Summary
אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.
Abstract
אנו מדגימים את השימוש בהתקנת microfluidic פשוט, שבו ניתן לעקוב אחר תאי שמרי ניצנים בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם. שבב microfluidic מנצל את ההבדל בגודל בין תאים אם ובתה באמצעות מערך של micropads. לאחר הטעינה, תאים לכודים מתחת micropads אלה, משום שהמרחק בין micropad ומכסה הזכוכית דומה לקוטר של תא שמרים (מיקרומטר 3-4). לאחר הליך הטעינה, תרבות בינונית הוא הסמיק ברציפות באמצעות השבב, שיוצר סביבה קבועה ומוגדרת לא רק לאורך כל הניסוי, אלא גם את החום מתפתחים התאים בת, שאינם נשמרים מתחת לרפידות עקב הגודל הקטן שלהם. ההתקנה שומרת תאי אמא כל כך יעילה, כי בניסוי אחד יכולים להיות במעקב עד 50 תאים בודדים באופן אוטומטי לחלוטין למשך 5 ימים או, במידת צורך, זמן רב יותר. בנוסף, את התכונות האופטיות מעולות של השבב תאפשר גבוהותרזולוציה הדמיה של תאים במהלך תהליך ההזדקנות כולו.
Introduction
ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הזדקנות 1. עד לאחרונה לומד replicative הזדקנות בתאי שמרים היה תהליך מייגע הדורש נתיחת שיטה, שבה כל ניצן הוסר באופן ידני מהתא האם 2,3. כדי לפתור בעיה זו, אנו הצגנו לאחרונה התקנת microfluidic רומן מסוגלת לעקוב אחר תאי אמא בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם 4.
בשבב microfluidic שלנו, תאי שמרים לכודים תחת micropads מבוסס אלסטומר הרך (ראה איור 1). זרימה רציפה של מדיום שוטפת חדש שנוצרו תאי בת ומספקת את התאים עם חומרים מזינים טריים. בניסוי אחד, יכולים להיות במעקב עד 50 תאים האם באופן אוטומטי לחלוטין לאורך כל replicative תוחלת החיים שלהם. בשל תכונות האופטיות מעולות של שבב microfluidic, ניתן לפקח בו זמנית היבטים שונים של ביולוגיה של תא שמרים (למשל
בהשוואה לשיטה הקלסית לנתיחה, התקנת microfluidic מספקת יתרונות משמעותיים. זה מבטיח סביבה מוגדרת וקבועה במשך כל ניסוי ההזדקנות. זה לא דורש ציוד מיוחד ויקר ניתן להריץ על כל מיקרוסקופ מצויד בפוקוס אוטומטי ויכולות זמן לשגות כמו גם טמפרטורת בקרה לגידול תאים. הייצור והתפעול של שבבי microfluidic ניתן ללמוד תוך כמה ימים. בנוסף לכך, תאים ניתן לטעון ישירות מתרבות גדלה באופן אקספוננציאלי, יתרון על פני שיטה אחרת שפורסמה לאחרונה microfluidic 5, אשר דורשת biotinylation של תאים האם. בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, בשיטה שתוארה כאן יכולה לשמש למדידת שינויים הדרגתיים במורפולוגיה תאית, ביטוי חלבון ולוקליזציה בשמרי ההזדקנות באופן חסר תקדים. היכולת לניטור ארוך טווח של תאים בודדים גם מספק אפשרויות ייחודיות ללימודי מחזור תא שמרים.
שיטה זו מזמן כבר מותאמת להסיר biotinylation מ16 הפרוטוקול, שפורסם בעת כתב היד הזה היה בביקורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור והכנה של עובש פרוסות סיליקון
שבבי microfluidic נוצרים מתבנית פרוסות סיליקון המיוצרת על ידי יתוגרפיה הרכה. ניתן לעשות שימוש חוזר ופלים אלה פעמים רבות כדי לייצר שבבי microfluidic. מומלץ כי ייצור של פרוסות סיליקון בהתאמה מבוצע על ידי קבוצה מתמחה ב6 מיקרופלואידיקה.
