Summary
Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.
Introduction
Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son 1 yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek için bu teknikler istihdam var. Bu teknikler, bir çok başka zar proteini sistemlerinin yanı sıra çözelti NMR ek olarak aşağı analitik yöntemler geniş bir yelpazede için de geçerlidir. Burada verilen örnekte yerli sistein kalıntıları kullanır ikendoğal disülfit-gümrüklü protein taklit eden bir kompleks oluşturmak için, tasarım eşit derecede iyi normalde böyle homo-ve hetero-dimerik TM kompleksleri gibi zayıf, non-kovalent etkileşimler arada tutarak kompleksleri stabilize etmek için tasarlanmış disülfit bağları oluşturmak için uygundur epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi proteinleri 2-4 veya heterodimerik αβ integrin kompleksleri 5,6.
Bu tür lipit türetilmiş olanlar gibi, son derece hidrofobik peptid dizileri kapsayan-çift-katlı TM proteinlerinin kısımlarını biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için son derece zor konusudur. Standart protein ve peptid kimyası teknikleri kullanılarak manipüle etmek çok zor olmasının yanı sıra, genellikle hücreler için oldukça toksik olan ve bu nedenle yeniden birleştirilerek üretmek zordur. Biz 7,8 ve diğerleri 9-11 sahip olan in-frame karboksi-terminal olarak bakteri gibi zor peptid sekansları ifade önemli bir başarıE. türetilen ΔtrpLE1413 dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu ile füzyonları coli trp operon 12. Bu sekans ile kodlanan ~ 13 kDa trpLE polipeptid bir T7 promotor altında yüksek düzeyde üretilebilir ve tamamen toksisite ve / veya istikrarsızlık ile ilgili problemler atlatılabilir edilir dahil organları lokalize edilmektedir. Bir amino-terminal 9-histidin etiketi 13 ve trpLE sıra, iç metionin ve sistein kalıntıları ortadan kaldırılması metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve sindirildi edilmesi için izin verilen 14 trpLE-peptid füzyonları ve siyanojen bromür (CNBR kullanılarak eklenmesi ile sekans modifikasyonu ) istenen peptid dizisi serbest kalmasını sağlar. Biz başarıyla en fazla dört TM alanları içeren membran proteini parçaları temsil trpLE füzyonlar gibi bir düzine farklı dizilerin daha ifade etmek için bu sistemi kullanılmış (7,8 ve yayınlanmamış sonuçlar; ayrıca TARTIŞMA bölümüne bakınız).
Bu protokolde de önemli bir yenilik yapısal olmayan ve çok az çözünen trpLE-TM füzyonları verimli bir iş akışı bağlamında disülfür-çapraz bağlı olabilir hangi koşullar altında tespit edilmesidir. Yüksek verim ifadesi, taşıma ve peptid ürünlerinin saflaştırılması birkaç yönü de iyice optimize, ve burada sunulan öneriler olmayan disülfit çapraz bağlı (monomerik) TM peptid ürünlerinin üretimi için aynı derecede geçerli olarak oylandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonlama ve Construct Tasarım
HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (bkz. Şekil 1) kullanarak PMM-peptid vektör (hangi istek üzerine temin edilebilir) içine ilgi dizileri klonlama. Çift sarmallı DNA sokmasını aşağıdaki sırayla içermelidir: Bir HindIII sitesi; CNBR bölünme için tek bir metionin kodon; E. kodlama sekansı coli kodon-optimize peptid, bir stop kodonu, bir BamHI sitesi. Peptid diğer tüm methionines bertaraf edilmesi gerekir ve bu da asidik koşullar altında ayrılır edileceği gibi dipeptid sekans Asp-Pro kaçınılmalıdır.
Benzersiz bir sistein artığını nihai komplekse disülfid çapraz bağ arzu edilen konumlandırma göre her bir peptid sıranın içerisine sokulmuştur olmalıdır ve tüm diğer sistein, serin için mutasyonlu olmalıdır. Plazmit seçimi için bir kanamisin direnç kasedi taşır.
2. TrpLE-pepti İfadede Füzyon
- (0.1 mM CaCI2, 2 mM MgSO4, 3 g / L, KH 2 PO 4, 7.5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, makyaj ve steril filtre M9/Kan en az büyüme ortamının 1 g / L NH4CI, 4 g / L glukoz, 50 mg / L kanamisin sülfat). Çözünmeyen malzeme ve steril filtre turuncu süpernatant kaldırmak için 30 dakika, santrifüj için karıştırma ile 40 ml H 2 O 1 tablet çözülür:. Olan Merkez Komple A B vitaminleri ve iz metaller sağlamak Çinko Supplement 2 haftaya kadar ve M9 4 ml / L kullanımı için karanlıkta 4 ° C de saklayınız stok solüsyonu.
