Summary
ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。
Abstract
我々は、単一出芽酵母細胞は、それらの全体の寿命にわたって追跡することができるという簡単なセットアップマイクロ流体の使用を実証する。マイクロ流体チップはmicropadsの配列を使用して母と娘細胞間の大きさの違いを利用する。 micropadとカバーガラスとの間の距離は、酵母細胞（3-4ミクロン）の直径に類似しているため、ロード時に、細胞は、これらのmicropadsの下に閉じ込められている。ローディング手順の後、培地を継続的に小さいサイズのためにパッドの下に保持されない新興の娘細胞、うち定数と定義された実験全体を通して環境だけでなく、フラッシュを作成するだけでなく、チップを通してフラッシュされます。セットアップはとても効率的に50個々の細胞まで、単一の実験では5日の完全に自動化された方法で監視されたり、必要であれば、長くすることができ母細胞を保持します。また、チップの優れた光学特性が高いことができ全体の老化のプロセスの間に細胞の分解能イメージング。
Introduction
出芽酵母は、研究1のエージングのための重要なモデル生物である。最近、酵母細胞の老化複製を勉強するまで、各芽を手動母細胞2,3から削除された解剖の方法を必要とする骨の折れるプロセスであった。この問題を解決するために、我々は、最近、それらの全体の寿命にわたって4個々の母細胞を追跡することができる新規なマイクロ流体セットアップを提示した。
我々のマイクロ流体チップでは、酵母細胞は、エラストマーベースのソフトmicropads（ 図1参照）の下に閉じ込められている。媒体の連続的な流れは、離れて、新たに形成された娘細胞を洗浄し、新鮮な栄養素を細胞を提供する。単一の実験では、最大50の母細胞は、彼らの全体の複製寿命を通して完全に自動化された方法で監視できます。マイクロ流体チップの優れた光学的性質のために、それは同時に、酵母細胞生物学のさまざまな側面（ 例えば、監視することが可能である
古典的な解剖の方法に比べ、マイクロ流体セットアップはかなりの利点を提供します。それは全体の高齢化実験中に定義された、一定の環境を確保します。それは高価な特殊な機器を必要とせず、自動焦点と時間経過の能力だけでなく、細胞培養のための温度制御を搭載した任意の顕微鏡上で実行することができます。マイクロ流体チップの生産と操作は数日以内に学習することができる。さらに、細胞が対数増殖期培養直接、母細胞のビオチン化を必要とする別の最近公開されたマイクロ流体法5、以上の利点からロードすることができる。高分解能イメージング、ここに記載した方法と組み合わせることで徐々に変化を測定するために使用することができる細胞形態では、酵母中のタンパク質の発現および局在は前例のない方法で老化。のための能力単一細胞の長期モニタリングはまた、酵母細胞周期の研究のためのユニークな可能性を提供する。
この方法は、最近、この原稿が審査に入ったままの状態で公開されたプロトコル16から、ビオチンを除去するために最適化されています。
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Protocol
1。シリコンウェーハモールドの生産と準備
マイクロ流体チップは、ソフトリソグラフィーによって生成されたシリコンウェハ型から作成される。これらのウェーハは、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができる。それはそれぞれのウェハの製造はマイクロフルイディクス6に特化した基により行われることが望ましい。
ウェハはネガ型フォトレジスト二つの異なる層、SU-8 7を用いた2段階フォトリソグラフィ工程で行われる。チャネルは、最上層（;高さ10μmのSU-8 2010）で作られているのに対し、;底層が細胞捕捉領域（高さ3-4μmのSU-8 2002）を生成するために使用される。ウェハ製造プロセスの印象がHuang ら 8に見出すことができる。マイクロ流体チップの図面は著者と同様に、それぞれのウェーハを取得する方法についてのアドバイスから得ることができる。
- ウェハが得られると、タフタグintの一枚をカットメスと入口チャネルとmicropad配列（ 図2A）との間のチャネル構造の上にわずかにウェハ上に慎重に置きますと3ミリメートルで約0.5mmのO薄いストリップ。これは、セルのロード中に使用されることはありませんそれぞれのチップに大きな追加チャネルの形成をもたらすが、マイクロ流体デバイスの安定動作のためにも重要であろう。