רקיק הוא עשה בתהליך photolithography שני שלבי שימוש בשתי שכבות שונות של photoresist השלילי, SU-8 7. השכבה התחתונה משמשת ליצירת אזור השמנת התא (SU-8 2002; מיקרומטר 3-4 גובה), ואילו הערוצים נעשים עם השכבה העליונה (SU-8 2010; גובה 10 מיקרומטר). ניתן למצוא רושם של תהליך ייצור פרוסות סיליקון בואנג ואח' 8. ניתן לקבל מהמחברים, כמו גם ייעוץ הציורים של שבבי microfluidic כיצד להשיג רקיק, בהתאמה.
- ברגע שמתקבלות פרוסות, לחתוך חתיכת int קשוח תג אחדרצועות דקות o של כ 0.5 מ"מ על 3 מ"מ עם אזמל ולמקם אותם בזהירות על פרוסות סיליקון במקצת על גבי מבנה הערוץ בין ערוצי הכניסה ומערך micropad (איור 2 א). זה יגרום להיווצרות של ערוץ נוסף גדול בכל שבב, אשר לא רק לשמש במהלך טעינת תא, אך חשוב גם לפעולה היציבה של מכשיר microfluidic.
- מכסה את צלחת פטרי הזכוכית עם שכבה כפולה של נייר אלומיניום והכניס את פרוסות בצלחת פטרי. רדיד האלומיניום ימנע מלפעול בPDMS בין רקיק וצלחת פטרי. אם PDMS עושה לזחול בין רקיק וצלחת פטרי הזכוכית, רקיק יהפוך באופן קבוע בצלחת פטרי. למרות שהרקיק הוא עדיין אפשרי, זה לא יהיה אפשרי להחליף את צלחת פטרי זכוכית אם זה שובר את PDMS ויהיה צורך לגזור לאחר מכן.
2. ייצור של שבבי microfluidic
- הנח פלסטיק ריקכוס על האיזון וטרת האיזון. יוצקים 40 גרם PDMS בסיס לכוס הפלסטיק (לצלחת זכוכית בקוטר 12 ס"מ פטרי). הוסף סוכן ריפוי PDMS עם טפטפת פנויה ביחס AW / W של 1:10, כלומר כ 4 מ"ל.
- מערבבים את PDMS וסוכן ריפוי ביסודיות במשך מספר דקות. ניתן לעשות זאת עם פיפטה הפלסטיק חד פעמית ששימש לפיפטה סוכן הריפוי. חשוב שהתערובת מעורבבת היטב לפני ששופך אותו על גבי פרוסות סיליקון. עניי ערבוב יגרום לחלק מPDMS לא לפלמר.
- יוצקים את PDMS על גבי פרוסות סיליקון בצלחת פטרי הזכוכית.
- הערבוב של PDMS עם סוכן הריפוי יוביל להיווצרות בועה בתערובת PDMS. בועות אלה צריכים להסיר לפני PDMS polymerizes. ניתן degassed PDMS לאחר מזיגתו על גבי פרוסות סיליקון ידי הצבת צלחת פטרי בייבוש מחובר למשאבת ואקום. עם ההגדרה הזאת, זה לוקח בערך 30 דקות כדי להסיר את כל הבועות מהתערובת.
- פלמר ההדואר PDMS על ידי הצבת צלחת פטרי עם רקיק על גבי צלחת חמה ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה נוספת.
- הסר את נייר האלומיניום יחד עם רקיק וpolymerized PDMS מצלחת פטרי הזכוכית. לקלף את נייר האלומיניום והשכבה דקה של שיורי polymerized PDMS מהחלק האחורי של פרוסות סיליקון. השכבה של PDMS על גבי פרוסות סיליקון אז יכולה להיות מופרדת מהרקיק על ידי הרמתו בזהירות.