NOT: eğer istenirse 15 N-zenginleştirilmiş NH4CI, 13 C-zengin glikoz veya diğer sabit-izotop etiketli öncüleri, bu aşamada M9 ortam olarak dahil edilebilir. - Taze transforme BL21 (DE3) suşu E. 100 ml starter kültür inoküle M9/Kan ortamda coli. 200 rpm'de sallama ile 37 ° C 'de gece boyunca büyümeye.
- Ertesi sabah, başlangıç kültür OD 600, - bu 2 veya daha büyük bir aralık içinde olmalıdır. Merkez-takviye M9 orta 1 L toplam hacmi içine 100 ml starter kültür seyreltin. Iki 2 L şaşkın şişeler (her bir şişeye 500 ml kültür) bölünür ve 37 büyüyecek ° C OD 600 0.6 ulaşıncaya kadar 140 rpm'de sallayarak.
- 18 çalkalayıcı sıcaklığını ayarlayın ° C ve kültürler indüksiyonundan önce tamamen soğumasını sağlayan, 1 saat boyunca sallayarak devam.
- (OD 600 = 1 bir kültürün 50 ul eşdeğeri) SDS-PAGE analizi için bir ön-indüksiyon numune alın, sonra trpLE-peptid füzyon ifadesini teşvik etmek için 0.1 mM nihai konsantrasyona IPTG ilave edin. 18 ° IPTG indüksiyon altında gecede C/140 Devri (16-20 saat) büyüyor devam edin.
3. İçerme Vücut Hazırlama ve Nikel Matrix Ciltleme
- Az orta gecede ifade kültürlerin son OD 600 değişken ve sho olduğunuuld 2.5 ve 5.0 arasında olmalıdır. SDS-PAGE analizi için numune alın (OD 600 = 1 bir kültür 50 ul eşdeğeri) ve 5.000 x g'de 20 dakika süreyle santrifüj hücreleri toplamak.
- Yeniden süspanse hücre pelet, 50 ml lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM β-ME, 0.2 M NaCI) içinde 1 M kültüründen. Hücre süspansiyonu daha sonra işlenmek için dondurulmuş saklanabilir.
- 5 dakika buz üzerinde 1 dakika ve geri kalanı için maksimum çıkışta buz üzerinde sonication tarafından hücreleri Lyse. Biz ½-inç yüksek yoğunluklu değiştirilebilir ucu ile bir Misonix sonikatör 3000 (max çıkış 600 watt) kullanın. Sonication / üç kür için soğutma tekrarlayın.
- 20.000 g'de 15 dakika santrifüj ile çözünmeyen inklüzyon cisimciği (IB) malzeme toplayın ve supernatant atın. Açık renkli hücre enkaz gevşek, ince bir tabaka yoğun IB pelet üstünde görülebilir, bu nazik ajitasyon ile su veya tampon kullanarak uzak yıkanabilir. Adımları 3.3 ve 3.4 IB fraksiyonu saflığını iyileştirmek için tekrar edilebilir eğer desikırmızı. Pelet ve süpernatant malzeme örnekleri dahil organlarına trpLE-TM füzyon yerelleştirme onaylamak için SDS-PAGE analizi için alınmalıdır.
- İşlenmiş kültür litresi başına 25-50 ml kullanılarak guanidin çözeltisi (6 M guanidin HCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCI, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), IB granül çözülür. Bu adım, çalkalama ve sonikasyon ile zaman zaman hafif bir kaç saat gerektirir.
- 75,000-100,000 xg'de 1 saat ile 20 ° C için santrifüjleme ile IB lizat temizleme Bir 0.2 um membran ile süpernatantı ve filtre süzün.
- 50 ml'lik konik bir tüp içinde temizlenmiş IB lizat, ya da su ve guanidin çözeltisi ile dengelenmiş ile yıkandı nikel afinite reçine ile, sıkıca kapatılmış olabilir daha büyük bir kap birleştirin. TrpLE-DAP12TM (Şekil 3, şerit 2), burada gösterildiği gibi benzer bir dereceye kadar ifade füzyonları için işlenmiş kültür litre başına 3-4 ml yerleşik reçine kullanımı. Oda t geceleme kuluçkaya alarak Toplu bind nazik karıştırma ile emperature.
4. On-sütun Oksidatif Crosslinking
- Tüm hacmi akan kadar sürekli olarak ekleyerek, gözenekli yatak desteği ile boş bir yerçekimi akışı sütuna IB lizat / nikel reçine süspansiyon yükleyin. Toplamak ve hala çözülmüş füzyon proteini içerebilir flowthrough, bir kenara koymak.
- Β-ME 5 mM üre çözeltinin 5 yatak hacmi (8 M üre, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) ile yerçekimi akışı ile nikel reçine yıkanır.
- Β-ME olmadan üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile tekrar nikel reçine yıkayın.
