Summary
Vi beskriver här funktionen av en mikrofluidikanordning som möjliggör kontinuerlig och hög upplösning mikroskopisk avbildning av enstaka spirande jästceller under deras avslutade replikativa och / eller kronologisk livslängd.
Abstract
Vi visar användningen av en enkel mikroflödessystem setup, där enstaka spirande jästceller kan spåras under hela deras livslängd. Den mikroflödessystem chip utnyttjar skillnaden i storlek mellan mor och dotter celler med en rad micropads. Vid lastning, celler fastnar under dessa micropads, eftersom avståndet mellan micropad och täckglaset liknar diametern hos en jästcell (3-4 | im). Efter lastning förfarande är odlingsmedium kontinuerligt spolas genom chip, vilket inte bara skapar en konstant och definierad miljö under hela försöket, men också spolar ut de nya dotterceller, som inte fångas under dynorna på grund av sin storlek. Installationsprogrammet behåller moderceller så effektivt att i ett enda experiment upp till 50 individuella celler kan övervakas på ett helt automatiserat sätt under 5 dagar eller, om nödvändigt, längre. Dessutom, de utmärkta optiska egenskaperna hos chipet medge en högUpplösning avbildning av celler under hela åldrandeprocessen.
Introduction
Knoppande jäst är en viktig modell organism för äldreforskning 1. Tills nyligen studera replikativa åldrandet i jästceller var en arbetsam process som kräver en dissektion metod, i vilken varje knopp manuellt avlägsnades från modercellen 2,3. För att lösa detta problem, presenterade vi nyligen en ny microfluidic inställning kunna spåra enskilda mor celler under hela deras livslängd 4.
I vår microfluidic chip, är jästceller instängda under mjuka elastomer-baserade micropads (se figur 1). Ett kontinuerligt flöde av mediet tvättar bort nybildade dotterceller och ger cellerna med färska näringsämnen. I ett enda experiment, kan upp till 50 Mor celler övervakas på ett helt automatiserat sätt hela deras replikationsförmåga livslängd. På grund av de utmärkta optiska egenskaperna hos microfluidic chip, är det möjligt att samtidigt övervaka olika aspekter av jäst cellbiologi (t.ex.
Jämfört med den klassiska dissekeringsmetod ger mikroflödessystem installationen väsentliga fördelar. Det garanterar en bestämd och konstant miljö under hela åldring experimentet. Det kräver ingen dyr specialutrustning och kan köras på alla mikroskop utrustat med automatisk fokus och tidsförlopp förmågor samt temperatur-kontroll för cellodling. Produktion och drift av de mikroflödessystem marker kan läras inom några dagar. Dessutom kan celler direkt laddas från en exponentiellt växande kultur, en fördel över en annan nyligen publicerad mikroflödessystem metod 5, som kräver biotinylering av moderceller. Kombinerat med högupplöst avbildning, den här beskrivna förfarandet kan användas för att mäta gradvisa förändringar en i cellulär morfologi, protein uttryck och lokalisering under jäst åldrande i ett aldrig tidigare skådat sätt. Möjligheten tilllångsiktig övervakning av enskilda celler ger också unika möjligheter till cykel jästcellens studier.
a Denna metod har nyligen optimerats för att avlägsna biotinyleringen ur protokoll 16, som publicerades samtidigt som detta manuskript var i recensionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Tillverkning och förberedelse av en Kiselskiva Mögel
Mikroflödessystem chips skapas från en kiselskiva form producerad av mjuk litografi. Dessa skivor kan återanvändas många gånger för att producera microfluidic chips. Det är tillrådligt att produktionen av en respektive wafer utförs av en grupp specialiserad på microfluidics 6.
