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Bioengineering

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

Published: August 20, 2013 doi: 10.3791/50143

Summary

Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Abstract

Nós demonstramos a utilização de uma configuração de microfluidos simples, no qual as células de levedura de brotamento individuais podem ser rastreados em todo o seu tempo de vida. O chip de microfluídica explora a diferença de tamanho entre as células mãe e filha usando uma matriz de micropads. Após a carga, as células são presos debaixo destas micropads, porque a distância entre o microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (3-4 mm). Após o procedimento de carregamento, meio de cultura é continuamente perfundido através do chip, o que não só cria um ambiente constante e definida ao longo de toda a experiência, mas também elimina as células filhas emergentes, que não são retidas por baixo das almofadas, devido ao seu menor tamanho. A configuração retém células mãe tão eficientemente que numa única experiência de até 50 células individuais podem ser monitorizados de um modo totalmente automático, durante 5 dias, ou, se necessário, mais longo. Além disso, as propriedades ópticas excelentes do chip permitir altaResolução de imagem de células durante todo o processo de envelhecimento.

Introduction

Brotação de levedura é um organismo modelo importante para o envelhecimento investigação 1. Até recentemente, o estudo de envelhecimento replicativo em células de levedura era um processo laborioso que requer um método de esvaziamento, em que cada botão era removido manualmente a partir da célula mãe 2,3. Para resolver este problema, que recentemente apresentou um novo configuração microfluídicos capaz de rastrear células mãe individuais ao longo de toda sua vida útil 4.

Em nosso chip de microfluídica, células de levedura são presos sob micropads suaves à base de elastómeros (ver Figura 1). Um fluxo contínuo de meio de lava filha células recém-formadas e fornece as células com nutrientes frescos. Numa única experiência, até 50 células-mãe pode ser monitorizado de uma maneira completamente automatizada em todo o seu tempo de vida replicativo. Devido às excelentes propriedades ópticas do chip de microfluidos, é possível monitorizar simultaneamente diferentes aspectos da biologia das células de levedura (por exemplo,

Comparado com o método clássico de dissecção, a configuração de microfluidos proporciona vantagens substanciais. Ela garante um ambiente definido e constante durante todo o experimento de envelhecimento. Não requer nenhum equipamento especializado caro e pode ser executado em qualquer microscópio equipado com foco automático e capacidade de lapso de tempo, bem como de controle de temperatura para o cultivo celular. A produção e operação dos chips microfluidicos podem ser aprendidas dentro de poucos dias. Além disso, as células podem ser carregadas directamente a partir de uma cultura em crescimento exponencial, uma vantagem sobre um outro método de microfluidos recentemente publicado em 5, que requer a biotinilação das células-mãe. Combinado com uma imagem de alta resolução, o método aqui descrito pode ser usado para medir as alterações graduais na morfologia celular, expressão de proteína de levedura e localização durante o envelhecimento de uma forma sem precedentes. A capacidade paramonitoramento de longo prazo de células individuais também oferece possibilidades únicas para estudos do ciclo celular de levedura.

um Este método foi recentemente optimizado para remover a biotinilação do protocolo de 16, que foi publicada durante este manuscrito foi em avaliação.

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Protocol

1. Produção e Elaboração de um Wafer molde de silicone

Chips microfluídicos são criados a partir de um molde de wafer de silício produzidos por litografia macia. Essas pastilhas podem ser reutilizadas muitas vezes para produzir chips microfluidicos. É aconselhável que a produção de um respectivo bolacha é realizada por um grupo especializado em microfluidos 6.

A bolacha é feito num processo de duas etapas de fotolitografia usando duas camadas diferentes de material fotosensitivo negativo, SU-8 7. A camada inferior é usada para gerar a área de captura da célula (SU-8 2002; altura de 3-4 mm), enquanto que os canais são feitas com a camada superior (SU-8, 2010, altura 10 mm). Uma impressão de o processo de produção da bolacha pode ser encontrado em Huang et al 8. Os desenhos das fichas microfluidicos podem ser obtidos a partir dos autores, bem como aconselhamento sobre como obter uma respectiva bolacha.