- 20 uM CuSO 4 ve glutatyon okside 2 mM ile takviye edilmiş üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile nikel reçine üçüncü kez yıkayın. Bu yıkamadan sonra, sütun çıkış yakın ve en fazla disülfit bağ oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
5. TFA Elüsyon ve Miktar
içeriği "> DİKKAT: Trifloroasetik asit (TFA) deri ve duman ile temas şiddetli yanıklara neden son derece rahatsız edici olan Konsantre TFA göz koruması olmayan lateks eldiven ile onaylı kimyasal davlumbaz kullanılmalıdır tüm kimyasal uyumluluğunu kontrol edin.. malzemeler; polipropilen Bu protokol tüm adımları ile uyumludur.- Su 10 yatak hacmi ile oksitleyici üre çözeltisi yıkayın ve sütun çıkışına bir vakum hattı uygulayarak sütun yatak kurulayın.
- Kolon çıkışında kapatın ve düzgün (99-100%) TFA 1.5 yatak hacmi ekleyin. Asit ile dahi maruz kalmasının ve 5 dakika inkübe edilir ve küçük bir spatula ile nikel reçine karıştırın. Kolon çıkış açın ve tüm sıvı dışarı itmek için gerekli ise, bir şırınga veya basınçlı hava hattı ile yavaşça basınçlandırma, asit ile arındırıldı ve toplamak.
- Düzgün TFA başka 1.5 yatak hacmi ile asit elüsyon adımı yineleyin. Beade tam çözünmesini önlemek için bu aşamada hızlı çalışınd agaroz matrisi. Protein verim Beer-Lambert denklem ile trpLE-peptid dizisi teorik molar tükenme katsayısına göre bu noktada tespit edilebilir. Trifluoroethanol içinde TFA ile arındırıldı (1:20-01:50) (TFE) bir örnek seyreltilir ve bir boş olarak aynı dilüsyonda, TFA / TFE kullanılarak, 280 nm'de absorbansı ölçülür.
6. CNBR Sindirim
DİKKAT: siyanojen bromür (CNBR) son derece toksik ve sadece onaylı kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. Emniyet gözlüğü, laboratuvar önlüğü ve olmayan lateks eldiven dahil KKD kesinlikle gereklidir. CNBR neme reaktif ve açmadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir. Nötralizasyon / CNBR-kontamine çözümleri ve malzemelerin bertaraf talimatları için kurumsal güvenlik ofisine başvurun.
- Hafifçe karıştırma sırasında damla damla su ilave edilerek% 80 TFA nihai konsantrasyon asit elüsyon seyreltilir. Bir çökelti oluştu, bir varsadd geri temiz TFA küçük bir miktarda (0,5-1 ml) çözeltisi su ile% 80 yeniden doğru, daha sonra açıklık kadar. Sıvı azot içinde dondurulması ve hemen örnek liyofilize edilmesiyle, SDS-PAGE analizi için bir 5 ul ön özet numune alın.
- Kapalı, önceden tartılmış tüpleri güvenle toksik kimyasal tartmak bakımı veya kimyasal davlumbaz içinde bir denge kullanarak, yaklaşık 0.2 g / ml CNBR kristalleri ekleyin. Tamamen eriyene kadar yavaşça karıştırın. Yıkayın ve atıl gaz (argon ya da azot akışı) altında tepkime kabı mühürlemek ve ışıktan koruyarak, oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe edilir.
- SDS-PAGE analizi için 5 ul sonrası özet numune alın ve dondurma ve hemen lyophilize. Beklenen peptid kompleksi boyutu göre, 3.5 kDa ya da daha az bir moleküler ağırlığa sahip bir kesme rejenere selüloz diyaliz kaset ya da boru (selüloz asetat konsantre asit içinde eriyecektir) ile sindirmek reaksiyon aktarın. Su içinde 4 M vermek üzere gece boyunca Dialyzekimyasal davlumbaz TFA konsantrasyonunu azaltmak ve herhangi bir reaksiyona girmemiş CNBR ayrıştırılması. Gecede diyaliz sırasında hacminde önemli bir artış (kadar üç kat iki-gibi) için diyaliz kaset veya tüp boşluk bırakın.
- Diyaliz kaset ya da boru (protein en TFA konsantrasyonu düşük olduğu zaman çökelti olacaktır) asılı bir çökelti ile diyalize edilen çözelti tepkime çıkarın ve 50 ml konik tüpe süspansiyon aktarın. Freeze ve su CNBR / TFA izlerini kaldırmak için lyophilize. Bu adım birkaç gün ihtiyacı doğacaktır.
DİKKAT: diyalizlenmiş özeti reaksiyonu ve diyaliz su Hem toksik ve uygun önlemler ile bertaraf / ele muamelesi devam edilmelidir. - Öncesi indüksiyon ve hasat dönemlerinde, inklüzyon body süpernatant ve pelet, TFA arındırıldı ve CNBR-sindirilmiş malzemeden kültürlerin örnekleri SDS-PAGE ile analiz edilebilir. 95 ile ısıtma ile numuneler hazırlayın Invitrogen NuPAGE LDS sampl ° Ce tampon. TFA arındırıldı ve özet örneklerinin oksidatif crosslinking ürün tanımlama ve değerlendirme kolaylaştırmak için azaltma ve non-düşürücü hem koşullarda hazırlanmalıdır.