Skivan är tillverkad i en tvåstegsprocess fotolitografi process med två olika lager av negativ fotoresist, SU-8 7. Bottenskiktet används för att generera området cellen svällning (SU-8 2002, höjd 3-4 ^ m), medan kanalerna är gjorda med det översta lagret (SU-8 2010, höjd 10 ^ m). Ett intryck av skivan produktionsprocessen kan hittas i Huang et al 8. De ritningar av mikroflödessystem chips kan erhållas från författarna samt råd om hur man skaffar en respektive wafer.
- När skivan erhålls, klippa en bit Tough-Tag into tunna remsor av ungefär 0,5 mm gånger 3 mm med en skalpell och placera dem noggrant på skivan något ovanpå kanalstruktur mellan inloppskanalerna och micropad array (Figur 2A). Detta kommer att resultera i bildandet av en stor ytterligare kanal i varje chips, som inte kommer endast användas under cellbelastning, men är också viktig för stabil drift av mikroflödessystem enhet.
- Täck glaset petriskål med ett dubbelt skikt av aluminiumfolie och placera skivan i petriskålen. Den aluminiumfolie hindrar PDMS från att köra in mellan skivan och petriskål. Om PDMS kryper in mellan skivan och glaset petriskål, kommer skivan att bli permanent i petriskål. Även om skivan fortfarande är användbar, kommer det inte vara möjligt att ersätta glaset petriskål om den går sönder och PDMS kommer att behöva skära ut efteråt.
2. Produktion av Mikroflödessystem Chips
- Placera en tom plastcup på balansen och tara balansen. Häll 40 g PDMS bas i plastmugg (för en 12 cm diameter glaspetriskål). Lägg PDMS härdningsmedel med en engångspipett i aw / vikt-förhållande av 01:10, dvs ca 4 ml.
- Blanda PDMS och härdare noggrant under flera minuter. Detta kan göras med den disponibla plastpipett som användes för att pipettera härdningsmedel. Det är viktigt att blandningen är väl blandat före upphällningen på toppen av skivan. Dålig omblandning kommer att orsaka en del av PDMS inte att polymerisera.
- Häll PDMS på toppen av skivan i glaset petriskål.
- Blandning av PDMS med härdningsmedlet kommer att leda till bubbelbildning i PDMS blandningen. Dessa bubblor måste avlägsnas innan PDMS polymeriserar. PDMS kan avgasas efter hälla den på toppen av skivan genom att placera petriskålen i en exsickator kopplad till en vakuumpump. Med denna inställning, det tar ca 30 min att ta bort alla bubblor från blandningen.
- Polymerisera the PDMS genom att placera petriskål med skivan på toppen av en värmeplatta vid 120 ° C under 1 h och sedan vid 65 ° C under ytterligare en timme.
- Avlägsna aluminiumfolie tillsammans med skivan och polymeriserade PDMS från glaset petriskål. Dra av aluminiumfolie och tunna kvarvarande lager av polymeriserade PDMS från baksidan av skivan. Skiktet av PDMS på toppen av skivan kan sedan separeras från skivan genom att lyfta upp noggrant.
- Placera PDMS lagret upp och ned (med kanalerna uppåt) på bänken och skär ut de enskilda chip design tryckt på PDMS försiktigt med en skalpell. Försök att behålla ca 3 mm av PDMS runt kanterna av kanalerna för att förbättra fastsättningen av chipset till täckglaset senare.
- Slå hål i PDMS vid ändarna av inlopps-, utlopps-och sidokanal (Figur 2A) genom att trycka en 20 Gauge Luer stub hela vägen genom PDMS på ett rakt sätt.
Se till PDMS chipfortfarande ligger upp och ner på bänken medan stansning hålen. Detta förhindrar PDMS från att fastna på insidan av kanalen, vilket kan orsaka blockering av kanalen.
- Efter stansning varje hål, ta bort kolumnen av PDMS i Luer stubben med pincett innan du drar stubben ut igen. PDMS kolumnen kunde annars stanna kvar och blockerar just stansade hål.
- Rengör ytorna på chip från dammpartiklar och kvarvarande PDMS genom att placera tejp på det och omedelbart ta bort tejpen igen. Likaså rengöra täckglaset som chipet kommer att bifogas.
