Summary
Vi beskriver her driften af en mikrofluid anordning, der tillader kontinuerlig og høj opløsning mikroskopisk billeddannelse af enkelte spirende gærceller under deres fuldstændige replikativ og / eller kronologisk levetid.
Abstract
Vi demonstrere brugen af en simpel microfluidic opsætning, hvor enkelt spirende gærceller kan spores hele deres levetid. Den microfluidic chip udnytter størrelsen forskellen mellem mor og datter celler ved hjælp af en vifte af micropads. Ved lastning, celler fanget under disse micropads, fordi afstanden mellem micropad og dækglasset svarer til diameteren af en gærcelle (3-4 um). Efter indlæsningen er dyrkningsmedium kontinuerligt skyllet gennem chippen, hvilket ikke kun skaber en konstant og defineret miljø hele eksperimentet, men også skyller de nye datter celler, som ikke opfanges under puderne på grund af deres mindre størrelse. Opsætningen bevarer mor celler så effektivt, at i et enkelt eksperiment op til 50 individuelle celler kan overvåges i en fuldautomatisk måde i 5 dage eller, hvis det er nødvendigt, længere. Desuden giver de fremragende optiske egenskaber af chip højOpløsning billeddannelse af celler under hele ældningsprocessen.
Introduction
Spirende gær er en vigtig model organisme til aldrende forskning 1.. Indtil for nylig studere replikativ aldring i gærceller var en besværlig proces, som kræver en dissektionsmetoden, hvor hver knop blev manuelt fjernet fra moderen cellen 2,3. For at løse dette problem, vi for nylig præsenterede en roman microfluidic setup i stand til at spore individuelle mor celler i hele deres levetid 4..
I vores microfluidic chip, er gærceller fanget under bløde elastomer-baserede micropads (se figur 1). En kontinuerlig strøm af medium skyller nydannede datter celler og giver cellerne med friske næringsstoffer. I et enkelt eksperiment, kan op til 50 Mor celler overvåges i en fuldt automatiseret måde i hele deres replikativt levetid. Grund af de fremragende optiske egenskaber af mikrofluid chip, er det muligt samtidigt at overvåge forskellige aspekter af gær cellebiologi (f.eks
Sammenlignet med den klassiske dissektionsmetoden giver microfluidic setup betydelige fordele. Det sikrer en defineret og konstant miljø under hele aldring eksperiment. Det kræver ingen dyre specialudstyr og kan køre på enhver mikroskop er udstyret med automatisk fokus og time-lapse evner samt temperatur-styring for celle dyrkning. Produktion og drift af de microfluidic chips kan læres i løbet af få dage. Derudover kan celler direkte indlæses fra en eksponentielt voksende kultur, en fordel frem for en anden nylig offentliggjort mikrofluid metode 5, som kræver biotinylering af mor celler. En Kombineret med høj opløsning billeddannelse, den her beskrevne metode kan anvendes til at måle gradvise ændringer i cellulær morfologi, aldring protein udtryk og lokalisering under gær i en hidtil uset måde. Muligheden forlangsigtede overvågning af enkelte celler giver også unikke muligheder for gær cellecyklus studier.
en Denne metode er for nylig blevet optimeret til at fjerne biotinylering fra protokol 16, som blev offentliggjort, mens dette manuskript var gennemgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling og tilberedning af en silicium wafer Mold
Mikrofluidenheder chips er skabt ud fra en silicium wafer støbeform fremstillet af blød litografi. Disse skiver kan genbruges mange gange til at producere mikrofluid chips. Det er tilrådeligt, at produktionen af en respektiv skive er udført af en gruppe med speciale i microfluidics 6..
Skiven er fremstillet i et to-trins fotolitografisk proces under anvendelse af to forskellige lag af negativ fotoresist, SU-8 7. Det nederste lag bruges til at generere cellen fangstområde (SU-8 2002 højde 3-4 um), hvorimod kanalerne er lavet med det øverste lag (SU-8 2010; højde 10 um). Et indtryk af wafer produktionsprocessen kan findes i Huang et al 8.. Tegningerne af microfluidic chips kan fås fra forfatterne samt rådgivning om, hvordan man får en respektiv wafer.