- En küçük özet ürünlerin optimum çözümü için MES-SDS tamponu kullanılarak çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde örnekleri ayırın.
7. Disülfür çapraz bağlı peptid komplekslerini arasında Ters-faz HPLC saflaştırma
- Bir preparatif-ölçek üzerine 2-3 ml formik asit ve muntazam yük (21.2 x 150 mm) içine liyofilize özet ürünleri 100 mg a kadar eritilir Agilent Zorbax SB-300, çözücü, C3 PrepHT A sütunu (tipik olarak% 10-20 asetonitril ya da 5 % 0.1 TFA ile su içinde% 10 izopropanol).
- En az 5 kolon hacmi üzerinden çözücü B gradyanı (% 0.1 TFA ile asetonitril veya izopropanol) içinde özet ürünler Zehir. Farklı peptidle optimum eğim koşulları seçimi önerileri için TARTIŞMA bakınız.
- AlmakSDS-PAGE analizi ve dondurma ve hemen lyophilize için her HPLC fraksiyonu 50-100 ul örnekleri. HPLC solvent kaldırılmasını hızlıdır ve 1-2 saat içinde tam olmalıdır.
- Herhangi bir indirgen ajan ile Invitrogen NuPAGE LDS numune tamponu içinde 95 ° C ye ısıtmak suretiyle SDS-PAGE için liyofilize HPLC numuneleri hazırlanır. Soğutulur ve onları ve yeniden ısıtma kısaca birine 100 mM DTT ekleyerek, eşit 2 mikrosantrifüj tüpleri içine her bir numune ayrılır.
- MES-SDS olarak yukarıdaki tampon ile çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde daha az olmayan ve azaltılmış HPLC numuneleri ayırın. Küçük, hidrofobik peptitler genellikle Coomassie sıra leke yapmayız ve beklenen molekül ağırlıklarında çalışmayabilir. Ancak, azaltılmış ve non-azaltılmış örneklerinin karşılaştırılması çapraz peptid ürünleri ve saflık değerlendirilmesi belirlenmesi kolaylaştırmalıdır.
- Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonlaşma time-of-flight (MALDI-TO tarafından aday peptid içeren fraksiyonları analizF) kütle spektrometresi (TARTIŞMA bakınız) faiz türleri belirlemek ve beklenen kitle onaylayın.
- , Kombine saf, çapraz bağlı TM peptid kompleksi ihtiva eden HPLC fraksiyonları dondurmak ve lyophilize ve verimi belirlemek için, son ürünün bir kuru ağırlık al. Yüksek izopropanol içerikli Kesirler dondurulmuş kalmayabilir. Peptit parçaları yerine bir kabarık liyofilize edilmiş ürüne göre daha aşağı kuru film halinde, saf hekzafloroizopropanol (HFIP) küçük bir hacim içinde tamamen filmi yeniden çözülür donma ve tekrar lyophilize. HFIP ile tedavi edilen ürün, kolaylıkla dışarı uçlu ve tartılmış küçük, beyaz bir koni olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TrpLE füzyonları için elde ekspresyon seviyesi, değişken ve ekli peptidin amino asit dizisinin büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 3, önceden indüksiyon SDS-PAGE analizi (hat 1) ve time-of-hasat (kulvar 2) göstermektedir kültürü 1 litre ve 4 ml nikel matris saf, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık 120 mg'lik bir kültür örnekleri. TrpLE-DAP12TM füzyon Tüm olarak süpernatant (yol 3) karşı inklüzyon cisimciği pelet (şeritli 4) lokalize edilmiştir.
Nikel-saflaştırılmış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık% 70 dimerik formda (: TFA ile arındırıldı ve non-azaltılmış ve indirgenmiş örnekleri, Şekil 3, şerit 5 ve 6) ile disülfür çapraz bağlı idi. Bu trpLE-DAP12TM füzyon için tipik bir sonucu, ama çapraz bağlama verim mühendislik sistein yerleştirilmesi ile değişecektir. DAP12TM peptid ürünler toplam CNBR digest örnekleri (şerit 7 ve 8), içinde kolaylıkla tespit değildirancak azaltılmış özeti örnek sağlam füzyon ve trpLE fragmanı bantları (şerit 8) karşılaştırılması füzyon olduğu sindirim ~ 60% tamamlandı olduğunu gösterir.