- Placera den rengjorda chip och skyddsglas under UV-lampa för Benchtop UV-ozon Cleaner. Sidorna som behöver bindas samman måste vänd mot lampan.
- Exponera PDMS och täcka glaset till UV-ljus under 6-8 min och direkt därefter ställdes chipet på täckglaset genom att placera de exponerade ytorna ovanpå varandra.
- Försiktigt knacka runt sidorna av chipetför att främja fastsättningen av PDMS till täckglaset och för att avlägsna eventuella luftbubblor. Klicka inte på toppen av kanalen struktur eftersom detta kan orsaka micropads att få bifogas täckglaset också.
- Placera nygjorda mikroflödessystem installation på en värmeplatta vid 100 ° C i 60 min. Testa styrkan hos bindningen mellan täckglaset och PDMS chip genom att försöka lyfta upp kanterna av PDMS chip något. När PDMS blocket inte kan lyftas från glasytan, är limning framgångsrik och chipet är klar för användning.
Tre. Förbereda Chip för Cell Loading
Fel på en mikrofluidikanordning kan potentiellt orsaka läckage av mediet i mikroskopet. För att undvika detta är det rådgivande att använda en metall hållare och / eller täta sidorna av chipet där PDMS möter glaset med nagellack eller epoxy lim. Detta förhindrar läckage av medium i fall PDMS chipet inte är jordad, tillräckligt bra för att täckglaset. Även slangenanslutningar kan säkras runt insättningspunkter på ett liknande sätt för att undvika läckage av medium. En hemmagjord vatten sensor som stänger av sprutan pumpen vid läckage kan användas som en extra säkerhetsåtgärd. Ritningar av metallhållaren speciellt utformad för microfluidic chip kan erhållas från författarna.
- Placera mikroflödessystem chip i metallhållaren, med silikongel mellan glaset av chipet och metalldelarna hos hållaren för att skapa en vattentät tätning. Skruva åt muttrarna försiktigt, att inte bryta glaset.
- Anslut tunna rör (ca 5-15 cm lång) till sidan kanalen och utloppskanalen av chipet. Användningen av pincett gör det lättare att föra in slangen i de stansade hålen.
- Fyll en 50 ml Luer-Lok spruta med odlingsmedium, ta bort luft från sprutan och anslut den sekventiellt till en spruta filter, en 20 Gauge Luer påbörjad, en kort tjock slang (ca. 2 cm lång) och en tunn slang. Se till att den tunna badkare är tillräckligt lång för att överbrygga avståndet mellan sprutpumpen och mikroskopet scenen.
- Sätt sprutan sprutpumpen, snabbspolning framåt pumpen tills tunn slang är helt fyllt med medium.
- Skjut tunn slang ansluten till sprutan i inloppskanalen av chipet och låt mediet flödet genom chipset med 10 ul / min (Figur 2B). Samla det medium som lämnar chip (t.ex. i en petriskål). Mediet kommer att ta slut via sidokanalen på grund av motståndet skillnaden mellan den tuffa-Tag göras stor sidokanal och utloppskanalen.
- Placera chip i mikroskop scenen och ställ in mikroskopets fokus på elektroderna.
Användningen av mål oljeimmersion är att föredra framför den av målen vattennedsänkning eftersom oljan inte torkar ut under tidsförloppet av experimentet.
Beroende på mikroskopet kan det finnas problem med att behålla fOcus under de initiala timmarna av experimentet. Det är därför lämpligt att lämna chip för en till två timmar i mikroskop scenen så det kan slå sig ner innan du laddar celler och starta experimentet.
4. Laddar av jästceller i Microfluidic Chip
- Anslut en 5 ml Luer tip spruta till en 20 Gauge Luer stub och ett tjockt rör (ca. 3 cm).
- Ta ett prov av cellkulturen som skall laddas i chipet.
