Summary
Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.
Abstract
Мы демонстрируют использование простого Микрожидкостных установки, в которых один перспективных дрожжевых клеток можно проследить на протяжении всей своей жизни. Микрофлюидный чип использует размер разницы между матерью и дочерью клетки с использованием массива micropads. После загрузки, клетки в ловушке под этими micropads, поскольку расстояние между MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). После процедуры загрузки, культуры среда непрерывно пропускают через чип, который не только создает постоянный и определенной среде на протяжении всего эксперимента, но и вымывает новые дочерние клетки, которые не сохраняются под колодки из-за их меньшего размера. Установка сохраняет материнских клеток настолько эффективно, что в одном эксперименте до 50 отдельных клеток можно контролировать в полностью автоматическом режиме в течение 5 дней или, если необходимо, дольше. Кроме того, отличные оптические свойства микросхемы обеспечивают высокуюРазрешающая способность клеток в течение всего процесса старения.
Introduction
Почкующихся дрожжей является важной моделью для организма старение исследования 1. До недавнего времени изучение репликативного старения в клетках дрожжей не было трудоемкий процесс, требующий вскрытия методом, в котором каждая почка не удалены вручную из материнской клетки 2,3. Чтобы решить эту проблему, мы недавно представили новую установку микрожидкостной возможность отслеживать отдельные клетки матери на протяжении всей своей жизни 4.
В нашем микрофлюидный чип, дрожжевые клетки оказались в ловушке под мягкие на основе эластомеров micropads (см. Рисунок 1). Непрерывный поток среднего смывает новообразованных дочерних клеток и обеспечивает клетки со свежими питательные вещества. В одном эксперименте, до 50 материнские клетки можно наблюдать в полностью автоматическом режиме на протяжении всего их репликативной продолжительности жизни. В связи с превосходными оптическими свойствами микрофлюидного чипа, можно одновременно контролировать различные аспекты биологии клетки дрожжей (например,
По сравнению с классическим методом вскрытия, микрожидкостной установки обеспечивает существенные преимущества. Это обеспечивает определенную и постоянную среду в течение всего эксперимента старения. Она не требует дорогого специализированного оборудования и может быть запущен на любой микроскоп оснащен автоматизированной фокус и покадровой способностей, а также контроля температуры для выращивания клеток. Производства и эксплуатации микрожидкостных чипов можно узнать в течение нескольких дней. Кроме того, клетки могут быть непосредственно загружены с экспоненциально растущей культуры, преимущество над другими недавно опубликованных Микрожидкостных методу 5, который требует биотинилирования материнских клеток. В сочетании с высоким разрешением, описанные здесь способ может быть использован для измерения постепенных изменений в клеточной морфологии, экспрессии белка и локализация во время старения дрожжей беспрецедентным образом. Способность кдолгосрочный мониторинг отдельных клеток также предоставляет уникальные возможности для исследования дрожжей клеточного цикла.
Этот метод в последнее время были оптимизированы, чтобы удалить биотинилированием из протокола 16, который был опубликован в то время как эта рукопись была в обзоре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Производства и изготовления пресс-формы кремниевых пластин
Микрофлюидных чипы создаются из формы кремниевой пластины производства мягкой литографии. Эти пластины могут быть использованы многократно производить микрожидкостных чипов. Желательно, чтобы производство соответствующих пластин осуществляется группа, специализирующаяся на микрофлюидики 6.
Пластина выполнена в двухступенчатом процессе фотолитографии с использованием двух различных слоев негативного фоторезиста SU-8 7. Нижний слой используется для генерации области ячейки захвата (SU-8 2002; высота 3-4 мкм), тогда как каналы выполнены с верхним слоем (SU-8 2010, высота 10 мкм). Впечатление от процесса производства пластин можно найти в Хуанг и др. 8. Чертежи микрожидкостных чипов может быть получена из авторов, а также советы о том, как получить соответствующие пластины.