- Når wafer er opnået, skæres et stykke Tough-Tag into tynde strimler af omkring 0,5 mm og 3 mm med en skalpel og placere dem omhyggeligt på wafer lidt oven på kanal struktur mellem indløbskanalerne og micropad Array (figur 2A). Dette vil resultere i dannelsen af en stor ekstra kanal i hver chip, som ikke kun anvendes under celle lastning, men er også vigtig for stabil drift af mikrofluid enhed.
- Dæk glasset petriskål med et dobbelt lag af aluminiumsfolie og sætte skiven i petriskålen. Den aluminiumsfolie vil forhindre PDMS i at køre i mellem wafer og petriskål. Hvis PDMS gør krybe ind mellem skiven og glasset petriskål, vil wafer bliver permanent fastgjort i petriskålen. Selvom skiven er stadig brugbare, vil det ikke være muligt at erstatte glasset petriskålen hvis det bryder og PDMS vil være nødvendigt at skære ud bagefter.
2.. Produktion af Mikrofluidenheder Chips
- Placer en tom plastickop på balance og tarere vægten. Hæld 40 g PDMS basen i plastik kop (for en 12 cm diameter glas petriskål). Tilføj PDMS hærder med en engangs pipette i w / w forholdet 1:10, dvs omkring 4 ml.
- Bland PDMS og hærder grundigt i flere minutter. Dette kan gøres med engangs plastik pipette, der blev brugt til at pipettere hærdningsmidlet. Det er vigtigt, at blandingen er blandet godt før hælde den på toppen af skiven. Dårlig blanding vil medføre en del af PDMS ikke at polymerisere.
- Hæld PDMS på toppen af skiven i glasset petriskål.
- Blanding af PDMS med hærdningsmidlet vil føre til bobledannelse i PDMS blandingen. Disse bobler skal fjernes før PDMS polymeriserer. PDMS kan afgasses efter overhældning det oven på skiven ved at placere petriskålen i en ekssikkator forbundet til en vakuumpumpe. Med denne opsætning, tager det ca 30 min for at fjerne alle bobler fra blandingen.
- Polymerisere the PDMS ved at placere petriskål med skiven på toppen af en varm plade ved 120 ° C i 1 time og derefter ved 65 ° C i en time.
- Fjern aluminiumsfolie sammen med wafer og polymeriserede PDMS fra glasset petriskål. Skrælle aluminiumfolie og det tynde restlag af polymeriseret PDMS fra bagsiden af skiven. Laget af PDMS oven af skiven kan derefter separeres fra skiven ved at løfte den op forsigtigt.
- Placer PDMS lag på hovedet (med de kanaler opad) på bænken og klip enkelt chip designs trykt på PDMS forsigtigt med en skalpel. Forsøge at bevare omkring 3 mm PDMS omkring kanterne af kanalerne for at forbedre fastgørelsen af chippen til dækglasset senere.
- Hulle PDMS ved enderne af indløbet, udløbet og sidekanal (figur 2A) ved at skubbe en 20 gauge Luer stub hele vejen igennem PDMS i en lige måde.
Sørg for, at PDMS chipligger stadig op og ned på bænken, mens stansning huller. Dette forhindrer PDMS klistrer til indersiden af kanalen, hvilket kan forårsage blokering af kanalen.
- Efter stansning hvert hul, fjerne kolonne PDMS i Luer stub med en pincet, inden du trækker stub ud igen. PDMS kolonne ellers ophold bag og blokere netop hulles.
- Rengør overfladerne af chip fra støvpartikler og resterende PDMS ved at placere tape på det og straks fjerne tapen igen. Tilsvarende rengøre dækglasset som chippen vil blive knyttet.
- Placer den rensede chip og dækglas under UV-lampen af Benchtop UV-Ozon Cleaner. De sider, der skal bindes sammen, skal foran lampen.