- アルミ箔の二重層のガラスシャーレをカバーし、ペトリ皿にウェハを置く。アルミ箔は、ウエハとペトリ皿の間で実行されてからPDMSを防ぐことができます。 PDMSは、ウェハやガラスシャーレの間でクリープない場合は、ウェハは、ペトリ皿に永久的に固定となります。ウェハはまだ使用可能ですが、それが壊れたときにガラスシャーレを交換することはできませんとPDMSその後切り取るする必要があります。
2。マイクロ流体チップの生産
- 空のプラスチックを置きバランスと風袋バランスにカップ。プラスチックカップ（直径12cmのガラスシャーレ用）に40グラムPDMSベースを注ぐ。 4ミリリットル約1:10、 すなわちのAW / wの割合で使い捨てピペットでPDMS硬化剤を追加します。
- 数分間徹底的にPDMSと硬化剤を混ぜる。これは、硬化剤をピペットするために使用された使い捨てプラスチックピペットを用いて行うことができる。それは混合物が十分にウエハの上に注ぐ前に混合することが重要である。悪い混合は重合しないPDMSの一部の原因となります。
- ガラスシャーレにおけるウェハの上にPDMSを注ぐ。
- 硬化剤とPDMSの混合は、PDMS混合物中の気泡形成をもたらす。これらの泡は、PDMSが重合する前に削除する必要があります。 PDMSは、真空ポンプに接続されたデシケーター中でペトリ皿を配置することにより、ウエハの上に注ぐ後に脱気することができる。このセットアップでは、混合物からすべての気泡を除去するために約30分かかります。
- 重合番目さらに1時間65℃で、その後1時間と、120℃のホットプレートの上にウェハとペトリ皿を配置することによって、電子PDMS。
- ガラスシャーレからウエハと重合PDMSと一緒にアルミホイルを外します。アルミ箔とウェハの背面から重合したPDMSの薄い残留層をはがし。ウェハの上にPDMSの層を慎重に持ち上げて、ウエハから分離することができる。
- ベンチの上に逆さまに（上向きにチャンネル）PDMS層を置き、メスで慎重にPDMSに刻印シングルチップ設計を切り取る。後でカバーガラスへのチップの取り付けを改善するためのチャネルのエッジの周りにPDMSの約3ミリメートルを保持するようにしてください。
- ストレートな方法でPDMSを介してすべての道20ゲージルアースタブを押して入口、出口及びサイドチャネル（ 図2A）の末端PDMSにパンチ穴を開けます。
PDMSチップを確認してください穴をパンチしながらまだベンチに逆さまに横たわっている。これは、チャネルの閉塞を引き起こす可能性チャネルの内側に付着PDMSを防ぎます。
- 各穴をパンチした後、再びスタブを抜く前に、ピンセットでルアースタブにPDMSの列を削除します。 PDMS列は、他の背後に滞在し、ちょうどパンチ穴をブロックすることができます。
- その上にセロハンテープを配置し、直ちに再びテープを除去することにより、ダスト粒子と残留PDMSからチップの表面を清掃します。同様にチップが添付されますようにカバーガラスを清掃してください。
- 卓上型UV-オゾンクリーナーのUVランプ下洗浄チップとカバーガラスを置きます。一緒に結合する必要がある側面がランプに直面しなければならない。
- PDMSを露出させ、6-8分間UV光にガラスをカバーし、その後直接互いの上に露出面を配置することによって、カバーガラス上にチップを置く。
- 優しくチップの側面の周りにタップカバーガラスにPDMSの付着を促進し、気泡を除去した。これはmicropadsも同様にカバーガラスに取り付けるために原因とチャネル構造の上でタップしないでください。
- 60分間100℃のホットプレート上で、新たに作られたマイクロ流体セットアップを置きます。少しPDMSチップのエッジを持ち上げることを試みることによって、カバーガラスとPDMSチップの間の結合の強さをテストします。 PDMSブロックがガラス表面から持ち上げることができない場合は、結合が成功し、チップを使用する準備ができている。
3。セルの読み込みのためにチップを準備する
マイクロ流体デバイスの故障は、潜在的に顕微鏡に媒体の漏洩を引き起こす可能性があります。これを回避するためには、金属ホルダ及び/又は使用PDMSはマニキュア又はエポキシ接着剤でガラスを満たすチップの側面を封止する勧告である。 PDMSチップがカバーガラスに十分に接着されていない場合には、これは、媒体の漏れを防止する。また、チューブ接続は、媒体の漏れを回避するために、同様の方法で、挿入点の周囲に確保することができる。漏れの場合、シリンジポンプのスイッチを切り自家製水センサーは余分な安全対策として使用できます。特に、マイクロ流体チップ用に設計された金属ホルダの図面は、著者から得ることができる。