- הנח את שכבת PDMS הפוך (עם הערוצים פונים כלפי מעלה) על הספסל ולחתוך את עיצובי שבב בודדים מוטבע על PDMS בזהירות עם אזמל. נסה לשמור על 3 מ"מ של PDMS מסביב לקצוות של הערוצים כדי לשפר את הקובץ המצורף של השבב למכסה הזכוכית בהמשך.
- חורי אגרוף בPDMS בקצות ערוץ כניסה, יציאה וצד (איור 2 א) על ידי דחיפת בדל Luer 20 מד לאורך כל הדרך PDMS בצורה ישרה.
ודא שבב PDMSהוא עדיין שוכב במהופך על הספסל בזמן ניקוב החורים. זה מונע PDMS מלהידבק לחלק הפנימי של הערוץ, אשר יכולים לגרום לחסימה של הערוץ.
- לאחר חבטות כל חור, להסיר את העמודה של PDMS בבדל Luer עם פינצטה לפני שמשכתי את הבדל החוצה שוב. טור PDMS אחרת יכל להישאר מאחור ולחסום את החור רק אגרוף.
- נקה את המשטחים של השבב מחלקיקי אבק וPDMS השיורי על ידי הנחת נייר דבק עליו והסרת הסרט מייד שוב. כמו כן לנקות את מכסה זכוכית שלשבב יהיה מחובר.
- הנח את השבב ניקה ומכסה הזכוכית מתחת למנורת UV של מנקה-UV אוזון Benchtop. הצדדים שצריכים להיות קשורים יחד חייבים להתמודד עם המנורה.
- לחשוף את PDMS ולכסות את הכוס לאור UV במשך 6-8 דקות ולאחר מכן באופן ישיר את השבב על מכסה הזכוכית על ידי הצבת את המשטחים החשופים על גב אחד את השני.
- לטפוח בעדינות סביב הצדדים של השבבכדי לקדם את צירופה של PDMS למכסה הזכוכית וכדי להסיר כל בועות אוויר. אין להקיש על גבי מבנה ערוץ מכיוון שהדבר עלול לגרום לmicropads להיקשר למכסה הזכוכית גם כן.
- הנח את התקנת microfluidic עשה זה עתה על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בדוק את חוזקו של המליטה בין מכסה הזכוכית ושבב PDMS על ידי מנסה להרים את הקצוות של שבב PDMS מעט. כאשר בלוק PDMS לא ניתן להרים ממשטח הזכוכית, המליטה היא מוצלחת והשבב הוא מוכן לשימוש.
3. הכנת צ'יפ לטעינה סלולרי
כישלון של מכשיר microfluidic עלול לגרום לדליפה של מדיום למיקרוסקופ. כדי להימנע מכך, הוא מייעץ לשימוש מחזיק מתכת ו / או לאטום את הצדדים של השבב שבו פוגש את PDMS הזכוכית עם לק או דבק אפוקסי. זה מונע זליגה של מדיום במקרה שבב PDMS הוא לא ערובה מספיק טוב כדי לכסות את הכוס. גם צינורותיכולים להיות מאובטחים חיבורים סביב הנקודות הכניסה באופן דומה, כדי למנוע זליגה של מדיום. חיישן מים תוצרת בית שמכבה את משאבת המזרק במקרה של דליפה יכול לשמש כאמצעי בטיחות נוסף. ניתן להשיג ציורים של בעל המתכת תוכנן במיוחד עבור שבב microfluidic מהמחברים.
- הנח את שבב microfluidic בבעל המתכת, עם ג'ל סיליקון בין הזכוכית של השבב ואת חלקי המתכת של בעל ליצור חותם אטום למים. הברג את האגוזים בעדינות, לא לשבור את הזכוכית.
- חבר צינורות דקים (ארוך 5-15 ס"מ בקירוב) לצד הערוץ וערוץ היציאה של השבב. השימוש בפינצטה עושה את זה קל יותר להכניס את צינורות לחורים המנוקבים.