- Eksponere PDMS og dække glas til UV-lys i 6-8 min og direkte derefter sætte chip på dækglasset ved at placere de udsatte overflader oven på hinanden.
- Blidt tryk omkring siderne af chipat fremme fastgørelse af PDMS til dækglasset og fjerne eventuelle luftbobler. Klik ikke på toppen af kanalen struktur som dette kan medføre micropads at få knyttet til dækglasset så godt.
- Placer nylavede mikrofluid opsætning på en varmeplade ved 100 ° C i 60 min. Teste styrken af bindingen mellem dækglasset og PDMS chip ved at prøve at løfte op kanterne af PDMS chippen lidt. Når PDMS blokken ikke kan løftes fra glasoverfladen, bindingen er vellykket, og chippen er klar til brug.
3.. Klargøring af Chip for Cell Loading
Svigt af en mikrofluid enhed kan potentielt forårsage lækage af medium i mikroskop. For at undgå dette, er det rådgivende at bruge en metalholder og / eller forsegle siderne af chippen, hvor PDMS møder glasset med neglelak eller epoxy lim. Dette forhindrer lækage af medium i tilfælde PDMS chippen er ikke bundet godt nok til dækglasset. Også slangenforbindelser kan fastgøres rundt indsætningspunkterne på en lignende måde for at undgå lækage af medium. En hjemmelavet vand sensor, som slukker sprøjtepumpen i tilfælde af lækage kan bruges som en ekstra sikkerhedsforanstaltning. Tegninger af metalholder specielt designet til microfluidic chip kan fås fra forfatterne.
- Placer microfluidic chip i metalholder med silikone gel mellem glasset af chip og metaldele indehaveren til at skabe en vandtæt forsegling. Skru møtrikkerne blidt, ikke at bryde glasset.
- Tilslut tynde rør (ca. 5-15 cm lang) til sidekanal og udløbskanalen af chippen. Brugen af pincet gør det lettere at indsætte slangen i de udstansede huller.
- Fyld en 50 ml Luer-Lok sprøjte med dyrkningsmedium, fjerne luften fra sprøjten, og tilslut det sekventielt til en sprøjte filter, en 20 gauge Luer stub, en kort tyk rør (ca. 2 cm lang) og et tyndt rør. Sørg for, at den tynde karbade er lang nok til at spænde over afstanden mellem sprøjtepumpen og mikroskopbordet.
- Placer sprøjten i sprøjtepumpen, hurtig fremad pumpen indtil den tynde rør er helt fyldt med medium.
- Skub tyndt rør forbundet til sprøjten i indløbskanalen af chippen og lad mediestrømmen gennem chippen på 10 ul / min (figur 2B). Saml mediet forlader chip (fx i en petriskål). Mediet vil løbe ud via sidekanalen grund af modstanden forskellen mellem den Tough-Tag gjort store side kanal og udløb kanal.
- Placer chip i mikroskopbordet og indstille fokus af mikroskopet på puder.
Brugen af olie Immersionsobjektiver foretrækkes frem, at vand Immersionsobjektiver fordi olien ikke tørrer ud over tidsforløbet af forsøget.
Afhængigt af mikroskop der kan være problemer med at fastholde fokus under de første timer af forsøget. Det er derfor tilrådeligt at lade chippen i én til to timer i mikroskopbordet, så det kan slå sig ned, før du lægger cellerne og starte eksperimentet.
4.. Loading Gærcellers i Mikrofluid Chip
- Tilslut en 5 ml luerspidssprøjte til en 20 gauge Luer stub og en tyk rør (ca. 3 cm).
- Tage en prøve af cellekulturen skal indlæses i chippen.
Den foretrukne celletal for læsning er mellem 1-5 x 10 6 celler pr ml. Kulturer med højere celletal skal fortyndes før lastning. Når dyrkning af celler på YPD kan celle lastning effektivitet forbedres mange gange, hvis cellerne først vaskes med og resuspenderes i minimal medium, der indeholder en tilsvarende glukose procent inden ilægning. Under drift af chip kan YPD medium igen anvendes sikkert.