- チップのガラスと防水シールを作成するためのホルダーの金属部分の間にシリコーンゲルで、金属製のホルダーにマイクロ流体チップを置きます。ガラスを壊さないように、静かにナットをねじ込みます。
- 細い管（ 約 5〜15センチメートル長い）サイドチャネルチップの出口チャネルに接続します。ピンセットを使用することは、簡単にパンチ穴にチューブを挿入することができる。
- 培地で50ミリリットルルアーロックシリンジを埋める、注射器から空気を除去し、シリンジフィルター、20ゲージルアースタブ、短い太管（ 約長さ2cm）と細い管に順次接続します。ていることを確認し、薄い浴槽eはシリンジポンプおよび顕微鏡ステージとの間の距離に及ぶことが十分な長さである。
- 細い管が完全培地で満たされるまで早送り、シリンジポンプ、ポンプを注射器を置きます。
- チップの入口チャネル内にシリンジに接続細いチューブを押して、10μL/分（ 図2B）でのチップを通して培地を流す。チップ（ペトリ皿になど ）を残し培地を収集します。大型サイドチャネルと出口チャネルを作ったタフ·タグ間の抵抗差のため、媒体は、サイドチャネルを介して実行されます。
- 顕微鏡ステージにチップを置き、パッド上顕微鏡のフォーカスを設定。
オイルは、実験の時間経過にわたって乾燥されないため、油浸対物レンズの使用は、水浸対物レンズとより好ましい。
顕微鏡に応じてfは保持に問題がある可能性があります実験の最初の時間の間にocus。それは、細胞をロードし、実験を開始する前に、落ち着くことができますので、顕微鏡のステージで1〜2時間のためにチップを残しすることをお勧めします。
4。マイクロ流体チップに酵母細胞のロード
- 20ゲージルアースタブと太管（ 約 3センチメートル）に5ミリリットルルアーチップシリンジを接続します。
- チップにロードされる細胞培養のサンプルを取る。
ローディングのための好ましい細胞数は、1mlあたり1〜5×10 6細胞の間である。高い細胞数との文化は、ロード前に希釈する必要があります。細胞を最初に水で洗浄し、ローディング前に同様のグルコース割合を含有する最少培地に再懸濁されている場合にYPD培養細胞は、細胞の積載効率が何倍も向上させることができるとき。チップの動作時には、YPD培地を再度安全に使用することができる。
- 目に細胞懸濁液の約1ミリリットルをロードeは、注射器と注射器からすべての空気を除去する。
- 0.5μL/ minにシリンジポンプの流量を減少させる。ロード中に、シリンジポンプ（ステップ4.5）によって強制低いと継続的流れは、サイドチャネル（ 図2C）を経由して非付着細胞を押し出します。
- 出口チャネルのチューブに細胞懸濁液の入った注射器を接続する。優しく注射器のプランジャーを押してセルをロードします。入ってくると眼経由micropads下やコンピューターの画面を経由してセトリング細胞を守ってください。
- 十分な細胞がパッドの下に落ち着くまで、プランジャーへの圧力を維持する。最適負荷は、パッドごとの1-3のセルです。細胞がランダムにパッドの下に落ち着くように、それはいくつかのパッドは、任意のセルが含まれていないと他のパッドが完全に細胞で満たされていることが非常に一般的です。
- セルローディングと出口チャネルの薄いチューブからそれに接続されている太管に使用注射器を外し、サイドチャンネルをフラッシュ高流量（10μL/分）で数分のためannelは、気泡および/ またはまだチップ（ 図2B）を終了しなかった細胞を除去する。細胞は、サイドチャネルから除去されない場合は、サイドチャネルに成長し始めると、後に実験を妨害することができる。
- バックダウン0.5μL/ minまで、シリンジポンプの流れを入れて、その端（ 図2D）でカテーテルプラグを含む太管（ 約長さ5cm）に接続することにより、サイドチャネルを閉鎖。
- 1-5μL/分の最終的な流量に流量を増加。流量は、培地および酵母株によって異なる場合があります。
- 実験の目的に適した顕微鏡やカメラの設定でムービーを開始します。顕微鏡ステージの速度は油が従うことができるような低速に設定されていることを確認します。複製寿命、画像セルごとに10分の決定のために。ハロゲンにより放出される紫外光の微量から細胞を保護するために、DIC取得中に使用されているランプは、それが光路に追加のUVフィルタを配置することをお勧めします。蛍光顕微鏡を使用する場合は、光毒性効果を回避するためにそれほど頻繁に画像細胞（20分毎など ）に好適である。実験の開始時にロードされたすべての細胞が死んでいる時に実験は通常の条件下で5日を要した、完成されています。これは、定期的に実験中の画像の焦点を確認し、必要に応じて調整することをお勧めします。
