Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Summary

Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.

Abstract

Physikalische Wechselwirkungen zwischen den Lipid-eingebetteter Alpha-Helix-Domänen von Membranproteinen spielen eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Montage von Membranprotein-Komplexen und bei dynamischen Prozessen wie Transmembran (TM)-Signalisierung und Regelung Zelloberflächenprotein Ebenen. Das Verständnis der strukturellen Merkmale der Fahrt die Assoziation von bestimmten Sequenzen erfordert ausgefeilte biophysikalische und biochemische Analysen der TM-Peptid-Komplexe. Allerdings macht die extremen Hydrophobie Transmembrandomänen sie sehr schwierig zu handhaben Verwendung von Standard-Techniken der Peptidchemie, und Herstellung von geeigneten Lehrmaterial erweist sich oft als prohibitiv anspruchsvoll. Identifizieren Bedingungen, unter denen Peptide stabile helicale Konformationen und bilden Komplexe annehmen kann spontan fügt eine weitere Schwierigkeit. Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Homo-oder Hetero-dimeren TM-Peptid-Komplexe aus Materialien, die in E. exprimiert werden coli, wodurch Einbau von stabilen Isotopenmarker für Kernspinresonanz (NMR) oder nicht-natürlichen Aminosäuren für andere Anwendungen relativ kostengünstig. Die wichtige Neuerung an diesem Verfahren ist, dass TM-Komplexe gebildet werden und gereinigt, wie kovalent assoziiert (Disulfid-vernetzt) ​​Anordnungen, die stabile, homogene stöchiometrische und Strukturen bilden können, wenn sie in Wasch-, Lipid oder eine andere Membran-mimetischen Materialien rekonstituiert. Wir präsentieren auch sorgfältig optimierten Verfahren zur Expression und Reinigung, die in gleicher Weise anwendbar, ob die Herstellung von ein TM-Domänen oder vernetzte Komplexe sind und beraten für die Anpassung dieser Methoden, um neue TM-Sequenzen.

Introduction

Dieses Protokoll Angaben eine Prozedur entwickelten wir zu Disulfid-stabilisierten Komplexe von Transmembran (TM)-Peptide für strukturelle Untersuchungen mittels NMR-Lösung zu erzeugen haben. Das Verfahren nutzt die Expression durch die robuste ΔtrpLE1413 Fusionssystem (siehe unten) ergab und ermöglicht TM-Peptid-Komplexe mit definierter Zusammensetzung zu erzeugenden mit hochentwickelten stabilen Isotopen Markierungstechniken für moderne mehrdimensionalen NMR-Experimente werden. Wir haben diese Techniken eingesetzt werden, um mehrere NMR-Strukturen, die wichtige neue Informationen darüber, wie Lymphozyten-Aktivierung Immunrezeptoren werden aus mehreren Membran-Protein-Untereinheiten durch Interaktionen zwischen ihren TM-Domänen zusammengesetzt (kürzlich in ¹ bewertet) ergab bestimmen. Diese Techniken sind auf viele andere Membranprotein Systeme sowie einer Vielzahl von nachgeschalteten analytischen Methoden zusätzlich zur Lösung NMR. Während die hier angegebene Beispiel nutzt nativen Cysteinresteum einen Komplex, der die natürliche Disulfid-gebundenen Proteins nachahmt, das Design ist gleichermaßen gut für die Erstellung von engineered Disulfidbindungen, um Komplexe, die normalerweise miteinander durch schwächere, nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Homo-und Hetero-dimeren TM Komplexe stabilisieren geeignet gehaltene epidermal growth factor receptor (EGFR)-Familie Proteinen ^2-4 oder heterodimeren αβ Integrin-Komplexen ^5,6.

Extrem hydrophoben Peptidsequenzen wie die von der Lipid-Doppelschicht abgeleitet umspannenden Teile TM Proteine ​​sind äußerst schwierige Themen für biochemische und biophysikalische Studien. Zusätzlich dazu, dass sehr schwierig zu manipulieren Verwendung von Standard-Protein-und Peptidchemie Techniken, sind sie oft ziemlich toxisch für Zellen und sind daher schwer rekombinant herzustellen. Wir ^7,8 und andere ^9-11 gehabt haben bedeutende Erfolge Ausdruck solch schwierigen Peptidsequenzen in Bakterien als in-frame carboxyterminalenFusionen mit einer modifizierten Version des ΔtrpLE1413 Sequenz aus dem E. abgeleitete coli trp Operon ^12. Die ~ 13 kDa Polypeptid trpLE von dieser Sequenz codierten können in hohen Konzentrationen unter einem T7-Promotor erzeugt werden und vollständig in Einschlusskörpern, wo Probleme bezüglich Toxizität und / oder Instabilität umgangen lokalisiert. Modifikation der Sequenz durch Hinzufügen einer Amino-terminalen Histidin-Tag ^9-13 und Eliminierung von internen Methionin und Cystein-Reste aus der Sequenz ¹⁴ trpLE erlaubt trpLE-Peptid-Fusionen durch Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt werden und verdaut mit Cyanogenbromid (CNBr ), um den gewünschten Peptidsequenz. Wir haben erfolgreich dieses System verwendet, um mehr als ein Dutzend verschiedene Sequenzen als trpLE Fusionen darstellen Membranprotein-Fragmente, die weniger als vier Transmembrandomänen enthalten und exprimieren ^(7,8 und unveröffentlichte Ergebnisse; siehe auch Abschnitt Diskussion).

