Summary
Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.
Abstract
Wir zeigen die Verwendung eines einfachen mikrofluidischen Einrichtung, in der einzelne Hefe-Zellen über die gesamte Lebensdauer verfolgt werden kann. Die Mikrofluidik-Chip nutzt die Größenunterschied zwischen Mutter und Tochter-Zellen mit einer Reihe von micropads. Bei Belastung werden die Zellen unter diesen micropads eingeschlossen, weil der Abstand zwischen der microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (3-4 um). Nach dem Ladevorgang wird Kulturmedium kontinuierlich durch den Chip, der nicht nur eine konstante und definierte Umwelt während des gesamten Experiments gespült, sondern auch spült den Schwellenländern Tochterzellen, die nicht unter den Pads aufgrund ihrer geringeren Größe zurückgehalten werden. Der Aufbau behält Mutter Zellen so effizient, dass in einem einzigen Experiment bis zu 50 einzelne Zellen in einer vollautomatisch während 5 Tagen überwacht werden oder, falls erforderlich, länger. Darüber hinaus ermöglichen die hervorragenden optischen Eigenschaften des Chips hoherAuflösung Bildgebung von Zellen während des gesamten Alterungsprozess.
Introduction
Bäckerhefe ist ein wichtiger Modellorganismus für Alternsforschung 1. Bis vor kurzem Studium replikativen Alterung in Hefezellen ein aufwändiger Prozess erfordern eine Dissektion Verfahren, in dem jeder Keim wurde manuell aus der Mutterzelle 2,3 entfernt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen neuen mikrofluidischen Einrichtung der Lage, einzelne Zellen Mutter während ihrer gesamten Lebensdauer 4 verfolgen.
In unserem mikrofluidischen Chips werden Hefezellen unter weichen Elastomer-basierte micropads gefangen (siehe Abbildung 1). Ein kontinuierlicher Strom des Mediums wäscht neu gebildeten Tochterzellen und stellt die Zellen mit frischen Nährstoffen. In einem einzigen Experiment, kann bis zu 50 Mutter-Zellen in einem vollautomatisch während ihrer gesamten Lebensdauer replikativen überwacht werden. Bedingt durch die hervorragenden optischen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips, ist es möglich, gleichzeitig zu überwachen verschiedenen Aspekte der Hefezelle biology (zB
Im Vergleich zu den klassischen Dissektionsverfahren stellt die mikrofluidischen Einrichtung wesentliche Vorteile. Er sorgt für einen definierten und konstanten Umwelt während des gesamten Experiments Alterung. Es erfordert keine teure Spezialausrüstung und kann auf jedem Mikroskop mit automatischer Fokussierung und Zeitraffer-Fähigkeiten sowie Temperatur-Kontrolle zur Zellkultivierung ausgestattet ausgeführt werden. Die Produktion und den Betrieb der mikrofluidischen Chips können in wenigen Tagen erlernt werden. Darüber hinaus können die Zellen direkt aus einer exponentiell wachsenden Kultur, ein Vorteil gegenüber anderen kürzlich veröffentlichten mikrofluidischen Verfahren 5, die Biotinylierung Mutter Zellen erfordert geladen werden. Kombiniert mit einer hochauflösenden Bildgebung, die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um graduelle Veränderungen zu messen in zelluläre Morphologie, Alterung Protein Expression und Lokalisation während Hefe in beispielloser Weise. Die Fähigkeit,Langzeit-Monitoring von Einzelzellen bietet auch einzigartige Möglichkeiten für Hefe-Zellzyklus-Studien.
a Diese Methode wurde kürzlich optimiert, um die Biotinylierung von dem Protokoll 16, die veröffentlicht, während dieses Manuskript war in Bewertung wurde entfernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion und Herstellung eines Silizium-Wafers Mold
Mikrofluidik-Chips aus einem Silizium-Wafer Form durch weiche Lithographie erzeugt. Diese Wafer kann viele Male wiederverwendet werden, um Mikrofluidik-Chips produzieren. Es ist ratsam, dass die Produktion eines entsprechenden Wafer von einer Gruppe in der Mikrofluidik spezialisiert 6 durchgeführt wird.
Der Wafer wird in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von Photolithographie zwei unterschiedliche Schichten mit negativer Photolack SU-8 7 hergestellt. Die untere Schicht wird verwendet, um die Zelle Fangebene (SU-8 2002, Höhe 3-4 um) zu erzeugen, während die Kanäle mit der Deckschicht (SU-8 2010, Höhe 10 um) hergestellt werden. Einen Eindruck von der Wafer-Produktion kann in Huang et al 8 gefunden werden. Die Zeichnungen der mikrofluidischen Chips können von den Autoren sowie Ratschläge, wie man einen entsprechenden Wafer erhalten erhalten werden.