- Как только пластина получается, вырезать один кусок Tough-тегов десятичногоо тонкие полоски около 0,5 мм 3 мм скальпелем и поместить их тщательно на пластине немного сверху на структуру канала между входным каналам и MicroPad массив (рис. 2А). Это приведет к образованию большого дополнительного канала в каждый чип, который не будет использован только во время нагрузки сотовой ячейки, но также важно для стабильной работы микрофлюидного устройства.
- Обложка блюдо Петри стекло с двойным слоем из алюминиевой фольги и поставить пластину в чашке Петри. Алюминиевой фольги предотвратит PDMS от бега между пластины и чашки Петри. Если PDMS делает ползают между пластин и стеклянном блюде Петри, пластина станет постоянно закреплен в чашке Петри. Хотя пластины по-прежнему полезной, это не будет возможно заменить стеклянную чашку Петри в случае его поломки и PDMS должны быть вырезаны впоследствии.
2. Производство микрожидкостных чипов
- Поставьте пустую пластиковуючашку на баланс и тарирования. Залить 40 г PDMS базы в пластиковый стаканчик (на 12 см в диаметре стеклянном блюде Петри). Добавить PDMS отвердителя с пипеткой в AW / W соотношении 1:10, т.е. около 4 мл.
- Смешайте PDMS и отвердитель тщательно в течение нескольких минут. Это может быть сделано с одноразовой пластиковой пипетки, которая использовалась для пипетки отверждающего агента. Важно, чтобы смесь хорошо перемешивают до заливки его в верхней части пластины. Плохое смешивание может привести части PDMS не для полимеризации.
- Налейте PDMS на верхней части пластины в стеклянную чашку Петри.
- Смешивание PDMS с отвердителя приведет к образованию пузырьков воздуха в смеси PDMS. Эти пузырьки должны быть удалены перед PDMS полимеризуется. PDMS можно дегазировать после заливки его в верхней части пластины, поместив чашку Петри в эксикаторе соединен с вакуумным насосом. С помощью этой установки, она занимает около 30 минут, чтобы удалить все пузырьки из смеси.
- Полимеризуйте йэлектронной PDMS путем размещения чашки Петри с пластины в верхней части горячей плите при 120 ° С в течение 1 ч и затем при 65 ° С в течение еще одного часа.
- Удалите алюминиевую фольгу вместе с пластины и полимерные PDMS от стеклянном блюде Петри. Снимают с алюминиевой фольгой и тонкий остаточный слой полимеризованного PDMS от задней пластины. Слоем PDMS на верхней части пластины могут быть отделены от подложки, подняв ее тщательно.
- Поместите слой PDMS с ног на голову (с каналами вверх) на скамейке и вырезать одну конструкции чипа запечатленный на PDMS тщательно с помощью скальпеля. Попытка сохранить около 3 мм PDMS вокруг краев каналов для улучшения крепления кристалла к покровным стеклом позже.
- Удар отверстия в PDMS на концах вход, выход и боковой канал (Фиг.2А), нажимая на 20 калибра Luer заглушки все путем PDMS в прямой форме.
Убедитесь, что чип PDMSдо сих пор лежит вверх ногами на скамейке в то время как пробивая отверстия. Это предотвращает PDMS от прилипания к внутренней поверхности канала, что может привести к закупорке канала.
- После штамповки каждое отверстие, снимите колонку PDMS в Luer заглушки с помощью пинцета перед тем как вынуть заглушку снова. Колонка PDMS могли бы остаться и блокировать точно пробил дыру.
- Очистить поверхности кристалла от частиц пыли и остаточной PDMS путем размещения скотча на нем и немедленно удаления ленты снова. Аналогичным образом очистить покровного стекла, к которому чип будет прикреплен.
- Положите очищенный чипа и покровного стекла под УФ лампой UV-Настольная Озон чище. Сторон, которые должны быть соединены друг с другом должны быть готовы к лампе.
