. 손에서 두 여섯 배 더 큰 신호 대 잡음 사이의이 방법 수율 비교d는 펩타이드을 찾는 방법 : SA 혼합물을 직접 깨끗한 든 판에.
다운 스트림 응용 프로그램입니다. 솔루션 NMR 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 지질이나 세제 시스템에 TM 펩타이드 복합체를 reconstituting위한 방법은 다양 일반적으로 신중하게 각각의 새로운 시스템과 응용 프로그램에 맞게해야합니다. 관련 매개 변수의 전체 토론이 잘이 프로토콜 문서의 범위를 넘어 따라서이다. 솔루션 NMR을 사용하여 성공적으로 응용 프로그램의 샘플 준비에 대한 자세한 내용은, 우리는 주제 1,19하고, 거기에 참조에 이러한 최근 리뷰 독자를 참조하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