- Load cirka 1 ml af cellesuspensionen i the sprøjte, og fjern al luften fra sprøjten.
- Formindske strømningshastigheden af sprøjtepumpen til 0,5 gl / min. Den lave og fortsat flow håndhæves af sprøjtepumpe under lastning (i trin 4.5) vil skubbe løsgængere celler ud via sidekanalen (Figur 2C).
- Forbind sprøjten med cellesuspensionen til røret af udløbskanalen. Load cellerne ved at trykke på stemplet i sprøjten. Overhold de celler, der kommer ind og afregning nedenunder micropads via øjet eller via computerskærmen.
- Opretholde presset på stemplet, indtil tilstrækkelig mange celler bosætte nedenunder pads. Den optimale belastning er 1-3 celler pr pad. Som celler afregne nedenunder puderne tilfældigt, er det meget almindeligt, at et par puder ikke indeholder celler og andre puder er helt fyldt med celler.
- Afbryd sprøjten bruges til celle lastning og den tykke rør forbundet til det fra den tynde slange af stikkontakten kanal skylles side lmannel for et par minutter ved højere strømningshastigheder (10 ul / min) for at fjerne luftbobler og / eller celler, der endnu ikke forlade den chip (figur 2B). Hvis cellerne ikke fjernes fra sidekanal, kan de begynde at vokse i sidekanal og forstyrre eksperimentet senere.
- Sæt strømmen af sprøjtepumpen tilbage ned til 0,5 gl / min og lukke sidekanal slukket ved at tilslutte den til en tyk rør (ca. 5 cm lang) indeholdende et kateter stik ved sin ende (figur 2D).
- Øge strømmen til en endelig strømningshastighed på 1-5 ul / min. Flow priserne kan variere afhængigt af mellemstore og gærstamme.
- Start en film med mikroskop og kameraindstillinger egnede til målet af forsøget. Sørg for at hastigheden af mikroskopet scenen er sat til sådan en lav hastighed, at olien kan følge. Til bestemmelse af replikativ levetid, billedet celler hver 10 min. For at beskytte celler fra små mængder af UV-lys der udsendes af halogenlampe, der anvendes under DIC erhvervelse, er det tilrådeligt at placere en ekstra UV-filter i strålegangen. Ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, foretrækkes det at billede af cellerne mindre hyppigt (f.eks hver 20 min) for at undgå fototoksiske virkninger. Eksperimentet er fuldført, når alle celler indlæst ved starten af eksperimentet er døde, som under normale forhold tager op til 5 dage. Det anbefales regelmæssigt at kontrollere fokus af billederne under forsøget og om nødvendigt justere den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol, celler indlæses i microfluidic chip direkte fra midten af eksponentiel kultur. At fastslå, om aldersfordeling celler fanget i mikrofluid chip er svarer til kulturen før lastningen blev celler farvet med hvede-agglutinin konjugeret til FITC (WGA-FITC) til at visualisere opløbet ar. Som det kan ses i figur 3, er indfangning af celler under micropads af mikrofluid chip er ikke forudindtaget til celler i en vis alder.
Replikativ levetid kan simpelthen bestemmes ved at tælle antallet af knopper, der er produceret af en enkelt moder-celle. Disse data er omdannet til en levetid kurve ved at plotte procentdelen af levedygtige celler mod antallet af producerede knopper. Statistiske tests, såsom dem, der udføres af Kaeberlein et al. 9 kan bruges til at sammenligne levetid data fra forskellige eksperimenter. Figur 4 viser et eksempel på levetid kurveropnås for en WT BY4741 gærstamme og to mutanter (SIR2 Δ, fob1 Δ).
Movie 1 Time-lapse film af et enkelt WT BY4741 gærcelle vokser på YPD medium. Billeder blev taget hver 10 min. Producerer cellen i alt 30 knopper før det dør. Scale bar, 5 m. Klik her for at se filmen .