Den föredragna cellantal för lastning är mellan 1-5 x 10 6 celler per ml. Kulturer med högre celltal måste spädas före lastning. När odling av celler på YPD kan cellbelastning effektiviteten förbättras många gånger om cellerna först tvättas med och suspenderades i minimalt medium innehållande en liknande glukos procent före lastning. Under drift av chipset, kan YPD-medium igen användas säkert.
- Fylla på cirka 1 ml av cellsuspensionen in the sprutan och ta bort all luft ur sprutan.
- Minska flödeshastigheten för sprutpumpen till 0,5 ul / min. Den låga och fortsatt flöde upprätthålls av sprutpump under lastning (i steg 4.5) kommer att driva grupplösa celler via den sidan kanalen (figur 2C).
- Anslut sprutan innehållande cellsuspensionen till röret av utloppskanalen. Ladda cellerna genom att trycka på kolven av sprutan försiktigt. Observera cellerna kommer in och lösa nedanför micropads via okulär eller via datorskärmen.
- Behåll trycket på kolven tills tillräckligt många celler bosätta under dynorna. Den optimala belastningen är 1-3 celler per block. Som celler sedimentera under dynorna slumpmässigt, är det ganska vanligt att några kuddar inte innehåller några celler och andra dynor är helt fyllda med celler.
- Koppla sprutan används för cellbelastning och den tjocka slangen ansluten till den från den tunna slangen i utloppskanalen, spola sidan lmAnnel i ett par minuter vid högre flödeshastigheter (10 ul / min) för att avlägsna luftbubblor och / eller celler som inte ännu har matats ut från chip (Figur 2B). Om celler inte avlägsnas från sidan kanalen, kan de börja växa i sidan kanalen och störa experimentet senare.
- Sätt flödet av sprutpumpen tillbaka ner till 0,5 ul / min och stäng sidokanal av genom att ansluta den till en tjock rör (ca. 5 cm lång) innehållande en kateter plugg vid sin ände (Figur 2D).
- Öka flödet till en slutlig flödeshastighet av 1-5 | il / min. Flödena kan variera beroende på mediet och jäststam.
- Starta en film med mikroskop och kamera inställningar som är lämpliga för målet med försöket. Se till att hastigheten på mikroskop scenen är satt till en sådan låg hastighet att oljan kan följa. För bestämning av replikationsförmåga livslängd, bildceller varje 10 min. För att skydda cellerna från de små mängder av UV-ljus som avges av halogenlampa, som används vid DIC förvärv, är det lämpligt att placera en extra UV-filter i strålgången. Vid användning av fluorescensmikroskopi, är det föredraget att avbilda cellerna mindre ofta (t ex varje 20 min) för att undvika fototoxiska verkningar. Experimentet är avslutad när alla celler laddade vid starten av experimentet är döda, som under normala förhållanden tar upp till fem dagar. Det är tillrådligt att regelbundet kontrollera fokus på bilderna under försöket och vid behov justera den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll, celler laddas i microfluidic chip direkt från mitten av exponentiell kultur. För att kontrollera om åldersfördelningen av celler fångade i mikroflödessystem chip är liknande till det av kulturen före lastning, färgades cellerna med vete agglutinin konjugerad till FITC (WGA-FITC) att visualisera knopp ärr. Såsom kan ses i figur 3, är inneslutningen av cellerna under de micropads av mikroflödessystem chipet inte förspänd till celler av en viss ålder.
Replikativ livslängd kan enkelt bestämmas genom att räkna antalet knoppar som produceras av en ensamstående mamma cell. Dessa data omvandlas till en livslängd genom att plotta procentandelen viabla celler mot antalet producerade knoppar. Statistiska tester, såsom de som utförs av Kaeberlein, et al. 9, kan användas för att jämföra lifespan-data från olika experiment. Figur 4 visar ett exempel på livslängd kurvorerhålles för ett WT BY4741 jäststam och två mutanter (SIR2 Δ, fob1 Δ).