- ממלאי מזרק 50 מ"ל Luer-לוק עם התרבות בינונית, להסיר את האוויר מהמזרק ולחבר אותו ברצף למסנן מזרק, בדל Luer 20 מד, צינור עבה וקצר (באורך של 2 ס"מ בקירוב) וצינור דק. ודא שאמבטיה דקהדואר הוא ארוך מספיק כדי להקיף את המרחק בין משאבת המזרק והבמה מיקרוסקופ.
- הנח את המזרק במשאבת המזרק, להריץ קדימה את המשאבה עד שהצינור הדק מלאה לחלוטין עם מדיום.
- דחוף את הצינור הדק המחובר למזרק לתוך ערוץ הכניסה של השבב ולאפשר את הזרימה בינונית באמצעות השבב ב10 μl / דקה (איור 2). לאסוף את המדיום משאיר את השבב (למשל בצלחת פטרי). בינונית ייגמר דרך ערוץ הצד בגלל הבדל ההתנגדות בין התג קשוח מתוצרת צד ערוץ גדול וערוץ לשקע.
- הנח את השבב בבמת מיקרוסקופ ולהגדיר את המיקוד של המיקרוסקופ על הכריות.
השימוש במטרות נפט טבילה עדיפה על זה של מטרות טבילה במים, כי שמן לא יתייבש במשך הזמן במהלך הניסוי.
בהתאם למיקרוסקופ שאולי יש בעיות עם שמירה על Focus בשעות הראשונות של הניסוי. לכן מומלץ להשאיר את השבב לשעה עד שעות בבמת מיקרוסקופ ולכן הוא יכול להתיישב לפני טעינת תאים ותחילת הניסוי.
4. טעינה של תאי שמרים לתוך השבב microfluidic
- חבר קצה מזרק 5 מ"ל לLuer בדל Luer 20 מד וצינור עבה (3 ס"מ בקירוב).
- קח את דוגמה של תרבית התאים להיות טעונים לתוך השבב.
ספירת התאים המועדפת לטעינה היא בין 1-5 x 10 6 תאים לכל מ"ל. תרבויות עם ספירת תאים גבוהה יותר צריכים להיות מדוללת לפני הטעינה. כאשר תאי culturing על YPD, יעילות העמסת תא יכול להיות שיפור רבים של פי אם תאים נשטפים ראשון עם וresuspended במדיום מינימאלי המכיל אחוז סוכר דומה לפני הטעינה. במהלך פעולה של השבב, שוב ניתן להשתמש בינונית YPD בבטחה.
- טען כ 1 מ"ל של ההשעיה התא לתוך המזרק הדואר ולהסיר את כל האוויר מהמזרק.
- להקטין את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל0.5 μl / דקה. הזרימה הנמוכה והמשך נאכפה על ידי משאבת המזרק במהלך טעינה (בשלב 4.5) ידחוף תאים שאינם מחוברים דרך החוצה את הערוץ בצד (איור 2 ג).
- חבר את המזרק המכיל תרחיף התאים לצינור של הערוץ לשקע. לטעון את התאים על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק בעדינות. שימו לב לתאים הקרובים וביישוב מתחת לmicropads דרך עיני או דרך מסך מחשב.
- לשמור על לחץ על הבוכנה עד שמספיק תאים להתיישב מתחת לכריות. העומס האופטימלי הוא 1-3 תאים למשטח. ככל שתאים להתיישב מתחת לרפידות באופן אקראי, שזה די נפוץ שכמה כריות אינן מכילות תאים ורפידות אחרות מלאות לחלוטין עם תאים.
- נתק את המזרק המשמש להעמסת תא והצינור העבה המחוברים אליו מהצינורות דקים של הערוץ לשקע, שטוף את פרק הצדannel במשך כמה דקות בקצב זרימה גבוהה יותר (10 μl / min) כדי להסיר בועות ו / או תאים שעדיין לא לצאת מהשבב (איור 2) באוויר. אם תאים לא יוסרו מן הצד הערוץ, הם יכולים להתחיל לגדל בצד הערוץ ומפריעים לניסוי בשלב מאוחר יותר.