  1. Uma vez que o wafer é obtido, corte um pedaço de Tough-Tag intÕ tiras finas de cerca de 0,5 milímetros por 3 mm com um bisturi e colocá-las cuidadosamente sobre a bolacha ligeiramente por cima da estrutura de canal entre os canais de entrada de ar e a matriz microPad (Figura 2A). Isto irá resultar na formação de um grande canal adicional em cada chip, o qual não irá ser utilizado apenas durante o carregamento da célula, mas também é importante para o funcionamento estável do dispositivo de microfluidos.
  2. Cobrir a placa de Petri de vidro com uma camada dupla de papel alumínio e colocar a hóstia na placa de Petri. A folha de alumínio irá impedir PDMS de correr entre a pastilha e a placa de Petri. Se PDMS faz fluência entre a bolacha e o prato de Petri de vidro, a bolacha será fixado permanentemente na caixa de Petri. Embora a bolacha é ainda útil, não será possível a substituição da placa de Petri de vidro, se rompe e o PDMS necessita ser cortada posteriormente.

2. Produção de chips microfluídicos

  1. Coloque um plástico vaziocopo na balança e tarar a balança. Despeje 40 g PDMS de base para o copo de plástico (para vidro de 12 cm de diâmetro placa de Petri). Adicionar o agente de cura de PDMS com uma pipeta descartável em relação a W / W de 01:10, isto é, cerca de 4 ml.
  2. Misture o PDMS e agente de cura cuidadosamente durante alguns minutos. Isto pode ser feito com a pipeta de plástico descartável, que foi usada para pipetar o agente de cura. É importante que a mistura é bem misturada antes da sua utilização na parte superior da bolacha. Pobre mistura fará com que parte do PDMS não polimerizar.
  3. Deite o PDMS no topo da bolacha na placa de Petri de vidro.
  4. A mistura de PDMS com o agente de cura vai originar a formação de espuma na mistura de PDMS. Estas bolhas precisam de ser removidos antes que o PDMS polimeriza. O PDMS pode ser desgaseificado depois vertendo-a no topo da bolacha, colocando a placa de Petri num exsicador ligado a uma bomba de vácuo. Com esta configuração, que leva cerca de 30 minutos para remover todas as bolhas a partir da mistura.
  5. Polimerizar ªPDMS e colocando a placa de Petri com a bolacha no topo de uma chapa quente a 120 ° C durante 1 hora e, em seguida, a 65 ° C durante mais uma hora.
  6. Remover a película de alumínio em conjunto com a bolacha e polimerizada PDMS da placa de Petri de vidro. Retire a folha de alumínio e a camada residual de fina polimerizada PDMS da parte traseira da bolacha. A camada de PDMS no topo da bolacha pode então ser separado da bolacha, levantando-a cuidadosamente.
  7. Coloque a camada de PDMS de cabeça para baixo (com os canais voltados para cima) no banco e cortar os únicos designs de chips impressos no PDMS cuidadosamente com um bisturi. Tentar reter cerca de 3 mm de PDMS em torno das bordas dos canais para melhorar a fixação do chip para o vidro de cobertura mais tarde.
  8. Faça furos no PDMS nas extremidades do canal de entrada, saída e lateral (Figura 2A), empurrando um esboço Luer 20 Medidor de todo o caminho através do PDMS de forma reta.

Certifique-se de que o chip PDMSainda está deitado de cabeça para baixo no banco, enquanto perfuração dos furos. Isto impede que o PDMS colem ao interior do canal, o que poderia causar o bloqueio do canal.

  1. Depois de perfurar cada buraco, retire a coluna de PDMS na ponta Luer com uma pinça antes de puxar a ponta novamente. A coluna PDMS poderiam ficar para trás e bloquear o buraco apenas um soco.
  2. Limpar as superfícies do chip de partículas de poeira e de PDMS residual colocando uma fita adesiva sobre ela e removendo imediatamente a fita de novo. Da mesma forma limpar a tampa de vidro para que o chip vai ser anexado.
  3. Coloque o chip limpo e tampa de vidro abaixo da lâmpada UV da bancada UV-Ozônio Cleaner. Os lados que precisam ser ligadas entre si deve enfrentar a lâmpada.
  4. Expor o PDMS e cobrir de vidro para a luz UV durante 6-8 min e imediatamente depois colocar o chip na tampa de vidro, colocando as superfícies expostas em cima uns dos outros.
  5. Bata levemente em torno dos lados do chippara promover a fixação do PDMS para o vidro de cobertura e para remover quaisquer bolhas de ar. Não toque no topo da estrutura do canal, pois isso pode fazer com que os micropads se apegar à tampa de vidro também.
  6. Coloque a configuração microfluídico recentemente feito numa placa quente a 100 ° C durante 60 min. Teste da força da ligação entre a cobertura de vidro e chip PDMS pela tentativa de levantar as bordas do chip de PDMS ligeiramente. Quando o bloco de PDMS não pode ser levantado da superfície do vidro, a ligação é bem sucedido e o chip está pronto para uso.