- Проэкспонируйте PDMS и покрывают стеклом с ультрафиолетовым светом в течение 6-8 мин и непосредственно после этого положить чип на покровное стекло путем размещения открытых поверхностей друг на друга.
- Аккуратно нажмите вокруг сторон чипасодействовать крепления PDMS с покровным стеклом и для удаления пузырьков воздуха. Не нажимайте на верхнюю границу канала структуры как это может привести к micropads привязываться к покровного стекла, а также.
- Поместите новоиспеченных микрожидкостной установки на горячей плите при температуре 100 ° С в течение 60 мин. Испытание прочности сцепления между стеклом и PDMS чип, пытаясь поднять краев чип PDMS незначительно. Когда блок PDMS не может быть поднят с поверхности стекла, связующий успешна и чип готов к использованию.
3. Подготовка чип для сотовых загрузка
Отказ микрофлюидном устройство может потенциально привести к утечке среды в микроскопе. Чтобы избежать этого, это консультативный использовать держатель металла и / или уплотнение стороны чипа, где PDMS отвечает стекло с лаком для ногтей или эпоксидный клей. Это предотвращает утечку среды в случае чипа PDMS не связана достаточно хорошо, чтобы покровного стекла. Кроме того, трубкасоединения могут быть закреплены вокруг точки вставки таким же образом, чтобы избежать утечки среды. Самодельные воды датчик, который отключает шприцевой насос в случае утечки может быть использован в качестве дополнительной меры предосторожности безопасности. Чертежи металлический держатель специально разработан для микрофлюидного чипа можно получить у авторов.
- Поместите микрофлюидный чип в металлический держатель, с силиконовым гелем между стеклом микросхемы и металлические части корпусов, создавая водонепроницаемую печать. Винт орехи осторожно, чтобы не разбить стекло.
- Соединение тонких трубок (около 5-15 см в длину) с каналом стороне и выпускной канал микросхемы. Использование пинцета легче вставить трубки в перфорированных отверстий.
- Наполните 50 мл Luer-Lok шприц с культуральной средой, удалить воздух из шприца и подключить его последовательно шприцевой фильтр 20 калибра Luer заглушки, короткая толстая трубка (около 2 см) и тонкую трубку. Убедитесь в том, что тонкий ваннойе достаточно долго, чтобы охватить расстояние между насосом шприц и столик микроскопа.
- Поместите шприц в шприцевой насос, быстрая перемотка вперед насос, пока тонкая трубка полностью заполнен средой.
- Нажмите на тонкую трубку, соединенную со шприцем во впускной канал чип и пусть потока среды через чип при 10 мкл / мин (фиг. 2В). Сбор среды оставляя микросхемы (например, в чашке Петри). Средне будет работать через боковые канала из-за сопротивления разница между Tough-тегов сделал большой канал стороны и выпускных каналов.
- Поместите чип столик микроскопа и установить фокус микроскопа на площадках.
Использование целей иммерсионным предпочтительнее, чем, что цели погружения в воду, потому что нефть не будет высыхать за время-ходом эксперимента.
В зависимости от микроскопа возможны проблемы с сохранением Fсфокусироваться вначале в течение первых часов эксперимента. Поэтому целесообразно оставить чип для 1:59 часов в столике микроскопа, чтобы он мог успокоиться перед загрузкой клетки и началом эксперимента.
4. Загрузка дрожжевых клеток в микрофлюидный чип
- Подключите 5 мл Luer наконечник шприца 20 калибра Luer заглушки и толстая трубка (около 3 см).
- Возьмите образец культуры клеток должны быть загружены в чипе.