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Representative Results
このプロトコルでは、細胞を直接中間指数培養物からマイクロ流体チップにロードされる。マイクロ流体チップに捕捉された細胞の年齢分布をロードする前培養と同様であるか否かを確認するために、細胞芽傷を可視化するためにFITCに抱合小麦凝集素（WGA-FITC）で染色した。 図3に見られるように、マイクロ流体チップのmicropads下での細胞の捕捉は、特定の年齢の細胞に付勢されていない。
複製寿命が単に単一母細胞によって産生される芽の数をカウントすることによって決定することができる。このデータは、生成さ芽数に対する生存細胞の割合をプロットすることによって寿命曲線に変換される。例えばKaeberlein らによって行われるような統計的検定は 、 図9には 、異なる実験からの寿命のデータを比較するために使用することができる。 図4は、寿命曲線の一例を示しているWT BY4741酵母株と2変異体（SIR2Δ、FOB1Δ）で得られた。
YPD培地上で成長する単WT BY4741酵母細胞のムービー1タイムラプスムービー。画像は、10分ごとに採取した。それは死ぬ前にセルが30芽の合計を生成します。スケールバーは5μm。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
マイクロ流体の方法の重要な利点は、連続的な高解像度のイメージングを使用する能力である。高齢化実験はミトコンドリアを標的とILV3-GFPを発現しているBY4742酵母細胞を用いて実施した。 図4は 、細胞の年齢として、ミトコンドリアの形態の変化を監視するためには、異なる複製年齢で細胞の同じセットのミトコンドリアの形態の概要を説明します（ 0蕾、10芽と死の前に）。半ば高齢細胞で見られる形態の変化が報告されたもので似ている10前文学。この特定の代表的な実験において、媒体の流量は、最適娘細胞はなかったが、 映画1とは対照的に、比較的高い周波数で保持され、実験の品質は依然として49上で個々の細胞のミトコンドリアの形態を分析するのに十分であった寿命全体。
ミトコンドリアを可視化するために使用されILV3-GFPを発現する単BY4742酵母細胞の映画の2タイムラプスムービー。画像は30分ごとに撮影された。明と同様にGFP画像の両方が背景ImageJのを使用して1つの画像に2つのチャネルをマージする前に修正されました。スケールバーは5μm。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
イチジクURE 1。マイクロ流体セットアップの概略図。PDMS micropadとカバーガラスとの間の高さの差は、酵母細胞（3-4ミクロン程度）の直径に類似している。ローディング：酵母細胞はPDMS micropads下にロードされます。培養：フレッシュ媒体が閉じ込め細胞（青色の矢印）にわたって連続的に流れます。解剖：新興娘細胞を培地（オレンジ色の矢印）の流れによって洗い流されています。
図2。マイクロ流体チップのチャネル設計の概略図。黒丸は、入口、出口側流路との端部にパンチ孔の位置を示す。B。大きなサイドチャネル（オレンジ色の矢印）を介してメディア入口チャネル（10μL/分）を通って流れて終了。出口チャネルを通る流れが原因tの間の抵抗差が存在しない彼が側と出口チャネル。C。細胞は、出口チャネルを介してチップ（黒矢印）にロードされる。 。サイドチャネルを通じて流れは0.5μL/分Dに還元される：サイドチャネルをフラッシュした後、サイドチャネルがブロックされ、媒体がmicropads（1-5μL/分）の下に閉じ込められた細胞の上を流れるように開始されます。
図3。チップに細胞負荷が特定の細胞の年齢に偏っていません。半ば指数YSBN6 WTの文化（10 7細胞/ ml）を用WGA-FITC（10 6細胞あたり5 mg / mlのストック溶液2μlの）で標識した1.5時間。次いで、細胞をスライドガラス上に置くか、またはマイクロ流体チップにロードされていた。 Zスタックは63X倍率水浸対物レンズを用いて470nmでの励起波長（0.8μmの距離における15のzスライス）を行った。各上の芽の傷跡の数細胞を手動で計数した。芽の傷跡は、培養中75細胞とマイクロ流体チップに79細胞から決定した。