Diewichtige Neuerung in diesem Protokoll ist die Identifizierung von Bedingungen, unter denen die unstrukturierte und sehr schlecht löslich trpLE-TM Fusionen effizient im Rahmen eines optimierten Workflow Disulfid-vernetzt werden können. Mehrere Aspekte der Expression mit hoher Ausbeute, die Handhabung und Reinigung von Peptid Produkte wurden ebenfalls gründlich optimiert, und den Empfehlungen hier vorgestellten gleichermaßen relevant für die Produktion von Nicht-Disulfid-vernetztes (monomeren) TM Peptid Produkte.

Protocol

Ein. Klonierung und Construct Design-

Klonen die Sequenzen von Interesse in der PMM-Peptid-Vektor (die auf Wunsch zur Verfügung gestellt werden) mit HindIII und BamHI Restriktionsstellen (siehe Abbildung 1). Die doppelsträngige DNA-Insert sollte aufzunehmen, in der folgenden Reihenfolge: eine HindIII-Stelle; eine einzige Codon für Methionin CNBr-Spaltung, die E. coli-Codon-optimierte kodierende Sequenz, einen Stoppcodon, eine BamHI-Stelle. Alle anderen Methionine im Peptid sollten beseitigt werden und die Dipeptidsequenz Asp-Pro sollte vermieden werden, da es auch in sauren Bedingungen gespalten werden.

Ein einzigartiges Cysteinrest sollten in jedem Peptid-Sequenz entsprechend der gewünschten Positionierung des Disulfid Vernetzungsdichte im fertigen Komplex eingeführt werden, und alle anderen Cysteinen sollte zu Serin mutiert werden. Das Plasmid trägt eine Kanamycin-Resistenzkassette zur Auswahl.

2. Die Expression von trpLE-peptide Fusion

1. Make-up und Sterilfilter M9/Kan minimal Wachstumsmedium (0,1 mM CaCl _2, 2 mM MgSO _4, 3 g / L KH ₂ PO _4, 7,5 g / L Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 0,5 g / l NaCl, 1 g / l NH ₄ Cl, 4 g / l Glucose, 50 mg / l Kanamycinsulfat). Supplement mit Centrum Komplett von A bis Zink, B-Vitamine und Spurenelemente liefern: 1 Tablette in 40 ml H ₂ O mit dem Mischen für 30 min, Zentrifuge, um unlösliches Material und Sterilfilter die orangefarbene Überstand zu entfernen. Lagerung der Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen und verwenden 4 ml / L in M9.
   Hinweis: ¹⁵ N-angereicherten NH ₄ Cl, ¹³ C-angereicherte Glukose oder anderen stabilen Isotopen-markierten Vorstufen können in M9-Medium in dieser Phase aufgenommen werden, falls gewünscht.
2. Beimpfen von 100 ml Vorkultur aus frisch transformierten BL21 (DE3)-Stamm E. coli in M9/Kan Medium. Wachsen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm.
3. Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die OD ₆₀₀ der Starter-Kultur - dies sollte im Bereich von 2 oder größer sein. Verdünnen Sie die 100 ml Starterkultur in 1 L Gesamtvolumen von Centrum-ergänzt M9 Medium. Aufgespalten in zwei 2 L Schikanekolben (500 ml Kultur in jedem Kolben) und wachsen bei 37 ° C unter Schütteln bei 140 rpm, bis die OD ₆₀₀ erreicht 0.6.
4. Stellen Sie den Schüttler Temperatur auf 18 ° C und weiter Schütteln für 1 Stunde, so dass Kulturen vollständig abkühlen, bevor Induktion.
5. Nehmen Vorinduktion Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD ₆₀₀ = 1), dann Hinzufügen von IPTG bis zu 0,1 mM Endkonzentration um die Expression des trpLE-Peptid-Fusion zu induzieren. Weiter wachsen bei 18 ° C/140 rpm über Nacht (16-20 h) unter IPTG-Induktion.

3. Inclusion Body Vorbereitung und Nickel Matrix Binding

1. Die endgültige OD ₆₀₀ der Übernachtungen Ausdruck Kulturen in Minimalmedium ist variabel und should zwischen 2,5 und 5,0 liegen. Eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD ₆₀₀ = 1) und zu sammeln Zellen durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g beträgt.
2. Zellpellet aus 1 l-Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zellsuspensionen können eingefroren für spätere Verarbeitung werden.
3. Lysieren Zellen durch Beschallung auf Eis bei maximaler Ausgangsleistung für 1 min und Rest auf Eis für 5 min. Wir verwenden eine Misonix Sonicator 3000 (max Leistung 600 Watt) mit einem ½-Zoll-High-intensity austauschbaren Spitze. Wiederholen Beschallung / Kühlung für drei Zyklen.
4. Sammeln unlöslicher Einschlusskörper (IB) Material durch Zentrifugation für 15 min bei 20.000 × g und der Überstand verworfen. Ein loses, dünne Schicht aus helleren Zelltrümmern kann sichtbar auf der Oberseite des dichten IB-Pellet, dies kann weggewaschen werden unter Verwendung von Wasser oder Pufferlösung unter leichtem Schütteln. Schritte 3.3 und 3.4 wiederholt werden, um die Reinheit des IB Fraktion zu verbessern, sobald desired. Proben von Pellet und Überstand Material sollte für die SDS-PAGE-Analyse getroffen werden, um trpLE-TM Fusion Lokalisation an inclusion bodies bestätigen.
5. Aufzulösen IB Pellets in Guanidin-Lösung (6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME) unter Verwendung von 25 bis 50 ml pro Liter Kultur verarbeitet. Dieser Schritt wird mehrere Stunden unter Rühren und gelegentliche milde Ultraschallbehandlung erfordern.
6. Deaktivieren Sie das IB Lysat durch Zentrifugation für 1 Stunde bei 75,000-100,000 xg und 20 ° C. Den Überstand umfüllen und durch ein 0,2 &mgr; m-Membran.
7. Kombinieren der freiwerdenden IB Lysat, in einem 50 ml konischen Röhrchen oder einen größeren Behälter, die sicher geschlossen werden kann, mit Nickel Affinitätsharz, das mit Wasser und äquilibriert um Guanidin-Lösung gewaschen wurde. Verwenden Sie 3-4 ml angesiedelt Harzes pro Liter der Kultur für Fusionen, die zu einem ähnlichen Grad auszudrücken, wie trpLE-DAP12TM hier (Abbildung 3, Spur 2) gezeigt, verarbeitet. Batch bind durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur t emperatur unter leichtem Rühren.