3. Preparando o Chip para celular Loading

A falha de um dispositivo de microfluidos pode potencialmente provocar uma fuga do meio no microscópio. Para evitar isso, é assessor utilizar um suporte de metal e / ou vedar os lados do chip em que o PDMS encontra o vidro com a unha polonês ou cola epóxi. Isto evita a fuga de meio, no caso do chip de PDMS não é suficientemente bem ligados à tampa de vidro. Além disso, a tubagemligações pode ser fixado em torno dos pontos de inserção de um modo semelhante, para evitar fugas de meio. Um sensor de água caseiro que desliga a bomba de seringa, em caso de vazamento pode ser usado como uma medida de segurança extra. Desenhos do suporte de metal concebida especialmente para o chip de microfluidos podem ser obtidos a partir dos autores.

  1. Coloque o chip de microfluídica no suporte de metal, com gel de silicone entre o vidro do chip e nas partes metálicas do suporte para criar um selo à prova d'água. Parafusar as porcas delicadamente, para não quebrar o vidro.
  2. Ligação de tubos finos (cerca de 5-15 cm de comprimento) para o canal lateral e o canal de saída do chip. O uso de pinças torna mais fácil inserir os tubos nos orifícios perfurados.
  3. Encher uma seringa de 50 ml de Luer-Lok com meio de cultura, remover o ar da seringa e ligar sequencialmente a um filtro de seringa, um topo de Luer 20 calibres, um tubo grosso de curto (cerca de 2 cm de comprimento) e com um tubo fino. Certifique-se de que a banheira finae é longo o suficiente para cobrir a distância entre a bomba de seringa e a platina do microscópio.
  4. Colocar a seringa na bomba de seringa, o avanço rápido da bomba até que o tubo fino é completamente cheia com o fluido.
  5. Empurrar o tubo fino ligada à seringa para dentro do canal de entrada do chip e deixar que o fluxo médio através do chip a 10 ul / min (Figura 2B). Recolher o substrato, deixando o chip (por exemplo, numa placa de Petri). O meio vai correr para fora através do canal lateral devido à diferença de resistência entre o resistente-Tag feita grande canal lateral e o canal de saída.
  6. Colocar o chip na platina do microscópio e ajustar o foco do microscópio sobre as almofadas.

O uso de objetivos de imersão em óleo é preferível que os objectivos de imersão em água porque o óleo não vai secar ao longo do tempo-curso do experimento.

Dependendo do microscópio poderia haver problemas relacionados com a retenção de fOCO durante as horas iniciais do experimento. Por isso, é aconselhável deixar o chip de uma a duas horas no palco microscópio para que ele possa se acalmar antes de células de carga e do início do experimento.

4. Carregamento de células de levedura na Microfluidic Chip

  1. Ligação a 5 ml Luer seringa para um esboço Luer Calibre 20 e um tubo de espessura (cerca de 3 cm).
  2. Tomar uma amostra da cultura de células a ser carregado para o chip.

A contagem de células preferido para a carga é de 1-5 x 10 6 culas por ml. As culturas com as contagens mais elevadas de células precisa de ser diluído antes do carregamento. Quando a cultura de células em meio YPD, a eficiência de carregamento de células pode ser melhorada muitas vezes se as células são lavadas primeiro com e ressuspensas em meio mínimo contendo uma percentagem de glucose semelhante antes do carregamento. Durante o funcionamento do chip, meio YPD novamente pode ser usado com segurança.