Film 1 Time-lapse film av en enda WT BY4741 jäst cell växer på YPD medium. Bilder togs varje 10 min. Cellen producerar totalt 30 knoppar innan den dör. Skala bar, 5 pm. Klicka här för att se filmen .
En viktig fördel med mikroflödessystem metod är förmågan att använda kontinuerlig avbilda med hög upplösning. Att övervaka förändringar i mitokondriernas morfologi som celler ålder, var en åldrande experiment utförda med BY4742 jästceller som uttrycker ILV3-GFP, som är riktade till mitokondrierna. Figur 4 ger en översikt av mitokondriell morfologi för samma uppsättning av celler vid olika replikativa åldrar ( 0 knoppar, 10 knoppar och före döden). Morfologi förändringar som ses i mitten av åldrade celler liknar de som rapporterats ilitteratur före 10. Även i detta speciella representativt experiment, var flödeshastigheten av mediet inte optimal och dotterceller bibehölls med en relativt hög frekvens i motsats till en film, var kvaliteten av experimentet fortfarande tillräckligt att analysera mitokondriell morfologi i 49 enskilda celler över deras hela livslängd.
Film 2 Time-lapse film av en enda BY4742 jäst cell som uttrycker ILV3-GFP, som används för att visualisera mitokondrierna. Bilder togs varje 30 min. Både ljusfält liksom GFP bilderna bakgrund korrigeras innan sammanslagning av de två kanalerna till en enda bild med ImageJ. Skala bar, 5 pm. Klicka här för att se filmen .
Fig.ure 1. Schematisk översikt av mikroflödessystem installationen. Höjdskillnaden mellan PDMS micropad och täckglaset liknar diametern hos en jästcell (ca 3-4 | im). Läser: Jästceller laddas under PDMS micropads. Odling: Nytt medium strömmar kontinuerligt över de instängda celler (blå pil). Dissection: Emerging dotterceller spolas bort av flödet av medium (orange pil).
Figur 2. Schematisk illustration av kanalen utformningen av mikroflödessystem chip. A. Svarta cirklar ange läget för de stansade hålen i slutet av inloppet, utloppet och sidan kanalen. B. Medium strömmar genom inloppskanalen (10 ul / min) och utträder via den större sidokanal (orange pil). Det finns inget flöde genom utloppskanalen, på grund av motståndet differensen mellan than sida och utloppskanalen. C. Celler laddas in i chip (svart pil) via utloppskanalen. Flödet genom sidokanalen reduceras till 0,5 ul / min D:. Efter urspolning av sidokanalen den sida kanalsblockerade och mediet börjar strömma över cellerna fångade nedanför micropads (1-5 | il / min).
Figur 3. Cellbelastning på chipet är inte partiska mot en viss cell ålder. En mid-exponentiell YSBN6 WT kultur (10 7 celler / ml) märktes med WGA-FITC (2 ^ 5 mg / ml stamlösning per 10 6 celler) för 1,5 tim. Celler placerades sedan på en glasplatta eller laddas i microfluidic chip. Z stackar gjordes (15 z-skivor på 0,8 um distans) vid en excitationsvåglängd av 470 nm med en 63x förstoring objektiv nedsänkning i vatten. Antalet knopp ärr på varjecell räknades manuellt. Bud ärr bestämdes från 75 celler i odling och 79 celler i mikroflödessystem chip.
Figur 4. Exempel på kurvor livslängdsstatistik erhölls för BY4741 WT (n = 76), SIR2 Δ (n = 63) och fob1 Δ (n = 58) med användning av här beskrivna mikroflödessystem enhet. Båda deletioner har en stark, men motsatt, effekt på den uppmätta median replikativa livslängd av jästcellerna. För varje experiment fick stammarna odlades över natten i YPD-medium till stationär fas och tilläts sedan att återuppta exponentiell tillväxt genom utspädning i färskt YPD-medium och inkubation vid 30 ° C under 3 h före start av experimentet. Data erhölls från Lee et al. 4.