4. On-Column-oxidative Vernetzung

1. Legen Sie das IB-Lysat / Nickel Harzsuspension in ein leeres Schwerkraft Säule mit porösem Bett Unterstützung, indem kontinuierlich, bis das gesamte Volumen fließt. Sammeln und beiseite der Durchfluss, die gegebenenfalls noch ungebundenen Fusionsprotein.
2. Waschen Nickel Harz durch Schwerkraftfluß mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung (8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl), enthaltend 5 mM β-ME.
3. Waschen Sie die Nickel-Harz nochmals mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung ohne β-ME.
4. Wäscht den Nickel-Harz ein drittes Mal mit 5 Bettvolumen von Harnstoff-Lösung, die mit 20 pM CuSO ₄ und 2 mM oxidiertes Glutathion ergänzt wurde. Nach diesem Waschen, schließen Sie die Spalte Steckdose und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur auf maximal Disulfidbindungsbildung ermöglichen.

5. TFA Elution und Quantifizierung

Inhalt "> ACHTUNG: Trifluoressigsäure (TFA) verursacht schwere Verbrennungen bei Berührung mit der Haut und Dämpfe sind stark reizend Concentrated TFA sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube mit Augenschutz und Nicht-Latex-Handschuhe verwendet werden Überprüfen Sie die chemische Kompatibilität aller.. verwendeten Materialien Polypropylen ist kompatibel mit allen Schritten dieses Protokolls.

1. Auswaschen oxidierende Harnstofflösung mit 10 Bettvolumina Wasser und trocknen Sie die Säulenbett durch Anlegen eines Vakuums Zeile der Spalte Steckdose.
2. Schließen Sie die Säulenauslass und fügen 1,5 Bettvolumina ordentlich (99-100%) TFA. Rühren Sie die Nickel-Harz mit einem kleinen Spatel noch Einwirkung von Säure zu gewährleisten und Inkubation für 5 min. Öffnen des Säulenauslaß und sammelt das saure Eluat Unterdrucksetzen vorsichtig mit einer Spritze oder Druckluftleitung ggf. zum Ausschieben gesamte Flüssigkeit.
3. Wiederholen Sie den Säureelution Schritt mit weiteren 1,5 Bettvolumina ordentlich TFA. Arbeiten Sie schnell bei diesem Schritt um eine vollständige Auflösung des Beade vermeidend Agarosematrix. Proteinausbeute kann an dieser Stelle gemäß dem Lambert-Beer-Gleichung und dem theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten des trpLE-Peptid-Sequenz bestimmt werden. Verdünnen einer Probe des TFA-Eluat (1.20 bis 01.50) in Trifluorethanol (TFE) und Messung der Absorption bei 280 nm, mit TFA / TFE bei gleicher Verdünnung als Blindprobe.

6. CNBr Verdauung

ACHTUNG: Bromcyan (CNBr) ist extrem giftig und sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube behandelt werden. PSA einschließlich Schutzbrille, Kittel und Nicht-Latex-Handschuhe sind zwingend erforderlich. CNBr reaktiv ist gegenüber Feuchtigkeit und auf Raumtemperatur vor dem Öffnen. Kontaktieren Sie Ihren institutionellen Safety Office Anweisungen zur Neutralisierung / Entsorgung von CNBr-kontaminierten Lösungen und Materialien.