  1. Carregar cerca de 1 ml de suspensão de células em the seringa e remover todo o ar da seringa.
  2. Diminuição da taxa de fluxo da bomba de seringa a 0,5 ul / min. O baixo fluxo contínuo e reforçado pela bomba de seringa durante a carga (no passo 4.5) vai empurrar as células não-inscritos para fora através do canal lateral (Figura 2C).
  3. Ligação a seringa que contém a suspensão de célula para o tubo do canal de saída. Carregar as células pressionando o êmbolo da seringa gentilmente. Observe as células que entram e liquidação debaixo das micropads via ocular ou via tela do computador.
  4. Manter a pressão sobre o êmbolo até que as células suficientes resolver debaixo das almofadas. A carga máxima é 1-3 células por pad. Como as células se contentar debaixo das almofadas de forma aleatória, é bastante comum que algumas pastilhas não contêm células e outras almofadas são completamente preenchida com células.
  5. Desligue a seringa usada para o carregamento da célula eo tubo grosso ligado a ela do tubo fino do canal de saída, lave o ch ladoAnnel para um par de minutos a taxas de fluxo mais elevadas (10 ul / min) para remover as bolhas de ar e / ou células que ainda não saiu do chip (Figura 2B). Se as células não são removidos do canal lateral, elas podem começar a crescer no canal lateral e interferir com a experiência mais tarde.
  6. Coloque o fluxo da bomba de seringa, de volta para baixo para 0,5 ul / min e fechar o canal lateral para fora, ligando-o a um tubo de espessura (cerca de 5 cm de comprimento), que contém um tampão de cateter, na sua extremidade (figura 2D).
  7. Aumenta o fluxo a uma taxa de fluxo final 1-5 ul / min. As taxas de fluxo podem variar dependendo do meio e a estirpe de levedura.
  8. Iniciar um filme com as configurações de microscópio e câmera adequada para o objetivo do experimento. Certifique-se de que a velocidade da platina do microscópio está configurado para uma velocidade tão baixa que o óleo pode seguir. Para a determinação do tempo de vida replicativo, as células da imagem a cada 10 min. Para proteger as células a partir das quantidades diminutas de luz UV emitida pela halogéneolâmpada, que é utilizado durante a aquisição de DIC, é aconselhável colocar um filtro UV adicional no caminho da luz. Ao usar a microscopia de fluorescência, é preferido que as células da imagem com menor frequência (por exemplo, a cada 20 minutos), para evitar os efeitos fototóxicos. O ensaio é concluído quando todas as células carregadas no início da experiência são mortos, o que em condições normais de demora até 5 dias. Recomenda-se verificar regularmente o foco das imagens durante o experimento e, se necessário ajustá-lo.

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Representative Results

Neste protocolo, as células são carregadas para o chip de microfluidos directamente da cultura de meio-exponencial. Para determinar se a distribuição da idade das células aprisionadas no chip microfluídico é semelhante à da cultura antes do carregamento, as células foram coradas com aglutinina de trigo conjugada com FITC (WGA-FITC) para visualizar cicatrizes bud. Como pode ser visto na Figura 3, o aprisionamento de células sob as micropads do chip de microfluidos não é enviesada para as células de uma determinada idade.

Longevidade replicativa pode simplesmente ser determinada pela contagem do número de gomos que são produzidos por uma única célula mãe. Estes dados são transformados em uma curva de tempo de vida através da representação gráfica da percentagem de células viáveis ​​em relação ao número de rebentos produzidos. Os testes estatísticos, tais como as exercidas por Kaeberlein, et ai. 9, pode ser usado para comparar os dados de tempo de vida de diferentes experimentos. Figura 4 mostra um exemplo das curvas de tempo de vidaobtida para uma estirpe de levedura BY4741 WT e dois mutantes (SIR2 Δ, fob1 Δ).

Filme um filme Time-lapse de uma única célula de levedura BY4741 WT crescimento em meio YPD. As imagens foram tiradas a cada 10 min. A célula produz um total de 30 gomos antes de morrer. Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver filme .

Uma vantagem importante do método de microfluidos é a capacidade de usar imagens contínuo de alta resolução. Para monitorar alterações na morfologia mitocondrial, como células de idade, um experimento de envelhecimento foi realizado com células de levedura BY4742 expressando ILV3-GFP, que é voltado para o. Mitocôndrias Figura 4 apresenta uma visão geral da morfologia mitocondrial para o mesmo conjunto de células em diferentes idades (replicadoras 0 botões, 10 botões e antes da morte). As alterações morfológicas observadas em células de meia-idade semelhantes aos relatados emliteratura antes de 10. Embora nesta experiência representativa em particular, a taxa de escoamento do meio não foi óptima e filha células foram mantidas com uma frequência relativamente alta, em contraste com o filme 1, a qualidade da experiência foi ainda suficiente para analisar a morfologia mitocondrial em 49 células individuais sobre os seus toda vida.