- שים את הזרימה של משאבת המזרק בחזרה ל 0.5 μl / דקות ולסגור את הערוץ מהצד על ידי חיבורו לצינור עבה (עוד 5 ס"מ בקירוב) המכיל תקע קטטר בסופה (איור 2 ד).
- להגביר את הזרימה לקצב זרימה סופית של 1-5 μl / דקה. ספיקות עשויות להשתנות בהתאם לבינוניות וזן שמרים.
- התחל סרט עם המיקרוסקופ ומצלמה ההגדרות המתאימות למטרת הניסוי. ודא שהמהירות של הבמה מיקרוסקופ מוגדרת מהירות כה נמוכה שהשמן יכול לעקוב. לקביעת replicative תוחלת חיים, תאי תמונה בכל 10 דקות. כדי להגן על תאים מהכמויות הזעירות של אור האולטרה סגול הנפלט מההלוגןמנורה, המשמשת במהלך רכישת דסק"ש, רצוי למקם את מסנן UV נוסף בנתיב האור. בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי, הוא העדיף לתמונת התאים בתדירות נמוכה יותר (למשל, בכל 20 דקות), כדי למנוע תופעות phototoxic. הניסוי מסתיים כאשר כל התאים הטעונים בתחילת הניסוי מתים, אשר בתנאים רגילים לוקח עד 5 ימים. מומלץ לבדוק באופן קבוע את הפוקוס של התמונות במהלך הניסוי ובמידת צורך להתאים אותו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, תאים נטענים לתוך שבב microfluidic ישירות מתרבות אמצע מעריכי. על מנת לבדוק אם התפלגות הגילים של תאים הלכודים בשבב microfluidic היא דומה לזה של התרבות לפני הטעינה, תאים היו מוכתמים agglutinin החיטה מצומדת לFITC (WGA-FITC) כדי להמחיש צלקות ניצן. כפי שניתן לראות באיור 3, המלכודת של תאים תחת micropads של שבב microfluidic אינה מוטה לתאים בגיל מסוים.
פשוט ניתן לקבוע replicative תוחלת חיים על ידי ספירת מספר הניצנים שמיוצרים על ידי תאים אם חד הורי. הנתונים אלה הופכים לעקומת תוחלת חיים על ידי מתכנן את אחוז תאי קיימא נגד מספר הניצנים המיוצרים. בדיקות סטטיסטיים, כגון אלה המבוצעים על ידי Kaeberlein, et al. 9, ניתן להשתמש בו כדי להשוות את נתוני תוחלת חיים מניסויים שונים. איור 4 מראה דוגמה של עקומות תוחלת חייםהשיג עבור זן שמרים BY4741 WT ושתי מוטציות (SIR2 Δ, fob1 Δ).
1 סרט זמן לשגות סרט של תא שמרים בודד WT BY4741 גובר על מדיום YPD. תמונות צולמו כל 10 דקות. התא מייצר בסך הכל 30 ניצנים לפני שהוא מת. בר סולם, 5 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
יתרון חשוב של שיטת microfluidic הוא היכולת להשתמש בהדמיה ברזולוציה גבוהה מתמשכת. כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה כגיל תאים, הזדקנות ניסוי בוצע עם BY4742 תאי שמרים המבטאים ILV3-GFP, אשר מיועד ל. איור 4 המיטוכונדריה נותן סקירה של מורפולוגיה המיטוכונדריה לאותה הקבוצה של תאים בגילים שונים (replicative 0 ניצנים, 10 ניצנים ושקדמו למוות). השינויים במורפולוגיה נראו בתאי האמצע בגיל דומים לאלו שדווחו בספרות לפני 10. אמנם בניסוי נציג המסוים הזה, את קצב הזרימה של המדיום לא היה אופטימלי ותאי בת היו נשמרים בתדירות גבוהה יחסית בניגוד לסרט 1, את איכות הניסוי עדיין הייתה מספיק כדי לנתח מורפולוגיה המיטוכונדריה ב49 תאים בודדים מעליהם כל אורך חיים.