1. Verdünnen des sauren Eluats auf 80% TFA endgültige Konzentration durch tropfenweise Zugabe von Wasser unter Mischen sanft. Wenn ein Niederschlag bildet, eindd zurück ein kleines Volumen (0,5 bis 1 ml) von reinem TFA bis die Lösung klar, dann wieder richtig zu 80% mit Wasser. Nehmen Sie eine 5 ul pre-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse, das Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisieren die Probe sofort.
2. Fügen CNBr Kristalle etwa 0,2 g / ml, wobei darauf zu achten die giftige Chemikalie sicher wiegen in geschlossenen, vorgewogenen Rohren oder mit einer Waage in der chemischen Abzugshaube. Vorsichtig mischen, bis sie vollständig aufgelöst. Spül-und versiegeln das Reaktionsgefäß unter Schutzgas (Stickstoff oder Argon-Strom) und inkubieren 3-4 Stunden bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
3. Nehmen Sie eine 5 ul post-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Übertragen des Digest Reaktion auf eine Regeneratcellulose Dialysekassette oder Schlauch (Celluloseacetat wird in konzentrierter Säure auflöst) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3,5 kDa oder weniger, je nach der Größe des erwarteten Peptid-Komplexes. Dialysieren über Nacht auf 4 l Wasser in derLaborabzug zur Verringerung der TFA-Konzentration und zersetzen nicht umgesetztes CNBr. Lassen Sie Platz in der Dialyse Kassette oder Schläuche für eine signifikante Zunahme des Volumens (so viel wie zwei-bis drei-fach) während Dialyse über Nacht.
4. Entfernen der dialysierten Reaktionslösung mit suspendierten Niederschlag aus der Dialyse-Kassette oder Schlauch (meiste Protein auszufällen wird, wenn die Konzentration verringert wird TFA) und übertragen die Suspension auf 50 ml konischen Röhrchen. Einfrieren und lyophilisieren, um Wasser und Spuren von CNBr / TFA zu entfernen. Dieser Schritt ist wahrscheinlich erfordern mehrere Tage.
   ACHTUNG: Sowohl die dialysierten Digest Reaktion und die Dialyse Wasser sollte weiterhin als giftig und behandelt / entsorgt mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden.
5. Proben der Kulturen aus Vorinduktion und Ernte Stufen Einschlusskörper Überstand und Pellet, TFA-Eluat und CNBr-verdaute Material kann durch SDS-PAGE analysiert werden. Planen Proben durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample Puffer. TFA Eluat und verdauen Proben sollten sowohl in reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen hergestellt werden, um Produkt-Identifikation und Bewertung von oxidativen Vernetzung zu erleichtern.
6. Trennen der Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel unter Verwendung MES-SDS Laufpuffer für eine optimale Auflösung der kleinsten Digest Produkte.

7. Reversed-Phase HPLC Aufreinigung von Disulfid-vernetztes Peptid-Komplexen

1. Man löst bis zu 100 mg lyophilisiertes Digest Produkte in 2-3 ml Ameisensäure und ordentlich Last auf einem präparativen Maßstab (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT Spalte in Lösungsmittel A (typischerweise 10-20% Acetonitril oder 5 -10% Isopropanol in Wasser mit 0,1% TFA).
2. Eluieren die Digest-Produkten in einem Gradienten von Lösungsmittel B (Acetonitril oder Isopropanol mit 0,1% TFA) über mindestens 5 Säulenvolumen. Siehe die Diskussion um Vorschläge für die Auswahl der optimalen Gradienten Bedingungen für verschiedene Peptidsequenzen.
3. Nehmen50-100 ul-Proben von jedem HPLC-Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Entfernung von Lösungsmittel HPLC erfolgt rasch und sollte in 1-2 h abgeschlossen.
4. Planen lyophilisiert HPLC-Proben für SDS-PAGE durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel. Cool und aufgeteilt jeder Probe gleichmäßig in 2 Mikrozentrifugenröhrchen, Zugabe von 100 mM DTT, einer von ihnen und Nachwärmsysteme kurz.
5. Trennungen reduzierten und nicht reduzierten HPLC-Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel mit MES-SDS Laufpuffer wie oben. Klein, hydrophobe Peptide oft nicht nehmen Coomassie gut färben und kann nicht an ihren erwarteten Molekulargewichten laufen. Jedoch sollte Vergleich reduzierten und nicht reduzierten Proben zu erleichtern Identifizierung der vernetzten Peptidprodukte und Beurteilung der Reinheit.
6. Analysieren der Kandidaten-Peptid-haltigen Fraktionen durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (siehe Diskussion) zur Identifizierung der interessierenden Spezies und bestätigen die erwartete Masse.
7. Kombinieren, einfrieren und lyophilisieren HPLC-Fraktionen, die das reine, vernetzten TM-Peptid-Komplex und einen Trockengewicht des Endprodukts an Ausbeute zu bestimmen. Fraktionen mit hoher Isopropanol Inhalte dürfen nicht eingefroren bleiben. Wenn Peptidfraktionen trocknen auf einem Film anstatt einem flauschigen lyophilisierten Produkts, wieder auflösen den Film vollständig in einem kleinen Volumen von reinem Hexafluorisopropanol (HFIP), einfrieren und lyophilisieren erneut. Der HFIP-behandeltes Produkt sollte eine kleine, weiße Kegel, einfach gekippt wird und abgewogen werden.

Representative Results

Die Höhe der Ausdruck für trpLE Fusionen erreicht ist variabel und hängt stark von der Aminosäure-Sequenz der angehängten Peptid. Abbildung 3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Vorinduktion (Spur 1) und Time-of-Ernte (Spur 2) Proben aus einer Kultur, die ca. 120 mg reines, intakte trpLE-DAP12TM Fusionsprotein aus 1 Liter Kultur und 4 ml Nickelmatrix ergab. Alle der trpLE-DAP12TM Fusionsprotein wurde zu der Einschlusskörper Pellet (Spur 4), um Überstand (Bahn 3) gegenüberliegenden lokalisiert.