Şekil 4, bir preparatif skala-C3 kolon (toplam protein bağlama kapasitesi ~ 200 mg) kullanılarak ters fazlı HPLC ile sindirmek ürün ayırma göstermektedir. Füzyon aromatik içeriği düşük olduğu için, bu tipik olarak 214 nm'de yerine, 280 nm'de absorbans izler. Oksitlenmiş, bu çalışma için 90 mg, CNBR-sindirilmiş trpLE-DAP12TM füzyon 3 ml sek formik asit içinde çözüldü ve% 100 çözücü A (% 60 H2O,% 40 asetonitril,% 0.1 TFA) olarak sütuna yüklenir. Bağlı ürün 10 ml / dak 'lık bir akış hızında% 60-90 çözücü B (% 75 izopropanol,% 25 asetonitril,% 0.1 TFA) ve ardından% 0-60 arasında bir iki-aşamalı gradyanı içinde elüt edilmiştir. SDS-PAGE analizi (Şekil 5) göre her kısımdaki ana ürün kodlarını kullanarak assi kromatogram yukarıda belirtilmiştirŞekil 2'de şekilde özel. Farklı peptidle degrade koşulları optimize etmek konusunda daha fazla ayrıntı için TARTIŞMA bölümünde HPLC degrade elüsyon Optimizasyonu bakın.
Peptid ürünler SDS-PAGE (Şekil 5) ve MALDI-TOF (Şekil 6) ana HPLC fraksiyonların analizleri kolayca tanımlanabilir. DAP12TM peptidler ve bizim deneyim, birçok diğer hidrofobik TM peptidler, beklenen molekül ağırlıkları (Burada gösterilen 15 N etiketli türler için 3366 Dalton monomer ve 6730 Dalton dimer) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır göç oranlarıyla çalıştırabilirler. Yüklenen miktar (veriler gösterilmemiştir) çeşitli olarak, bu davranış, doğrudan belli moleküler ağırlıkları bir süreklilik içinde jel ve sonuçlar yüklü peptid miktarına bağlıdır. Bununla birlikte, 100 mM DTT (şerit 7 ve 8 ile karşılaştırın) ile redüksiyon üzerine tepe 5 elektroforetik hareketlilik olarak değişiklik çapraz bağlı peptit olarak tanımlayanürün. MALDI-TOF MS analizi 6729,2 Daltondan az büyük bir tepe noktası ile dimerik peptidin kimliğini doğrular ve herhangi bir başka önemli ürünleri (Şekil 6) açığa çıkarır. Bu hazırlama, saf disülfür çapraz bağlı DAP12TM peptid homodimer Nihai verim kültür litre başına 7.5 mg idi.
Şekil 1. Amino asit çeviri ile trpLE-DAP12TM kodlama bölgenin DNA sekansı. Polipeptid dizisi Key bölgelerinde vurgulanır ve sağa etiketler renk kodlaması. Siyanojen bromür (CNBR) bölünme ve oksidatif çapraz için benzersiz dahili metiyonin (Met) ve sistein (Cys) artıkları, sırasıyla, kırmızı ve mor renkte vurgulanır. HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (kalın ve altı çizili) plazmid ve ma benzersizy ilgi başka bir dizisi olan TM peptid dizisi yerine kullanılabilir.
Şekil 2. Işlem şematik diyagramı. Protokol temel aşamalar metin etiketleri de gösterilmektedir. TrpLE-DAP12TM füzyon Key segmentleri Şekil 1 'deki gibi renk kodludur. Çapraz ve özet adımları Binbaşı polipeptid ürünler AF etiketlenir ve onların tanımı ve beklenen molekül ağırlıkları (15 N-etiketli) ile burada listelenmiştir: [A] trpLE parçası: 13,769 dalton; [B] bozulmadan trpLE-DAP12TM füzyon: 17,118 dalton ; [C] bozulmadan trpLE-DAP12TM füzyon dimer: 34,233 dalton; [D] tek yarılan trpLE-DAP12TM füzyon dimer: 20482 dalton; [E] monomerik DAP12TM peptid: 3366 dalton; [F] dimerik DAP12TM peptid: 6730 dalton. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. TrpLE-DAP12TM ifade, arıtma, çapraz ve özet adımları SDS-PAGE analizi Kültür örnekleri (şeritli 1, pre-indüksiyon, adım 2.5; lane 2, hasat, adım 3.1). Ve inklüzyon cisimciği hazırlık örnekleri (şeritli 3, süpernatant; lane 4, pelet, adım 3.4) 100 mM DTT ile azalmıştır. Ve post-CNBR numune (şerit 7 ve 8, aşama 6.3), nikel kolon (adım 6.1 şerit 5 ve 6), TFA ile arındırıldı (NR) non-azaltılmış çalıştırmak ve 100 mM DTT (R) ile indirgendi gibi onaylamak için belirtilen çapraz bağlı ürünleri disülfür. * Monomerik ve dimerik peptid ürünin E ve F Coomassie boyama ile kötü görselleştirilmiştir ve bu nedenle bu jel üzerinde tespit edilemezler.