図4。 BY4741 WT（N = 76）、SIR2Δ（N = 63）と、ここで説明するマイクロ流体デバイスを使用してFOB1Δ（N = 58）について得られた寿命曲線の例を示す。両方の欠失、測定に強い、まだ反対の効果を有する酵母細胞の中央複製寿命。各実験について、菌株を固定相にYPD培地で一晩増殖させ、次いで、実験を開始する前に3時間、30℃で新鮮なYPD培地およびインキュベーション中に希釈することによって指数関数的な成長を再開させた。データは、Lee ら 4から得た。
図5。年齢の関数として、ミトコンドリアの形態 ：単一のセル（白矢印）におけるミトコンドリア形態の加齢に伴う変化の代表例。すべての画像は同じスケーリングされます。スケールバーは5μmB：10芽（10）の後と前の死（†）に、彼らの最初の芽（0）を生成する前に49セルのセットで観察ミトコンドリア形態。各形態のクラスの例画像が含まれている。提示されたデータは、単一の実験の間に得られた細胞の同じセットを各時点で形態学を記録するために使用した。ミトコンドリアはミトコンドリアタンパク質ILV3（GFPコレクションデータベース15から取得した）のGFPタグ付きバージョンを表現BY4742株で可視化した。明と同様にGFP画像の両方が背景ImageJのを使用して1つの画像に2つのチャネルをマージする前に修正されました。
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Discussion
ここで説明したマイクロ流体の方法は、それが継続的な高分解能イメージングとの組み合わせで酵母複製寿命データのシンプルかつ自動生成を可能にするような研究を老化の重要な新しいツールです。これらの属性は、古典的な解剖法の実験的な可能性の上に大きな改善ですが、まだ考慮する必要がある方法のいくつかの制限があります。
micropad下に保持し、すべてのセルは、チップ（ 例えば、隣接セルの出芽細胞はそれから離れてプッシュすることができるから洗い流されるべき一定の確率があります決定複製寿命が母細胞の保持の効率性の影響を受ける可能性があることに注意してくださいmicropad）。セルの統合された確率が増加寿命と増加を洗い流すことができます。これにより、短命の細胞は長命細胞よりも洗い流される前に、そのライフサイクルを完了した可能性が高い。実際、同様のリチウム fespanデータは、古典的なマイクロダイセクション法11-13と同様にマイクロ流体セットアップ4で生成された無関係ではない場合は、この潜在的な問題は、わずかであることを示します。
マイクロ流体セットアップでクラシカル切開法とは対照的に、実験の開始時に処女娘細胞を選択することができないことに留意することが重要である。それにもかかわらず、チップに飛躍的に成長している培養液から細胞をロードするときに、ロードされた細胞の大部分が新たに生まれているか、または14（前に一度、27％程度の出芽決して細胞のすなわち約54％）は比較的若い。これは、寿命はせいぜい1から2世代で過小評価されることを意味します。細胞集団の年齢構成が大幅に変更されることが例外的な場合には、勾配遠心分離又は水簸によって、例えば 、ロード前に処女娘のために細胞集団を濃縮することができる。
ntent ">マイクロ流体チップは、原則的に、異なる培養培地中半数体酵母株を研究するために用いることができるが、異なる酵母株および/またはメディアが母細胞の効率的な保持を可能にするために、流量のいくつかの最適化を必要とし得る。細胞をもとに保持されるようにそれらの大きさに、そのような二倍体酵母細胞のような直径が3〜4ミクロンよりもかなり大きく又は小さくなっている酵母株をロードすることは不可能であるが、異なるフォトレジストを有するウェーハを製造することにより、マイクロ流体チップは、異なる間隔で生成することができるカバーガラスとmicropads間これらの異なる大きさのセルをロードできるようにする。ここで紹介するプロトコルは、単一のチャネルを有するチップを作成する方法について説明したが、それは単一チップで複数のチャネルを追加すると同時に、平行実験を実行することができる。シングルチップに所望のチャンネル数に応じて、チャネルが離間されるように適合ウェハを作成する必要があるかもしれより密接に一緒に。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、ミトコンドリアの形態を達成すると、セル負荷プロトコルとマーカス·デGoffauとGuille Zamparの最初のバージョンを作成するためのローラのシッパーズに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
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