Etwa 70% der gereinigten Nickel-trpLE-DAP12TM Fusion war der dimeren Form (3, Spuren 5 und 6: nicht reduzierten und reduzierten Proben von TFA-Eluat) Disulfid-vernetzt. Dies ist ein typisches Ergebnis für die trpLE-DAP12TM Verschmelzung, sondern Vernetzung Effizienz wird mit der Platzierung von technischen Cysteine ​​variieren. Die DAP12TM Peptid Produkte sind nicht leicht identifizierbar insgesamt CNBr Digest Proben (Spuren 7 und 8),aber der Vergleich des intakten Fusion und trpLE Fragment Banden im reduzierten Digest Probe (Spur 8) anzeigt, daß die Verdauung des Fusionsproteins betrug ~ 60% abgeschlossen.

Abbildung 4 zeigt die Trennung von Digest-Produkte durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer präparativen Maßstab C3 Spalte (insgesamt Bindekapazität ~ 200 mg Protein). Da der aromatische Gehalt des Fusionsproteins ist gering wir typischerweise überwacht die Absorption bei 214 nm 280 nm statt. Zu diesem Lauf 90 mg oxidiert wurde CNBr-verdaute trpLE-DAP12TM Fusion in 3 ml Ameisensäure ordentlich gelöst und auf der Säule in 100% Lösungsmittel A (60% H ₂ O, 40% Acetonitril, 0,1% TFA). Gebundenen Produkte wurden in einem zweistufigen Gradienten von 0-60% von 60-90% Lösungsmittel B (75% Isopropanol, 25% Acetonitril, 0,1% TFA) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml / min eluiert, gefolgt. Die Hauptprodukte in jeder Fraktion nach SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 5) enthalten sind, über dem Chromatogramm unter Verwendung des Codes assi angedeutetgned in 2. Siehe Optimierung der HPLC Gradientenelution in der Diskussion Abschnitt für weitere Details auf die Optimierung Gradienten Bedingungen für verschiedene Peptidsequenzen.

Peptide Produkte sind leicht erkennbar in der SDS-PAGE (Abbildung 5) und MALDI-TOF (Abbildung 6) Analysen der wichtigsten HPLC-Fraktionen. DAP12TM Peptiden und in unserer Erfahrung, viele andere hydrophobe TM Peptide, mit deutlich reduzierten Migration Preise im Vergleich zu ihrer erwarteten Molekulargewichten (3366 Dalton Monomer und 6730 Dalton Dimer für die ¹⁵ N-markierten Spezies hier gezeigt) laufen. Dieses Verhalten ist direkt mit der Menge des Peptids auf dem Gel und führt zu einem Kontinuum der scheinbaren Molekulargewichte geladen Zusammenhang als der Betrag geladen variiert wird (Daten nicht gezeigt). Allerdings erkennt die Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität der Peaks bei Reduktion 5 mit 100 mM DTT (vergleiche Spuren 7 und 8) dies als die vernetzten PeptidProdukt. MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt die Identität des dimeren Peptids mit dem Hauptpeak bei 6729,2 Dalton und offenbart keine anderen Hauptprodukte (Abbildung 6). Der Endumsatz der reinen Disulfid-vernetztes DAP12TM Peptid Homodimer aus dieser Zubereitung betrug 7,5 mg pro Liter Kultur.

Abbildung 1. DNA-Sequenz des trpLE-DAP12TM kodierende Region mit seiner Aminosäure-Übersetzung. Key Regionen der Polypeptidsequenz werden hervorgehoben und mit Etiketten auf der rechten Seite farbcodiert. Die eindeutigen internen Methionin (Met) und Cystein (Cys)-Reste für Bromcyan (CNBr) Spaltung und oxidative Vernetzung in Cyan und Violett hervorgehoben sind. HindIII und BamHI Restriktionsstellen (fett und unterstrichen) sind einzigartig in der Plasmid-und may verwendet, um die TM Peptidsequenz mit einer anderen Sequenz von Interesse ersetzt werden.

Abbildung 2. Schematische Darstellung des Verfahrens. Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll werden im Text Etiketten angegeben. Key Segmente des trpLE-DAP12TM Fusion sind wie in Abbildung 1 farblich codiert. Wichtige Polypeptid Produkte aus der Vernetzung und verdauen Schritte sind beschriftet AF und sind hier mit ihrer Beschreibung und der erwarteten Molekulargewichte ⁽¹⁵ N-markiert) aufgeführt: [A] trpLE Fragment: 13.769 Dalton; [B] intakten trpLE-DAP12TM Fusion: 17.118 Dalton , [C] intakten trpLE-DAP12TM Fusion Dimer: 34.233 Dalton; [D] single-gespaltenen trpLE-DAP12TM Fusion Dimer: 20.482 Dalton; [E] monomeren DAP12TM Peptid: 3366 Dalton; [F] dimeren DAP12TM Peptid: 6730 Dalton. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. SDS-PAGE-Analyse von trpLE-DAP12TM Expression, Reinigung, Vernetzung und digest Schritte Kultur Proben (Spur 1, Vorinduktion, Schritt 2,5, Spur 2, Ernte, Schritt 3,1). Und Inclusion Body prep Proben (Spur 3, Überstand, Spur 4, Pellet; Schritt 3.4) wurden mit 100 mM DTT reduziert. TFA Eluat aus Nickel-Säule (Bahnen 5 und 6; Schritt 6,1) und Post-CNBr Probe (Bahnen 7 und 8, Schritt 6,3) ausgeführt wurden nicht reduzierten (NR) und reduziert mit 100 mM DTT (R), wie zur Bestätigung Produkte Disulfid-vernetzt sind. * Monomere und dimere Peptid-Produkts E und F sind schlecht durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht und daher nicht nachweisbar auf diesem Gel.