En vigtig fordel ved mikrofluid metode er evnen til at anvende kontinuerlig høj opløsning billeddannelse. At overvåge ændringer i mitokondrie morfologi som celler alder, blev en aldrende eksperiment udført med BY4742 gærceller udtrykker ILV3-GFP, som er beregnet til mitokondrierne. Figur 4 giver en oversigt over mitokondrie morfologi for det samme sæt af celler ved forskellige replikative aldre ( 0 knopper, 10 knopper og forudgående til døden). Morfologi ændringer, der ses i midten alderen celler ligner dem rapporteret ilitteratur inden den 10.. Selv i dette særlige repræsentativt eksperiment, strømningshastigheden af mediet var ikke optimal og datter celler blev bibeholdt med en relativt høj frekvens i modsætning til Movie 1, kvaliteten af eksperimentet stadig var tilstrækkeligt at analysere mitokondrie morfologi i 49 individuelle celler over deres hele levetiden.
Film 2 Time-lapse film af en enkelt BY4742 gærcelle udtrykker ILV3-GFP, som anvendes til at visualisere mitokondrierne. Billeder blev taget hver 30 min. Både brightfield samt GFP billeder blev baggrunden korrigeres inden sammenlægge de to kanaler til et enkelt billede ved hjælp ImageJ. Scale bar, 5 m. Klik her for at se filmen .
FigUre 1.. Skematisk oversigt over mikrofluid setup. Højdeforskellen mellem PDMS micropad og dækglas svarer til diameteren af en gærcelle (omkring 3-4 um). Loading: Gærceller er indlæst under PDMS micropads. Dyrkning: Frisk medium strømmer kontinuerligt over de fangne celler (blå pil). Dissektion: Emerging datter celler bliver skyllet væk af strømmen af medium (orange pil).
Figur 2. Skematisk illustration af kanal design af mikrofluid chip. A. Sorte cirkler angiver placeringen af de udstansede huller i slutningen af fjorden, udløb og side-kanal. B. Medium strømmer gennem indløbskanalen (10 ul / min) og udgange via større side kanal (orange pil). Der er ingen strømning gennem udløbskanalen, fordi modstanden forskellen mellem than-og afgangssiden kanal. C. Celler indlæst i chippen (sort pil) via udløbskanalen. Strømmen gennem sidekanal er formindsket til 0,5 gl / min D:. Efter skylning sidekanalen er sidekanalen blokeret og medium begynder at flyde over cellerne fanget nedenunder micropads (1-5 ul / min).
Figur 3. Celle indlades chippen er ikke forudindtaget mod en bestemt celle alder. En midt-eksponentiel YSBN6 WT kultur (10 7 celler / ml) blev mærket med WGA-FITC (2 pi af 5 mg / ml stamopløsning pr 10 6 celler) for 1,5 timer. Cellerne blev derefter sat på en glasplade eller indlæst i microfluidic chip. Z stakke blev foretaget (15 z-skiver på 0,8 um afstand) ved en excitationsbølgelængde på 470 nm ved hjælp af en 63X forstørrelse nedsænkning i vand mål. Antallet af bud ar på hvercelle blev talt manuelt. Bud ar blev bestemt ud fra 75 celler i kulturen og 79 celler i mikrofluid chip.
Figur 4.. Eksempler på Levetid kurver opnået for BY4741 WT (n = 76), SIR2 Δ (n = 63) og fob1 Δ (n = 58) ved hjælp af her beskrevne mikrofluid enhed. Begge sletninger har en stærk, men modsat, effekt på den målte median replikativ levetid af gærcellerne. For hvert eksperiment blev stammerne dyrket natten over i YPD-medium til stationær fase og fik derefter lov til at genoptage eksponentiel vækst ved fortynding i frisk YPD-medium og inkubation ved 30 ° C i 3 timer før forsøget. Data blev indhentet fra Lee et al. 4..