סרט 2 סרט זמן לשגות של תא בודד BY4742 שמרים להביע ILV3-GFP, המשמש כדי להמחיש את המיטוכונדריה. תמונות צולמו כל 30 דקות. שניהם brightfield כמו גם את תמונות GFP תוקנו רקע לפני מיזוג שני הערוצים לתמונה אחת באמצעות ImageJ. בר סולם, 5 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
תאנה1 יור. סקירה סכמטי של התקנת microfluidic. הבדלי הגובה בין micropad PDMS ומכסה הזכוכית דומה לקוטר של תא שמרים (כ 3-4 מיקרומטר). טוען: תאי שמרים נטענים תחת micropads PDMS. Culturing: מדיום טרי זורם ברציפות על התאים הלכודים (חץ כחול). נתיחה: מתעוררים תאי בת הם סמוקים משם על ידי הזרימה של מדיום (כתום חץ).
איור 2. איור סכמטי של עיצוב הערוץ של שבב microfluidic.. עיגולים שחורים מציינים את מיקומם של חורי אגרוף בסוף ערוץ כניסה, יציאה וצד. ב '. תזרים מדיום שדרך ערוץ הכניסה (10 μl / min) ויוצא דרך צד הערוץ הגדול יותר (כתום חץ). אין זרימה דרך הערוץ לשקע, בגלל ההבדל בין ההתנגדות לאהוא צד וערוץ לשקע. ג. תאים נטענים לתוך השבב (חץ שחור) דרך הערוץ לשקע. לזרום דרך תעלת הצד מצטמצם 0.5 μl / דקה D:. לאחר שטיפת התעלה בצד, צד הערוץ חסום ובינוניות מתחיל לזרום על פני התאים הלכודים מתחת לmicropads (1-5 μl / min).
איור 3. טעינה סלולרי על השבב אינה מוטה לכיוון תא גיל מסוים. תרבות אמצע מעריכי YSBN6 WT (10 7 תאים / מ"ל) הייתה תווית עם WGA-FITC (2 μl של פתרון מניות מ"ל 5 מ"ג / לכל 10 6 תאים) עבור 1.5 שעות. תאים לאחר מכן הועלו על שקופית זכוכית או נטענים לתוך שבב microfluidic. ערימות Z נעשו (15 z-פרוסות במרחק 0.8 מיקרומטר) באורך גל של 470 ננומטר עירור באמצעות מטרת טבילה במים בהגדלה 63X. מספר הצלקות בכל ניצןתא נספר באופן ידני. צלקות ניצן נקבעו מ75 תאים בתרבית תאים וב79 שבב microfluidic.
איור 4. דוגמאות לעקומות תוחלת החיים השיגו עבור BY4741 WT (n = 76), SIR2 Δ (N = 63) וfob1 Δ (N = 58) באמצעות מכשיר microfluidic כאן תאר. יש שתי המחיקות חזקה, אך הפוכה, השפעה על המדידה חציון replicative תוחלת חיים של תאי השמרים. עבור כל ניסוי, את הזנים גדלו לילה במדיום YPD לשלב נייח ולאחר מכן אפשרו לחדש את הצמיחה המעריכית ידי דילול לתוך מדיום YPD טרי ודגירה על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני תחילת הניסוי. הנתונים התקבלו מLee et al. 4.