Şekil 4. DAP12TM disülfür çapraz bağlı dimer Ters-faz HPLC ile saflaştırma. Bir Agilent Zorbax SB-300, C3 PrepHT üzerine CNBR-sindirilmiş, Okside ve trpLE-DAP12TM füzyon ürünleri liyofilize edildi (90 mg), 3 ml formik asit (% 100) içinde çözüldü ve yüklü (21.2 x 150 mm) kolon çözücü A (% 60 H2O,% 40 asetonitril,% 0.1 TFA). % 60-90 çözücü B (% 75 izopropanol,% 25 asetonitril,% 0.1 TFA) ve ardından% 0-60 arasında bir iki-aşamalı gradyan, 10 ml / ilişkili ürünlerin elüt edilmesi için dak 'lık bir akış hızında çalıştırıldı. Keyfi un: Kesirleri (AU akan olarak toplanan (FT) ve dört büyük zirveleri 214 nm absorbans iz üzerinde işaretlenmiştironun) ve her bir fraksiyonu içinde bulunan başlıca ürün Şekil 2 'de tayin edilen kodları kullanılarak anlatılmıştır. İstenen DAP12TM çapraz bağlanmış bir ürün tepe gölgelenir.
Şekil 5,. Ters-faz HPLC ürünler SDS-PAGE analizi. Flow-through (FT) ve pik 1 örnekleri olmayan azaltılmış işletilmiştir. Tepe 2, 3 ve 4 örnek hem sigara azaltılmış (NR) çalıştırın ve disülfit çapraz ürün kimliğini doğrulamak için 100 mM DTT (R) ile tedavi azalmıştır. Her bir fraksiyonu halinde ana ürün (Şekil 2'de tayin onların kodları ile) [FT, PK1] edildi: A, trpLE parçası; [PK2]: B, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon monomer ve C, tam füzyon dimer; [PK3]: D, tek yarılan trpLE-DAP12TM dimer ve E, monomerik peptid DAP12TM; [PK4]: F, disülfür-çapraz bağlı DAP12TM dimer. Her iki ürün monomerik peptid olsa bile * de (temsilci REULTS bakınız) açıklandığı gibi, hareketlilik olarak konsantrasyona bağımlı bir kayma PK3 (NR ve R) ve PK4 (R)-düşük MW ürünleri yapar farklı moleküler ağırlıkları olarak görünmektedir.
Şekil 6. HPLC saflaştırılmış peptid DAP12TM dimer MALDI-TOF kütle spektroskopisi ile analiz. HPLC fraksiyondan 4 (1 ul) bir numune asetonitril Sinapinik asit (SA) matris doymuş bir çözeltisi ile 1:1 karıştırıldı ve ince bir katman üzerine tespit edilmiştir etanol içinde hazırlanmış bir doymuş çözelti of kurutulmuş SA matris. MALDI: TOF kütle analizi dimer çapraz bağlı beklenen DAP12TM peptid bir ürün ortaya koymaktadır6730 dalton (6729,2098; 15 N-etiketli) yanı sıra 3365,7105 azından küçük bir ürün, büyük olasılıkla çift iyonize türlerin. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C'de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref 15) bir çekirdek katalitik fragmanı ifade bu aralıkta düşük temsil düzeyleri, süre yakından aralığı (yayınlanmamış veri) en yüksek ucunu temsil Burada kullanılan dizi ile ilgili DAP12TM varyantları. IPTG optimum konsantrasyon her bir yeni sekans için deneysel olarak tespit edilmelidir. Standart 0.1 mM ve daha yüksek konsantrasyonlarda (en fazla 1 mM) genellikle her iki alt ifade düzeyleri nedeniyle önemli ölçüde azalır verim ve düşük kültür yoğunluğunun neden olduğut Hasat (referans 7'de örneği Şekil 1A) bakın.