Abbildung 4. Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des DAP12TM Disulfid-vernetztes Dimer. Oxidiertes, CNBr-verdauten und lyophilisiert trpLE-DAP12TM Fusionsprodukte (90 mg) wurden in 3 ml Ameisensäure (100%) gelöst und auf einem Agilent Zorbax SB-300 C3 geladen PrepHT (21,2 x 150 mm)-Säule in Lösungsmittel A (60% H ₂ O, 40% Acetonitril, 0,1% TFA). Ein zweistufiges Gradienten von 0-60% bei einer 60-90% Lösungsmittel B (75% Isopropanol, 25% Acetonitril, 0,1% TFA) gefolgt wurde bei einer Flussrate von 10 ml / min bis gebundenen Produkte eluieren laufen. Fraktionen als Flow-Through gesammelt (FT) und vier größere Peaks oberhalb der 214 nm Absorbanz Spur markiert (AU: willkürliche units) und die Hauptprodukte in jeder Fraktion enthaltenen unter Verwendung der Codes in 2 zugeordnet. Die gewünschte DAP12TM vernetzte Produkt Peak beschattet.

Abbildung 5. SDS-PAGE-Analyse von Umkehrphasen-HPLC-Produkte. Durchflußarmatur (FT) und Peak 1 Proben wurden ausführen nicht reduzierte. Peak 2, 3 und 4 Proben wurden sowohl nicht-reduzierten (NR) ausgeführt und reduziert durch die Behandlung mit 100 mM DTT (R), um die Identität von Disulfid vernetzte Produkte zu verifizieren. Die wichtigsten Produkte in jeder Fraktion (mit ihren Codes in Abbildung 2 zugeordnet) waren [FT, Pk1]: A, trpLE Fragment; [Pk2]: B, intakte trpLE-DAP12TM Fusion Monomer und C, intakte Fusion Dimer [PK3]: D, single-gespaltenen trpLE-DAP12TM-Dimer und E, monomeren DAP12TM Peptid; [Pk4]: F-, Disulfid-vernetztes DAP12TM Dimer. * Wie bereits diskutiert (siehe VERTRETER reults), macht eine Konzentrations-abhängige Verschiebung der Mobilität der low-MW-Produkte in PK3 (NR und R) und Pk4 (R) scheinen unterschiedlichen Molekulargewichten sein, obwohl beide Produkte monomere Peptid sind.

Abbildung 6. MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse der HPLC-gereinigte Peptid DAP12TM Dimer. Eine Probe von HPLC-Fraktion 4 (1 ul) wurde 1:1 mit einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure (SA)-Matrix in Acetonitril vermischt und beschmutzt auf einer dünnen Schicht getrockneter SA Matrix aus einer gesättigten Lösung in Ethanol vorbereitet. MALDI-TOF-Analyse ergibt ein Produkt mit der zu erwartenden DAP12TM Peptid vernetzte Masse Dimervon 6730 Dalton (6729,2098; ¹⁵ N-markiert) sowie als Nebenprodukt bei 3365,7105, wahrscheinlich die Doppel-ionisierten Spezies. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Die Expression von trpLE-TM Fusionen. Nach unserer Erfahrung sind trpLE-TM Fusionen schlecht in eine reiche Kultur-Medium bei 37 ° C angegeben, und die Kultur hier beschriebenen Bedingungen bewährt für viele verschiedene Sequenzen mit 1-4 Transmembrandomänen mit Ausbeuten bis hin bewährt haben 50 bis 150 mg / l reines, intaktem Fusionsprotein. Fusions-Codierung Drei-oder Vier-TM GPCR Fragmente (TM1-humanen CCR5 TM3 und TM4-TM7 bezeichnet) oder ein Kern katalytisches Fragment von menschlichem Signalpeptidpeptidase (vier Transmembrandomänen; Lit. ¹⁵⁾ die niedrigste in diesem Bereich von Expression Ebenen, während DAP12TM Varianten eng mit der Abfolge welche hier repräsentieren das höchste Ende des Bereichs (unveröffentlichte Daten) verwandt. Die optimale IPTG Konzentration sollte experimentell für jede neue Sequenz bestimmt werden. Unser Standard ist 0,1 mm und höheren Konzentrationen (bis zu 1 mM) in der Regel in deutlich reduzierten Ertrag durch beiden unteren Expression und unteren Kultur Dichte einer führent Ernte (siehe zum Beispiel 1A in Bezug ^7).