Figur 5. Mitokondrie morfologi som funktion af alder A:. Et repræsentativt eksempel på alder-associerede ændringer i mitokondrie morfologi i en enkelt celle (hvid pil). Alle billeder er skaleret identisk. Scale bar, 5 m B:. Mitochondriale morfologier observeret i et sæt af 49 celler, før de producerer deres første knop (0), efter 10 knopper (10) og forud for dødsfaldet (†). Et eksempel billede af hver morfologi klasse er inkluderet. De præsenterede data blev opnået under en enkelt eksperiment og samme sæt af celler blev anvendt til at lave morfologi på hvert tidspunkt. Mitokondrier blev visualiseret i en BY4742 stammen udtrykker GFP-mærket version af mitokondrieprotein ILV3 (opnået fra GFP samling databasen 15). Både brightfield samt GFP billeder blev baggrunden korrigeres inden sammenlægge de to kanaler til et enkelt billede ved hjælp ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrofluid her beskrevne metode er et vigtigt nyt redskab i aldring forskning som det muliggør enkel og automatiseret generering af gær replikative levetid data i kombination med kontinuerlig høj opløsning billeddannelse. Disse egenskaber er væsentlige forbedringer i forhold til de eksperimentelle muligheder for klassiske dissektionsmetoden, men der er et par begrænsninger af metoden, der skal tages i betragtning.
Bemærk at den bestemte replikativ levetid kan blive påvirket af effektiviteten af tilbageholdelse af moderens celler: Hver celle holdt under en micropad har en vis sandsynlighed for at blive vasket ud fra chippen (f.eks spirende celle af en nabocelle kunne skubbe det væk fra den micropad). Den integrerede Sandsynligheden for en celle at blive vasket ud øges med stigende levetid. Det er således mere sandsynligt, at kortlivede celler afsluttet deres livscyklus, før at blive skyllet væk end langlivede celler. Den kendsgerning, at lignende li fespan data blev genereret med microfluidic setup 4 som den klassiske mikrodissektion metode 11-13 angiver, at dette potentielt problem er kun mindre, hvis ikke irrelevant.
Det er vigtigt at bemærke, at med mikrofluid opsætning er det ikke muligt at vælge jomfruelige datter celler ved starten af forsøget, i modsætning til den klassiske dissektionsmetoden. Ikke desto mindre, når du lægger celler fra en eksponentielt voksende flydende kultur i chippen, er de fleste af de indlæste celler nyfødte eller relativt ung (dvs. omkring 54% af cellerne aldrig okulerede før og omkring 27% én gang) 14.. Dette betyder, at levetiden er undervurderet af 1 til 2 generationer på de fleste. I det særlige tilfælde, at aldersfordelingen af cellepopulationen væsentligt ændres, er det muligt at berige cellepopulationen for jomfruelige døtre før lastningen fx ved gradient centrifugering eller elutriation.
ntent "> Den mikrofluid chip kan i princippet anvendes til at studere haploide gærstammer i forskellige dyrkningsmedier. Men forskellige gærstammer og / eller medier kan kræve en vis optimering af flow at muliggøre en effektiv fastholdelse af mor celler. Som celler bevares baseret på deres størrelse, er det ikke muligt at indlæse gærstammer, der er betydeligt større eller mindre end 3-4 um i diameter, såsom diploide gærceller. Men ved at producere en wafer med forskellige fotoresister, kunne mikrofluide chips blive genereret med en anden afstand mellem dækglasset og micropads at tillade indlæsning af disse forskellige størrelser celler.Selvom den protokol, der præsenteres her beskriver, hvordan man laver en chip med en enkelt kanal, er det muligt at tilføje flere kanaler i en enkelt chip og køre parallelle forsøg samtidigt. Afhængig af antallet af ønskede kanaler i en enkelt chip, kan det være nødvendigt at skabe en tilpasset skive som kanalerne er anbragttættere sammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Laura Schippers til at skrive de første udgaver af cellens lastning protokollen og Marcus de Goffau og Guille Zampar for at lave mitokondrie morfologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