Sunulan protokol üzerinde varyasyonlar. Protokol burada açıklanan bir disülfid çapraz bağlı TM peptid kompleksi, DAP12TM homodimer 8 üretimini açıklar. Alternatif olarak, iletişim kuralı kolayca indirgeyici ajan kaldırmak ve bağlı ürün (4.3 ve 4.4) okside için tasarlanmış iki yıkama adım hariç tutulması ile monomer cinsi peptidleri üretmek üzere uyarlanmıştır. Biz daha önce prosedürün başka bir varyasyonu trimerik DAP12-DAP12-NKG2C TM montajı (referans 8 ve burada açıklanan yöntemler bakın) temsil eden bir kovalent stabilize TM peptid kompleksi üretmek için burada rapor kullandık. Bu uygulamada, bir 1-TM trpLE-DAP12 füzyon ve 2-TM trpLE-DAP12-NKG2C füzyon inklüzyon cisimciği hazırlanması (adım 3,1-3,2) öncesinde kültür hasat aşamada karıştırılmıştır. Prosedürü trpLE çapraz heterodimerik izole fazladan bir HPLC adım dahildirCNBR özet önce asit arındırıldı (adım 5.3) 'dan füzyon ürünü. Peptid ürünleri C3 saflaştırılması bir iplikçik bir in-frame C-terminali füzyonu olarak NKG2C TM etki çalışmak üzere bir disülfid çapraz bağlı DAP12TM dimer iyileşme ile sonuçlanmıştır. Deterjan miselleri bu kompleksin çözümü NMR yapı NKG2C TM etki yerli, anti-paralel yönelim 8 DAP12 monte doğruladı. Bu varyasyon olarak ilave adımlar önemli ölçüde nihai ürün verimi azalır: Tipik bir preparat ikinci bir fazlası ile birlikte bir füzyon 4L gelen peptid "trimer" 8-10 mg elde edilmiştir. Bu değişim iki farklı TM dizileri içeren disülfid stabilize kompleksleri üretmek isteyen araştırmacılar için iyi bir başlangıç protokolü temsil eder.
Nikel afinite saflaştırma ile ilgili notlar. Konsantre asit kullanılarak kurutulmuş nikel sütundan protein elüsyon alışılmadık bir işlemdir ve yeniden mükellef değildirNikel matris kullanımı. Imidazol veya EDTA kullanarak son derece hidrofobik trpLE-TM füzyonlar Zehir girişimleri protein eksik kurtarma sonuçlandı ve çapraz türler tercihen sütun (yayınlanmamış sonuçlar) tutuldu. Nikel matrisi ve gecede toplu bağlama protokol önerilen miktarı dikkatle trpLE-TM protein matrisi doyurabilecek ve böylece kirletici ortak arıtma aza indirmek için optimize edilmiştir. Biz rutin anlamlı Sigma HIS-Select Nikel Affinity Matrix (15-20 mg / ml reçine) ve reklamı bağlama kapasitesi aşan getirileri ile çok saf ürünler kurtarmak. NMR için pahalı kararlı-izotop reaktifleri ile etiketlenir, özellikle asit elüsyon aynı zamanda, daha uzaklıklar nikel matris maliyeti daha CNBR sindirmek içine geçiş için gerekli ara adımlar, ve çapraz bağlanmış ürün verimi artmış ortadan kaldırır.
Siyanojen bromür özet koşulları. SalınmasıReaksiyon hızı ve protein çözünürlüğünün her ikisi de bu koşullar altında son derece elverişli olduğu için CNBR içinde trpLE dan kaynaşık TM peptidler genellikle solvent olarak% 70 formik asit kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, tedavi süreleri serin ve treonin artıkları 16,17 arasında formil esterleşme önlemek için (digest için 1 saat altında) nispeten kısa tutulmalıdır ve muhtemelen triptofan kalıntıları 18, kimin gözlenen kütle türler olarak kütle spektrometresi tarafından saptanabilen değişiklikler I-formilasyon beklenen kütlesine göre +28 (n) dalton olduğunu. Burada açıklandığı gibi, TFA için tercihimiz tamamen bu değişiklikleri önler. % 1, faktör Xa proteaz kullanarak bir trpLE-TM füzyon enzimatik bölünme Triton X-100, 11 rapor edilmiştir, fakat en trpLE-TM füzyonları ve deterjan miseller halinde bölme sitesi erişilememesi komplikasyon zayıf çözünürlüğü muhtemelen genel yarar sınırlamak olmuştur Bu yaklaşım.
Pepti arasında Ters-faz HPLC saflaştırmasınaCNBR özetindeki de ürünlerini bu yordamı en zor adımdır ve her yeni trpLE-TM dizisi için optimizasyon gerektiren olasıdır. Aşağıdaki gözlemler birçok farklı dizileri işleme gelen ve en trpLE-TM füzyonlar için geçerli muhtemeldir:
Sabit faz seçimi Biz Agilent Zorbax Durağan-Bond C3 sütunlar (300 Å gözenek büyüklüğü; 5 mikron partikül boyutu) bulabilirsiniz. Konsantre asit ağır maruziyet altında bir seçicilik açısından üstün durağan faz, çözülmesi güç ve istikrar olması. Yarı preparatif (9.4 mm çap) ve preparatif ölçekli (21.2 mm çap) boyutları mevcuttur ve bizim ellerde çok iyi performans var. C4, difenil ve cyanopropyl sabit fazlar da C3 kıyasla benzer hidrofobisite aralığında kullanışlı alternatif peptid seçicilik sağlayabilir.