Предпочтительным клеток для погрузки составляет от 1-5 х 10 6 клеток на мл. Культуры с более высокими отсчетами клетки должны быть разбавлены перед загрузкой. При культивировании клеток на YPD, эффективность нагрузки сотовой ячейки могут быть улучшены во много раз, если клетки сначала промывали и ресуспендировали в минимальной среде, содержащей такой же процент глюкозы перед загрузкой. Во время работы чипа, YPD среде может снова быть безопасно использованы.
- Загрузка примерно 1 мл клеточной суспензии в йШприц е и удалить весь воздух из шприца.
- Снижение скорости потока шприцевой насос до 0,5 мкл / мин. Низкий и непрерывный поток в жизнь шприцевой насос во время загрузки (на этапе 4.5) будет толкать непривязанными клетки через боковые канал (фиг.2С).
- Соединение шприц, содержащий суспензию клеток к трубке выпускного канала. Загрузите клетки нажатием на поршень шприца аккуратно. Соблюдайте клетки, входящие и урегулирования под micropads через глазные или через экран компьютера.
- Поддерживайте давление на поршень, пока клетки не достаточное поселиться под колодки. Оптимальная нагрузка составляет 1-3 клеток на площадку. Как решить клеток под колодки случайно, это довольно часто, что несколько колодки не содержат клетки и другие колодки полностью заполнены клетками.
- Отсоедините шприц, используемые для загрузки клеток и толстые трубки подключены к нему из тонких труб из выпускного канала, промойте стороне СНAnnel в течение нескольких минут при более высокие скорости потока (10 мкл / мин), чтобы удалить пузырьки воздуха и / или клеток, которые еще не выход чипа (фиг. 2В). Если клетки не удаляются из бокового канала, они могут начать расти в боковой канал и вмешиваться в эксперименте позже.
- Поместите потока шприцевой насос обратно до 0,5 мкл / мин и закрытия боковой канал с подключением к толстой трубки (около 5 см), содержащей катетер штекер на конце (фиг. 2D).
- Увеличение потока до конечной скорости потока 1-5 мкл / мин. Расход может изменяться в зависимости от среды и штамма дрожжей.
- Начало фильма с микроскопом и параметров камеры пригодны для целей эксперимента. Убедитесь, что скорость столик микроскопа установлен на такой низкой скоростью, что масло может следовать. Для определения репликативной продолжительности жизни, изображение клетки каждые 10 мин. Чтобы защитить клетки от незначительных количеств УФ-света, излучаемого галогеннойлампа, которая используется во время DIC приобретение, целесообразно поместить дополнительный ультрафиолетовый фильтр на пути прохождения света. Когда с помощью флуоресцентной микроскопии, предпочтительно, чтобы изображение клетки реже (например, каждые 20 минут), чтобы избежать фототоксические эффекты. Эксперимент заканчивается, когда все клетки, нагруженные в начале эксперимента мертвы, который при нормальных условиях занимает до 5 дней. Рекомендуется регулярно проверять фокусировку изображения во время эксперимента и при необходимости отрегулируйте его.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе, клетки загружаются в микрофлюидный чип непосредственно из середины экспоненциальной культуры. Чтобы выяснить, является ли возрастное распределение клеток в ловушке микрофлюидный чип похож на культуры перед погрузкой, клетки окрашивали пшеницу агглютинина конъюгированных с FITC (WGA-FITC) для визуализации бутон шрамы. Как можно видеть на фигуре 3, захват клеток при micropads из микрофлюидного чипа не смещен к клеткам определенного возраста.
Репликативного продолжительность жизни может быть просто определяется путем подсчета количества бутонов, которые производятся одной клетки матери. Эта информация преобразуется в кривую продолжительности жизни, откладывая процент жизнеспособных клеток по отношению к числу бутонов производства. Статистические анализы, такие как те, которые выполняются на Kaeberlein и соавт. 9, может быть использована для сравнения продолжительности жизни данных из различных экспериментов. 4 показан пример жизни кривыхполучены для WT BY4741 штамм дрожжей и два мутанта (SIR2 Δ, Δ fob1).