איור 5. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי כפונקציה של גיל:. דוגמה מייצגת של שינויים הקשורים לגיל במורפולוגיה של המיטוכונדריה בתא בודד (חץ לבן). כל התמונות הם מדורגים באופן זהה. בר סולם, 5 מיקרומטר B:. מורפולוגיות מיטוכונדריאלי שנצפו בקבוצה של 49 תאים לפני הפקת הניצן הראשון שלהם (0), לאחר 10 ניצנים (10) ולפני המוות (†). תמונה לדוגמה של כל כיתת מורפולוגיה כלולה. הנתונים שהוצגו הושגו במהלך ניסוי אחד ואת אותו הסט של תאים ששימש להבטחת יתרון מורפולוגיה בכל נקודת זמן. המיטוכונדריה היו דמיינו בזן BY4742 להביע גרסת ה-GFP-tagged של חלבון המיטוכונדריה ILV3 (נלקח מבסיס הנתונים גביית GFP 15). שניהם brightfield כמו גם את תמונות GFP תוקנו רקע לפני מיזוג שני הערוצים לתמונה אחת באמצעות ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת microfluidic המתוארת כאן היא כלי חשוב בתהליך הזדקנות רומן מחקר כפי שהיא מאפשרת יצירה פשוטה והאוטומטית של נתוני תוחלת החיים replicative שמרים בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מתמשכת. תכונות אלה הן שיפורים משמעותיים על פני האפשרויות הניסיוניות של השיטה הקלסית לנתיחה, עדיין יש כמה מגבלות של השיטה שצריך להילקח בחשבון.
שימו לב שיכול להיות מושפעים נקבעה replicative תוחלת חיים על ידי היעילות של שימור תאי אמא: לכל תא נשמר תחת micropad הסתברות מסוימת להישטף החוצה מהשבב (למשל תא ניצנים של תא השכן יכול לדחוף אותו מן micropad). ההסתברות המשולבת של תא להישטף החוצה עם עליית תוחלת חיים הולך וגדל. לכן, סביר יותר להניח כי תאים קצרי חיים השלימו מחזור החיים שלהם, לפני שנשטפו מתאי חיים ארוכים. העובדה שדומה לי נתוני fespan נוצר עם התקנת microfluidic 4 כמו בשיטה הקלסית microdissection 11-13 מצביע על כך שנושא זה הוא פוטנציאל מזערי בלבד, אם לא רלוונטי.
חשוב לציין כי עם התקנת microfluidic זה לא אפשרי כדי לבחור תאי בת בתולה בתחילת הניסוי, בניגוד לשיטה הקלסית לנתיחה. אף על פי כן בעת טעינת תאים מתרבות נוזלית גדל באופן אקספוננציאלי לתוך השבב, רוב התאים הם הטעונים עתה נולדו או צעירים יחסית (כ -54%, כלומר של התאים לא הנץ לפני וכ -27% פעם אחת) 14. משמעות דבר היא כי תוחלת חיים הם זלזלו ב1 עד 2 דורות לכל היותר. במקרה יוצא דופן, כי מבנה הגילים של אוכלוסיית התא משתנה באופן משמעותי, ניתן להעשיר את אוכלוסיית התא לבנות בתולות לפני הטעינה, למשל על ידי צנטריפוגה שיפוע או elutriation.
ntent "> באופן עקרוני יכול לשמש שבב microfluidic ללמוד זני שמרים הפלואידים בתקשורת ובתרבות שונה. עם זאת, זני שמרים שונים ו / או תקשורת עשויה לדרוש אופטימיזציה של קצב זרימה, כדי לאפשר שימור יעיל של תאי אמא. ככל שתאים נשמרים מבוססות בגודל שלהם, אין זה אפשרי לטעון זני שמרים, כי הם באופן משמעותי גדולים יותר או קטנים יותר בקוטר 3-4 מיקרומטר, כגון תאי שמרים דיפלואידים. זאת על ידי הפקת רקיק עם photoresists שונה, שבבי microfluidic יכולים להיות שנוצרו עם מרווח שונה בין מכסה הזכוכית וmicropads כדי לאפשר טעינה של תאים בגודל שונה אלה.למרות שהפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד להפוך את שבב עם ערוץ אחד, ניתן להוסיף ערוצים מרובים בשבב יחיד ולהריץ ניסויים מקבילים בו זמנית. תלוי במספר של ערוצים רצויים בשבב יחיד, זה עשוי להיות נחוץ כדי ליצור רקיק מותאם שבו הערוצים הם מרווחיםשיתוף פעולה הדוק יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לSchippers לורה לכתיבה את גירסאות הראשונות של תא טעינת הפרוטוקול ומרקוס דה Goffau וגיי Zampar עבור מניה המורפולוגיות המיטוכונדריה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