Için muntazam bir şekilde liyofilize CNBR özet ürünlerinin HPLC için özet ürünlerin hazırlanması. Çözünmemic asit HPLC ayırma için en iyi sonuçları sağlar. TFA ya da asetonitril, dimetilformamid Trifluoroethanol ve alt çözünürlüğü çoğu zaman sonuç olarak organik çözücüler içinde Preparasyon, birden çok türleri içeren geniş zirveler sütun bağlayıcı ve / veya ürün elüsyon azaltmıştır. Yukarıda anlatıldığı gibi uzun süre maruz peptid sidechains 16-18 arasında formil değişiklik neden olabilir, çünkü bakım kolon yükleme hemen önce formik asit içinde ürünler hazırlamak için özen gösterilmelidir.
HPLC gradyan elüsyonu optimizasyonu. Genellikle% 10-20 asetonitril ya da% 5-10 formik asit içinde eritildi çözücü A. TrpLE-TM füzyonları ve bunların ürünleri gibi özet% 0.1 TFA ile su içinde izopropanol ile başlar olarak C3 sütun bağlayacaktır Burada gösterildiği gibi kadar% 40 asetonitril (Şekil 4). Çok serbest trpLE parçasının (trpLE fragmanı, FT tek protein ürünü olup, böylece bu koşullar altında akabilirkesir: Şekil 5, şeritli 1), ve biz istenen ürünler için sütun genel bağlama kapasitesini artırmak için bu gözlem avantajı almış. Asetonitril ve izopropanol gradyanı solventler gibi çok etkili, ve biz sık sık bu tür% 75 izopropanol gibi bazen garip ama etkili tarifler,% 25 asetonitril, 0,1 sonuçlanan elüsyon profilleri değiştirmek için önceden varolan çözücü çözümler karıştırılarak bizim nihai degrade koşullar varmak % TFA çözelti burada gösterilen DAP12TM arıtma için B çözeltisi olarak kullanılır. Sorunlu derece hidrofobik ürünler% 10 Trifluoroethanol (TFE) ve A ve B iki TFA konsantrasyonunun artmasına (en fazla% 0.3) (yayınlanmamış sonuçlar) kadar eklenerek asetonitril veya izopropanol kullanılarak yıkandı edilmiştir. Diğerleri bir C4 sabit faz 9 ile butanol / asetik asit mobil fazlar kullanılarak iyi sonuçlar bildirilmiştir.
Özet ürünlerin analizi. Önemli analiz tekniği her ikiburada kullanılan, SDS-PAGE ve MALDI-TOF MS, trpLE-TM ürünlerin hidrofobik doğası gereği son derece karmaşık olabilir. CNBR / TFA digest reaksiyonları ve HPLC fraksiyonları Liyofilize analitik numunelerin bazen SDS-poliakrilamid yüksek molekül ağırlıklı agrega olarak çalıştırın. Biz, SDS-PAGE ilaçlar çoğu zaman bu sorun için hazırlanmasından önce HFIP ve yeniden liyofilizasyon küçük bir hacim ile liyofilize edilmiş örneklerinin tedavisinde bulabilirsiniz. TM peptid sekansları da kolaylıkla MALDI-TOF MS analizi sırasında iyonize olmayabilir ve bu nedenle çok zayıf sinyalleri verebilir. Biz, etanol Sinapinik asit (SA), bir doymuş çözelti birinci plaka ve matris tek biçimli bir ince bir tabaka sağlamak üzere kurumuş üzerinde tespit edildiği TM peptid numuneleri hazırlanması için iyileştirilmiş bir işlem kullanılmıştır. Asetonitril içinde SA doymuş bir çözeltisi ile 1:1 karışık peptid-içeren HPLC fraksiyonu bir numune daha sonra kurutulmuş matris tabakasının üzerine tespit edilir. Bizim eller, iki ve altı kat daha fazla sinyal-gürültü arasında bu yöntem verimleri karşılaştırınd peptid tespit için: SA karışımı doğrudan temiz MALDI plaka üzerine.
Mansap uygulamaları. Çözüm NMR ve diğer downstream uygulamalar için lipid veya deterjan sistemlerinin içine TM peptid komplekslerini sulandırılması için yöntemler yaygın olarak değişir ve genellikle dikkatle her yeni sistemi ve uygulama için uygun olmalıdır. Ilgili parametrelerin tam bir tartışması da bu protokolün makalenin kapsamı dışındadır taşımaktadır. Çözüm NMR kullanarak başarılı uygulamaları örnek hazırlama ayrıntıları için, biz konuyu 1,19 ve buradaki referanslar bu yeni yorumlar için okuyucu bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
MEC ve Victoria Hükümeti (Veski Yenilik Fellowship, bu iş için Harçlar Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (WEHI Bağımsız Araştırma Enstitüleri Altyapısını Destekleme Programı [IRIISS] hibe MEC ve MJC için NHMRC proje hibesi 1011352) tarafından sağlanır; WEHI için Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme). MEC Avustralya Araştırma Konseyi Kraliçe Elizabeth II üyesidir. EFXB Melbourne Üniversitesi'nde Norma Hilda Schuster Burs Programı desteğini onaylar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercapt–thanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
References
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