Фильм 1 время съемки видео одной WT BY4741 дрожжевых клеток, растущих на YPD среды. Изображения отбирали каждые 10 мин. Клетка производит в общей сложности 30 бутонов прежде чем он умрет. Шкала бар, 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Важным преимуществом Микрожидкостных способа заключается в возможности использовать непрерывный изображений с высоким разрешением. Для мониторинга изменений в морфологии митохондрий клетки, как возраст, старение эксперимент проводили с BY4742 дрожжевых клеток выражения ILV3-GFP, которая ориентирована в митохондрии. Рисунок 4 дает обзор морфологии митохондрий за тот же набор ячеек в разных возрастах репликативное ( 0 почки, 10 бутонов и до смерти). Морфологии изменения заметны и в среднего возраста клетки напоминают о которых сообщалось влитературу до 10. Хотя в этом конкретном эксперименте представитель, скорость потока среды не был оптимальным и дочерние клетки были сохранены с относительно высокой частотой, в отличие от фильма 1, качество эксперимент был еще достаточным для анализа морфологии митохондрий в 49 отдельных клеток по их всего срока службы.
Фильм 2 Время съемки видео одной BY4742 дрожжевых клеток выражения ILV3-GFP, который используется для визуализации митохондрий. Изображения отбирали каждые 30 мин. Оба светлого, а также изображения были GFP фоне исправлены до объединения двух каналов в единое изображение с помощью ImageJ. Шкала бар, 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Фигарисунке 1. Схематический обзор Микрожидкостных установки. Разница высот между PDMS MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). Загрузка: дрожжевые клетки загружены под micropads PDMS. Культивирование: Свежая среда протекает непрерывно в течение захваченных клеток (синяя стрелка). Вскрытие: новые дочерние клетки смываются потоком среды (оранжевая стрелка).
Рисунок 2. Схематическое изображение конструкции канала микрофлюидного чипа.. Черные кружки указывают расположение отверстиями в конце канала, вход, выход и боковые. B. Втекает через впускной канал (10 мкл / мин) и выходит через большую сторону канала (оранжевая стрелка). Там нет потока через выпускной канал, из-за сопротивления разница между тон стороной и выходе канала. C. Клетки загружен в чип (черная стрелка) через выпускной канал. Поток через боковой канал уменьшается до 0,5 мкл / мин D:. После промывки стороне канала, боковой канал заблокирован и среднего начинает течь по ячейкам ловушку под micropads (1-5 мкл / мин).
Рисунок 3. Нагрузки сотовой ячейки на чип не смещена в сторону определенного возраста клетки. Середины экспоненциальной YSBN6 WT культуры (10 7 клеток / мл) метил WGA-FITC (2 мкл 5 мг / мл маточного раствора на 10 6 клеток) в течение 1,5 часа. Клетки затем положить на предметное стекло или загруженных в микрофлюидный чип. Z стеки были сделаны (15 г-срезов на расстоянии 0,8 мкм) при длине волны возбуждения 470 нм с использованием 63X увеличении погружения в воду цели. Количество бутон шрамы на каждомклетки подсчитывали вручную. Bud шрамы были определены по 75 клеток в культуре и 79 клеток в микрофлюидный чип.
Рисунок 4. Примеры кривых жизни, полученные для BY4741 БТ (N = 76), SIR2 Δ (N = 63) и fob1 Δ (N = 58) с использованием описанных здесь микрожидкостных устройств. Оба удалений иметь сильный, но наоборот, влияние на измеренные Средний репликативной продолжительности жизни клеток дрожжей. В каждом эксперименте штаммы выращивали в течение ночи в YPD средней стационарной фазы и затем оставляют для возобновления экспоненциальный рост разбавление в свежей средой YPD и инкубации при 30 ° С в течение 3 ч перед началом эксперимента. Данные были получены от Lee и соавт. 4.