Figur 5. Mitokondriell morfologi som en funktion av ålder A:. Ett representativt exempel på ålder-associerade förändringar i mitokondriernas morfologi i en enda cell (vit pil). Alla bilder skalas identiskt. Skala bar, 5 um B:. Mitokondriella morfologier observerats i en uppsättning av 49 celler innan producera sin första knopp (0), efter 10 knoppar (10) och före döden (†). Ett exempel bild av varje morfologi klass ingår. Angivna data erhölls vid ett enda experiment och samma uppsättning celler användes för att ha dödat morfologi vid varje tidpunkt. Mitokondrier visualiserades i en BY4742 stam som uttrycker en GFP-märkt version av den mitokondriella proteinet ILV3 (erhållen från GFP samlingsdatabasen 15). Både ljusfält liksom GFP bilderna bakgrund korrigeras innan sammanslagning av de två kanalerna till en enda bild med ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikroflödessystem metod som beskrivs här är ett viktigt nytt verktyg i forskningen kring åldrandet eftersom det möjliggör enkel och automatisk generering av livslängd jäst replikativa data i kombination med fortsatt hög upplösning. Dessa attribut är viktiga förbättringar under de experimentella möjligheterna för den klassiska dissekeringsmetod, men det finns några begränsningar av den metod som måste beaktas.
Notera att den bestämda replikativa livslängd kan påverkas av effektiviteten i retention av moderceller: Varje cell hålls under en micropad har viss sannolikhet för att tvättas ut från chippet (t.ex. den spirande cell i en angränsande cell skulle kunna driva bort den från den micropad). Den integrerade sannolikheten för en cell som skall tvättas ut ökar med ökande livslängd. Således, är det mer troligt att kortlivade celler avslutat sin livscykel innan de tvättas bort än långlivade celler. Det faktum att liknande li fespan data togs fram med mikroflödessystem installationen 4 som med den klassiska microdissection metoden 11-13 indikerar att denna potentiella problemet är bara mindre, om inte irrelevant.
Det är viktigt att notera att med mikroflödessystem installationen är det inte möjligt att välja virgin dotterceller vid starten av experimentet, till skillnad från den klassiska dissekeringsmetod. Ändå när du fyller celler från en exponentiellt växande flytande kultur i chipet, är majoriteten av de laddade cellerna nystartade eller relativt ung (dvs ca 54% av cellerna aldrig knoppande före och omkring 27% en gång) 14. Detta innebär att lifespans underskattas av 1 till 2 generationer som mest. I det särskilda fall att åldersstrukturen i cellen befolkningen avsevärt ändras, är det möjligt att berika cellpopulationen för jungfruliga döttrar före lastning, t.ex. genom centrifugering eller elutriation.
ntent "> Den mikroflödessystem chip kan i princip användas för att studera haploida jäststammar i olika odlingsmedier. dock med olika jäststammar och / eller media kan kräva viss optimering av flödet för att möjliggöra en effektiv lagring av moderceller. Som celler behålls baserade på deras storlek, är det inte möjligt att ladda jäststammar som är betydligt större eller mindre än 3-4 mikrometer i diameter, t.ex. diploida jäst. Men genom att producera en skiva med olika fotoresister, kunde mikroflödessystem chips genereras med ett annat avstånd mellan täckglaset och micropads att tillåta lastning av dessa olika stora celler.Även om protokollet presenteras här beskriver hur man gör en chip med en enda kanal, är det möjligt att lägga till flera kanaler i ett enda chip och kör parallella experiment samtidigt. Beroende på antalet önskade kanaler i ett enda chip, kan det vara nödvändigt att skapa en anpassad skiva i vilken kanalerna är åtskildanärmare varandra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Laura Schippers för att skriva de första versionerna av cellbelastning protokollet och Marcus de Goffau och Guille Zampar för att ha dödat mitokondriella morfologier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