2 filme com lapso de tempo do filme de uma única célula de levedura expressando BY4742 ILV3-GFP, que é utilizado para visualizar as mitocôndrias. As imagens foram tiradas a cada 30 min. Tanto o campo claro, bem como as imagens de fundo GFP foram corrigidas antes da fusão dos dois canais numa única imagem utilizando o ImageJ. Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver filme .

Figura 1
Figoure 1. Visão esquemática da configuração de microfluidos. A diferença de altura entre o PDMS microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (cerca de 3-4 mm). Loading: As células de levedura são carregados sob o micropads PDMS. Criação: meio fresco flui continuamente sobre as células presas (seta azul). Dissection: células-filhas Emergentes são liberadas afastado pelo fluxo de média (seta cor de laranja).

Figura 2
Figura 2. Ilustração esquemática do projeto do canal do chip de microfluídica. Uma. Círculos pretos indicam a localização dos furos na extremidade do canal de entrada, de saída e de lado. B. Fluxos de meio através do canal de entrada (10 ul / min) e sai através do canal lateral maior (seta cor de laranja). Não há nenhum fluxo através do canal de saída, devido à diferença de resistência entre tele lado e canal de saída. C. As células são carregadas para o chip (seta preta), através do canal de saída. O fluxo através do canal lateral é reduzida para 0,5 ul / min D:. Após a lavagem do canal lateral, o canal lateral é bloqueado e meio começa a fluir sobre as células presas por baixo das micropads (1-5 mL / min.)

Figura 3
Figura 3. Célula de carga para o chip não está inclinado para uma certa idade celular. Um meio-exponencial YSBN6 WT cultura (10 7 células / ml) foi marcado com WGA-FITC (2 ul de 5 mg / ml de solução por 10 6 culas) para 1,5 h. As células foram, em seguida, colocado em uma lâmina de vidro ou carregados no chip microfluídico. Stacks Z foram feitas (15 z-fatias de 0,8 distância mm) em um comprimento de onda de excitação de 470 nm usando uma objetiva de imersão em água de ampliação 63X. O número de marcas em cada brotode células foi contado manualmente. Bud cicatrizes foram determinados a partir de 75 células da cultura e 79 células no chip de microfluídica.

Figura 4
Figura 4. Exemplos de curvas de tempo de vida obtidas para BY4741 WT (n = 76), SIR2 Δ (n = 63) e fob1 Δ (n = 58), utilizando o dispositivo de microfluidos aqui descrito. Ambas as deleções têm uma forte, mas oposta, o efeito sobre o valor medido mediana do tempo de vida replicativo das células de levedura. Para cada experiência, as estirpes foram cultivadas durante a noite em meio de YPD até à fase estacionária e depois deixou-se retomar o crescimento exponencial, por diluição em meio YPD fresco e incubação a 30 ° C durante 3 horas antes de se iniciar o experimento. Os dados foram obtidos a partir de Lee et al. 4.

Figura 5
Figura 5. Morfologia mitocondrial, como uma função da idade A:. Um exemplo representativo de alterações associadas à idade na morfologia mitocondrial em uma única célula (a seta branca). Todas as imagens são dimensionadas de forma idêntica. Barra de escala, 5 mm B:. Morfologias mitocondrial observadas de um conjunto de 49 células, antes de produzir o seu primeiro botão (0), após 10 de botões (10) e antes da morte (†). Um exemplo de imagem de cada classe morfologia está incluído. Os dados apresentados foram obtidos durante uma única experiência e no mesmo conjunto de células foi utilizado para conseguir a morfologia em cada ponto de tempo. As mitocôndrias foram visualizados numa estirpe BY4742 expressando uma versão GFP da proteína mitocondrial ILV3 (obtido a partir do banco de dados de recolha de GFP 15). Tanto o campo claro, bem como as imagens de fundo GFP foram corrigidas antes da fusão dos dois canais numa única imagem utilizando o ImageJ.

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Discussion

O método de microfluídica aqui descrito é uma nova ferramenta importante na pesquisa do envelhecimento, uma vez que permite a geração simples e automatizado de dados expectativa de vida replicativo fermento em combinação com imagens de alta resolução contínua. Estes atributos são importantes melhoramentos em relação às possibilidades experimentais do método de dissecação clássico, ainda existem algumas limitações do método, que devem ser tidos em conta.