Рисунок 5. Митохондриальной морфологии в зависимости от возраста:. Типичный пример связанных с возрастом изменений в морфологии митохондрий в одной ячейке (белые стрелки). Все изображения масштабируются одинаково. Шкала бар, 5 мкм B:. Митохондриальной морфологии наблюдается в наборе из 49 клеток, прежде чем производить свои первые почки (0), после 10 почки (10) и до смерти (†). Например изображение каждого морфологии класс включен. Представленные данные были получены в ходе одного эксперимента и тот же набор клеток использовали для озвучивания морфологии в каждый момент времени. Митохондрии были визуализированы в BY4742 штамм, экспрессирующий GFP-меченый вариант митохондриальных белков ILV3 (полученной из базы данных GFP сбор 15). Оба светлого, а также изображения были GFP фоне исправлены до объединения двух каналов в единое изображение с помощью ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микрожидкостных метод, описанный здесь является важным инструментом романа в исследовании старения, поскольку позволяет простой и автоматизированной генерации дрожжей репликативное данные продолжительности жизни в сочетании с непрерывным высоким разрешением. Эти атрибуты являются значительные достижения на протяжении экспериментальные возможности классического метода вскрытия, но есть несколько ограничений метода, которые должны быть приняты во внимание.
Обратите внимание, что продолжительность жизни определяется репликативное может зависеть от эффективности сохранение материнских клеток: каждая клетка находится под MicroPad имеет определенную вероятность, которая будет вымываться из микросхемы (например, начинающим ячейку соседней ячейке может подтолкнуть его подальше от MicroPad). Интегрированный вероятность клетки вымываются возрастает с увеличением продолжительности жизни. Таким образом, более вероятно, что недолго клетки завершили свой жизненный цикл, прежде чем смыть, чем долгоживущие клетки. Тот факт, что аналогичный ли fespan данных была создана с микрожидкостной установки 4, как с классическим методом микродиссекции 11-13 показывает, что эта потенциальная проблема является лишь незначительные, если не имеет значения.
Важно отметить, что при установке Микрожидкостных это не возможно, чтобы выбрать клетки девственной дочери в начале эксперимента, в отличие от классического метода вскрытия. Тем не менее при загрузке клетки от экспоненциально растущей жидкой культуры в чип, большинство из загруженного клеток новорожденной или относительно молодой (т.е. около 54% клеток никогда не расцветший до и около 27% раз) 14. Это означает, что продолжительность жизни занижены 1 до 2 поколения по большей мере. В исключительном случае, что возрастная структура популяции клеток значительно изменены, можно обогатить популяции клеток для дочери девицы перед загрузкой, например, путем центрифугирования в градиенте или Отмучиванием.
ntent "> микрофлюидного чипа в принципе, может быть использован для изучения гаплоидных штаммов дрожжей в различных культуральных сред. Однако различные штаммы дрожжей и / или носитель может потребовать некоторой оптимизации скорости потока, чтобы обеспечить эффективное удержание материнских клеток. Как клетки сохраняются основан от их размера, это не возможно, чтобы загрузить дрожжевых штаммов, которые значительно больше или меньше 3-4 мкм в диаметре, такие как диплоидных клетках дрожжей. Однако, производя пластины с различными фоторезистов, микрожидкостных чипов могут быть получены с различным расстоянием между стеклянной крышкой и micropads, позволяющее загружать из этих разных размеров клеток.Хотя протокол, представленные здесь описано, как сделать чип с одним каналом, можно добавить несколько каналов в одном чипе и параллельно экспериментах одновременно. В зависимости от количества нужных каналов в одном чипе, это может быть необходимо для создания адаптированного пластины, в которой каналы разнесеныболее тесное сотрудничество.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Лору Schippers для написания первой версии протокола нагрузки сотовой ячейки и Маркус де Goffau и Guille Zampar тестов митохондриальной морфологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