Variationen des vorgestellten Protokoll. Das Protokoll hier skizzierten beschreibt die Herstellung eines Disulfid-vernetztes TM-Peptid-Komplex, das DAP12TM Homodimer ^8. Alternativ wird das Protokoll leicht an monomeren Peptiden durch Weglassen der zwei Waschschritte können und zum Entfernen Reduktionsmittel und oxidieren die gebundenen Produkte (4.3 und 4.4) zu erzeugen. Wir haben zuvor verwendet eine weitere Variation des Verfahrens hier berichtet, um eine kovalent stabilisierte TM Peptidkomplex, der die trimeren DAP12-DAP12-NKG2C TM Anordnung (siehe Referenz ⁸ und der darin beschriebenen Methoden) zu erzeugen. Bei dieser Anwendung wurden ein 1-TM trpLE-DAP12-Fusion und einer 2-TM-DAP12-trpLE NKG2C Fusion an der Kultur Ernte Stufe vor Einschlusskörper Zubereitung (Schritt 3,1 bis 3,2) vermischt. Das Verfahren beinhaltete eine zusätzliche HPLC Schritt, um die heterodimeren vernetzt trpLE isolierenFusionsprodukt aus der Säure Eluat (Schritt 5,3) vor CNBr Digest. C3 Aufreinigung der Peptidprodukte resultierte in der Wiedergewinnung einer Disulfid-vernetztes DAP12TM Dimer in der ein Strang durchgeführt NKG2C die TM-Domäne als eine In-Frame-C-terminale Fusion. Die Lösung NMR Struktur dieses Komplexes in Detergensmicellen bestätigt, dass die NKG2C TM Domäne mit DAP12 montiert in seiner nativen, anti-parallelen Ausrichtung ^8. Die zusätzlichen Schritte in dieser Variation signifikant die Ausbeute des Endproduktes: Eine typische Zubereitung ergab 8-10 mg Peptid "Trimer" von 4L einer Fusion mit einem Überschuß des zweiten kombiniert. Diese Variante stellt eine gute Ausgangsposition Protokoll für Forscher, die Disulfid-stabilisierte Komplexe mit zwei unterschiedlichen TM-Sequenzen zu erzeugen.

Hinweise auf Nickel-Affinitätsreinigung. Die Elution des Proteins aus der Säule unter Verwendung von Nickel getrockneten konzentrierten Säure um ein ungewöhnliches Verfahren und entzieht sich erneutDer Nickel-Matrix-verwenden. Versuche, die extrem hydrophob trpLE-TM-Fusionen unter Verwendung von Imidazol oder EDTA eluiert Folge unvollständige Gewinnung von Protein und die vernetzten Spezies wurden bevorzugt an der Säule (unveröffentlichte Ergebnisse) gehalten ist. Die empfohlene Menge Nickel-Matrix und dem Nachtverarbeitung-bindendes Protokoll wurden sorgfältig optimiert werden, um die Matrix mit trpLE-TM-Protein abzusättigen und minimieren dadurch die Co-Reinigung von Verunreinigungen. Wir routinemäßig erholen sehr reine Produkte mit Renditen, die deutlich über das beworbene Bindungsfähigkeit des Sigma HIS-Select Nickel Affinity Matrix (15-20 mg / ml Harz). Die Säureelution beseitigt auch Zwischenschritte erforderlich, um den Übergang in die CNBr verdauen, und die erhöhte Ausbeute von vernetzten Produkten größer sind als die Kosten für die Nickel-Matrix, insbesondere, wenn die Kennzeichnung mit teuren stabilen Isotopen Reagenzien für NMR.

Bromcyan Digest Bedingungen. Veröffentlichung derkondensierten TM Peptide aus trpLE in CNBr wird üblicherweise unter Verwendung von 70% iger Ameisensäure als Lösungsmittel, da sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit und Proteinlöslichkeit äußerst günstig sind unter diesen Bedingungen. Allerdings muss Behandlungszeiten vergleichsweise kurz gehalten (unter 1 h für Digest) zu Formyl Veresterung von Serin und Threoninresten ^16,17 vermeiden und möglicherweise I-Formylierung Tryptophanreste ^18, Modifikationen, die durch Massenspektrometrie nachweisbar ist, wie Arten, deren beobachtete Masse sind ist 28 (n) relativ zu der Dalton erwartete Masse. Unsere Vorliebe für TFA, wie hier beschrieben vermeidet diese Änderungen überhaupt. Enzymatische Spaltung eines trpLE-TM Fusionsprotein mit Faktor Xa-Protease in 1% Triton X-100 wurde ¹¹ gemeldet, aber die schlechte Löslichkeit der meisten trpLE-TM-Fusionen und der Komplikation der Spaltstelle in Unzugänglichkeit Detergensmicellen wahrscheinlich schränken den allgemeinen Verwendbarkeit dieser Ansatz.

Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des peptide Produkte aus dem CNBr Digest ist die schwierigste Schritt in diesem Verfahren und ist wahrscheinlich die Optimierung für jede neue trpLE-TM-Sequenz. Die folgenden Beobachtungen stammen aus der Verarbeitung von vielen verschiedenen Sequenzen und sind wahrscheinlich zu halten für die meisten trpLE-TM Fusionen wahr:

Auswahl der stationären Phase finden wir Agilent ZORBAX Stable-Bond C3 Säulen (300 Å Porengröße, 5 um Partikelgröße)., Um eine überlegene stationären Phase in Bezug auf Selektivität, Auflösung und Stabilität unter starker Belastung zu konzentrierter Säure sein. Semi-präparative (9,4 mm Durchmesser) und präparativen Maßstab (21,2 mm Durchmesser) Größen sind verfügbar und haben sich sehr gut in unseren Händen durchgeführt. C4, Diphenyl und Cyanopropyl stationären Phasen kann auch nützliche alternative Peptid Selektivität in einem ähnlichen Hydrophobie Reichweite im Vergleich zu C3.