Note-se que o tempo de vida replicativo determinado pode ser afectada pela eficiência da retenção das células-mãe: Cada célula mantida sob uma microPad tem uma certa probabilidade de ser lavado para fora a partir do chip (por exemplo, a célula de brotamento de uma célula vizinha pode afastá-lo do o microPad). A probabilidade integrada de uma célula para ser lavado para fora aumenta com o aumento do tempo de vida. Assim, é mais provável que as células de curta duração completou o seu ciclo de vida, antes de ser lavado de células de longa duração. O fato de que semelhante li dados fespan foi gerado com a configuração de microfluidos 4 como com o método clássico de microdissecção 11-13 indica que este problema potencial é apenas menor, se não é irrelevante.

É importante notar que, com a configuração de microfluidos que não é possível seleccionar as células filhas virgens no início da experiência, em contraste com o método clássico de dissecção. No entanto, quando as células de carga líquida a partir de uma cultura de crescimento exponencial para o chip, a maioria das células carregadas são recém-nascidos ou relativamente jovem (ou seja, cerca de 54% das células enxertadas nunca antes e cerca de 27%, uma vez) 14. Isto significa que o tempo de vida são subestimadas por 1-2 gerações, no máximo. No caso excepcional em que a estrutura da idade da população de células é significativamente alterada, é possível enriquecer a população de células para as filhas virgens antes do carregamento, por exemplo, por centrifugação em gradiente ou elutriação.

ntent "> O chip de microfluidos pode, em princípio, ser utilizados para estudar as estirpes de levedura haplóides em diferentes meios de cultura. No entanto, as estirpes de leveduras diferentes e / ou meios de comunicação podem requerer alguma optimização da taxa de fluxo para permitir a retenção eficaz das células-mãe. medida que as células são retidas baseado a sua dimensão, que não é possível carregar as estirpes de levedura que são significativamente maiores ou menores do que 3-4 um de diâmetro, tais como células de levedura diplóides. Contudo, produzindo uma bolacha com diferentes fotorresistentes, chips microfluídicos poderia ser gerado com um espaçamento diferente entre a cobertura de vidro e micropads para permitir o carregamento dessas células de diferentes tamanhos.

Embora o protocolo aqui apresentado descreve como fazer um chip com um único canal, é possível adicionar vários canais num único chip e fazer experiências paralelas simultaneamente. Dependendo do número de canais desejados num único chip, pode ser necessário para criar uma bolacha adaptado em que os canais estão afastadosmais estreitamente.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Laura Schippers para escrever as primeiras versões do protocolo de carga celular e Marcus de Goffau e Guille Zampar por atingir morfologias mitocondriais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomer Mavom bv 1060040 This package contains PDMS base and PDMS curing agent.
Glass petri dishes 120/20 mm VWR International 391-2850
Cover glasses 22x40 mm CBN Labsuppliers BV 190002240
Tough-Tags Sigma-Aldrich Z359106
Aluminum foil
Plastic disposable cup
Serological pipette 5 ml VWR International 612-1245
Scotch tape VWR International 819-1460
Baysilone paste (GE Bayer silicones) Sigma-Aldrich 85403-1EA
PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD Cole Parmer EW-06417-11 Referred to as thin tubing
Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD Cole Parmer EW-06418-03 Referred to as thick tubing
Scalpel VWR International 233-5334
50 ml Luer-Lok syringes BD 300137
5 ml syringes, Luer tip VWR International 613-1599
Tweezers VWR International 232-2132
20 Gauge Luer stubs Instech Solomon LS20
Syringe filters (pore size 0.20 μm) Sigma-Aldrich 16534K
Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm Instech Solomon SP20/12
Petri dishes VWR International 391-0892
EQUIPMENT
Benchtop UV-Ozone Cleaner NOVA Scan PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite Harvard Apparatus 70-4505
SU-8 silicon master mold (wafer) Self-made; For details contact corresponding author
Balance Sartorius corporation ED4202S
Vacuum pump KNF Neuberger N022 AN.18
Desiccator VWR International 467-2115
Hot plate VWR International 460-3267
Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) Self-made; For details contact corresponding author
(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage Nikon Eclipse Ti-E

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References

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Huberts, D. H. E. W., Janssens, G.More

Huberts, D. H. E. W., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (78), e50143, doi:10.3791/50143 (2013).

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