Vorbereitung der Digest-Produkte für die HPLC. Die Auflösung des lyophilisierten CNBr Digest Produkte ordentlich fürmic Säure liefert die besten Ergebnisse für die HPLC-Trennung. Zubereitung in TFA oder organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril, Dimethylformamid und Trifluorethanol führt oft geringere Löslichkeit, verkleinerter Spaltenparitäts Bindung und / oder Elution der Produkte in breiten Peaks mit mehreren Arten. Es ist darauf zu Produkten in Ameisensäure unmittelbar vorzubereiten, bevor Kolonnenbelastung werden, weil bei längerer Exposition in Formyl Modifikation der Peptid-Seitenketten ^16-18 führen kann, wie oben diskutiert.

Optimierung der HPLC Gradientenelution. Wir arbeiten normalerweise mit 10-20% Acetonitril oder 5-10% Isopropanol in Wasser mit 0,1% TFA als Lösungsmittel A TrpLE-TM-Fusionen und deren Digest Produkte in Ameisensäure gelöst beginnt der C3 Säule in so binden bis zu 40% Acetonitril wie hier dargestellt (Abbildung 4). Viel von dem freigesetzten Fragment kann trpLE durchströmen unter diesen Bedingungen (Beachten Sie, dass das einzige Fragment trpLE Proteinprodukt im FT istFraktion: Abbildung 5, Spur 1), und wir haben den Vorteil dieser Beobachtung getroffen werden, um die gesamte Bindekapazität der Säule für die gewünschten Produkte zu erhöhen. Acetonitril und Isopropanol sind sehr effektiv als Gradienten Lösungsmittel, und wir kommen oft an unserem letzten Gradienten-Bedingungen durch Mischen bereits vorhandenen Lösungsmittel Lösungen Elutionsprofile ändern, was manchmal seltsam, aber wirksame Rezepte wie die 75% Isopropanol, 25% Acetonitril, 0,1 % TFA-Lösung als Lösung B zur Aufreinigung DAP12TM hier dargestellt verwendet. Extrem hydrophoben Produkten problematisch waren, wurden eluiert mit Acetonitril oder Isopropanol unter Zusatz von bis zu 10% Trifluorethanol (TFE) und erhöhte Konzentrationen von TFA (bis 0,3%) sowohl in A und B (unveröffentlichte Ergebnisse). Andere haben gute Ergebnisse mit Butanol / Essigsäure mobilen Phasen mit einem C4 stationären Phase ⁹ berichtet.

Analyse Digest Produkte. Sowohl der wichtigsten Analyse-Techniks hier verwendeten SDS-PAGE und MALDI-TOF MS, kann durch die extrem hydrophoben Charakter der trpLE-TM-Produkte kompliziert sein. Lyophilisierte Proben aus analytischen CNBr / TFA Digest Reaktionen und HPLC-Fraktionen manchmal so hoch-molekularen Aggregaten auf SDS-PAGE-Gelen laufen. Wir finden, dass die Behandlung von lyophilisierten Proben mit einem kleinen Volumen von HFIP und Wiederverwendung Lyophilisation vor der Zubereitung für die SDS-PAGE oft das Problem behebt. TM Peptidsequenzen kann auch nicht ohne weiteres während der MALDI-TOF-MS-Analyse zu ionisieren, und kann daher dem sehr schwache Signale. Wir haben ein optimiertes Verfahren zur Herstellung von Peptid-TM-Proben, in dem eine gesättigte Lösung von Sinapinsäure (SA) in Ethanol ersten auf der Platte und getrocknet, um eine gleichmäßige dünne Schicht der Matrix zu machen ist fleckig verwendet. Eine Probe von Peptid enthaltenden HPLC-Fraktion gemischt im Verhältnis 1:1 mit einer gesättigten Lösung von SA in Acetonitril wird dann auf der Oberseite des getrockneten Matrixschicht gesichtet. In unseren Händen, vergleichen diese Methode Renditen zwischen zwei und sechs-fach höhere Signal-zu-Rausch-d gegen Flecken, die das Peptid: SA Mischung direkt auf einer sauberen MALDI-Platte.

Downstream-Anwendungen. Methoden zur Wiederherstellung TM Peptid-Komplexe in Lipid-oder Reinigungsmittel für Lösungs-NMR-und andere Downstream-Anwendungen sind sehr unterschiedlich und müssen in der Regel sorgfältig für jedes neue System und Anwendung zugeschnitten werden. Eine vollständige Diskussion der beteiligten Parameter ist daher weit über den Rahmen dieses Protokolls Artikel. Für Einzelheiten zur Probenvorbereitung von erfolgreichen Anwendungen mit Lösungs-NMR, verweisen wir den Leser auf diesen jüngsten Bewertungen zum Thema ^1,19 zit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanogen bromide	ALDRICH	P.No- C91492,CAS-506-68-3	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154, CAS Number 60-24-2	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol	SIGMA-ALDRICH	Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid	Merck KGaA	K41186564	Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea	UNIVAR, AJAX FINECHEM	Product Number, 817, CAS-No 57-13-6	When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE	Amresco	P.No-M110, CAS Number: 50-01-1	Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100	SIGMA	Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1	Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel	SIGMA-ALDRICH	Catalog Num- P6611	IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized	SIGMA-ALDRICH	Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator	QSONICA	S-3000 (discontinued)	Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3	Bio-Rad Laboratories	Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705	Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size	Agilent	Product No: 895150-909	Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels	Life Technologies	NP0341BOX	Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO	Thermo Scientific	Product No: 87724	Sample dialysis