- Sobald der Wafer erhalten, schneiden Sie ein Stück Tough-Tag into dünne Streifen von etwa 0,5 mm bis 3 mm mit einem Skalpell und legen Sie sie vorsichtig auf dem Wafer leicht auf der Oberseite des Kanals Struktur zwischen den Kanälen und dem Einlass microPad array (Abbildung 2A). Dies wird bei der Bildung einer großen zusätzlichen Kanal in jedem Chip, die nicht nur während Zellladung einsetzbar wäre, ist aber auch für den stabilen Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung wichtig.
- Bedecken Sie den Glas Petrischale mit einer doppelten Schicht aus Aluminiumfolie und legte die Scheibe in der Petrischale. Die Aluminiumfolie wird PDMS von aktiv zwischen dem Wafer und der Petrischale zu verhindern. Wenn PDMS tut Kriechen zwischen dem Wafer und dem Glas Petrischale wird der Wafer fixiert werden dauerhaft in der Petrischale. Obwohl der Wafer noch verwendbar, wird es nicht möglich sein, die Glas-Petrischale ersetzen, wenn er bricht das PDMS müssen später heraus geschnitten werden.
2. Herstellung von Mikrofluidik-Chips
- Legen Sie eine leere PlastikflascheTasse auf die Waage stellen und tarieren. Gießen Sie 40 g PDMS Basis in den Plastikbecher (für eine 12 cm Durchmesser Glas Petrischale). In PDMS Härter mit einem Einweg-Pipette in aw / w-Verhältnis von 1:10, also etwa 4 ml.
- Mischen Sie die PDMS und Härter gründlich mehrere Minuten. Dies kann mit Einweg-Kunststoff-Pipette, mit der das Härtungsmittel Pipette erfolgen. Es ist wichtig, dass das Gemisch gut vor dem Gießen auf der Oberseite des Wafers gemischt. Eine schlechte Vermischung bewirkt Teil des PDMS nicht polymerisieren.
- Gießen Sie das PDMS auf der Oberseite des Wafers im Glas Petrischale.
- Mischen von PDMS mit dem Härter wird Blasenbildung im PDMS-Gemisch führen. Diese Blasen müssen entfernt werden, bevor die PDMS polymerisiert werden. Die PDMS kann nach dem Gießen sie auf der Oberseite des Wafers, indem der Petrischale in einem Exsikkator mit einer Vakuumpumpe entgast werden. Mit diesem Setup, dauert es etwa 30 Minuten, um alle Luftblasen aus dem Gemisch zu entfernen.
- Polymerisieren the PDMS, indem Sie die Petrischale mit dem Wafer auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 1 Stunde und dann bei 65 ° C für eine weitere Stunde.
- Entfernen Sie die Alufolie zusammen mit dem Wafer und polymerisiert PDMS aus dem Glas Petrischale. Peel off der Aluminiumfolie und der dünnen Schicht aus polymerisierten Rest PDMS von der Rückseite des Wafers. Die Schicht aus PDMS auf dem Wafer kann dann vom Wafer nach oben heraus sorgfältig abgetrennt werden.
- Legen Sie die PDMS-Schicht auf den Kopf (mit den Kanälen nach oben) auf der Bank und schneiden Sie die Single-Chip-Designs auf der PDMS vorsichtig mit einem Skalpell aufgedruckt. Versuchen bis etwa 3 mm von PDMS an den Rändern der Kanäle zu halten, um die Befestigung des Chips auf dem Deckglas später zu verbessern.
- Lochung in der PDMS an den Enden der Eingangs-, Ausgangs-und Seitenkanal (2A), indem Sie einen 20 Messgerät Luer Stub den ganzen Weg durch das PDMS in einer geraden Weise.
Achten Sie darauf, die PDMS-Chipliegt noch kopfüber auf der Bank, während Stanzen der Löcher. Dies verhindert PDMS Kleben an der Innenseite des Kanals, die Blockierung des Kanals führen kann.
- Nach dem Stanzen jedes Loch, entfernen Sie die Spalte von PDMS in der Luer Stub mit einer Pinzette, bevor Sie die Stub wieder heraus. Die PDMS Spalte sonst bleiben hinter und blockieren die gerade gestanzte Loch.
- Reinigen Sie die Oberflächen des Chips von Staubpartikeln und Rest PDMS indem Klebeband drauf und sofort Entfernen des Bandes wieder. Ebenso reinigen das Deckglas auf dem der Chip angebracht werden.
- Platzieren Sie den Chip gereinigt und Deckglas unter der UV-Lampe der Benchtop UV-Ozon-Reiniger. Die Seiten, die miteinander verbunden werden sollen, müssen vor der Lampe.
- Setzen Sie die PDMS und Deckglas dem UV-Licht für 6-8 min und direkt danach setzen Sie den Chip auf dem Deckglas, indem die freiliegenden Flächen auf der jeweils anderen.
- Sanft um die Seiten des Chips tippenum die Befestigung des PDMS auf dem Deckglas zu fördern und mögliche Luftblasen zu entfernen. Nicht auf der Oberseite des Kanals Struktur tippen, da dies kann dazu führen, die micropads auf dem Deckglas angebracht sowie zu bekommen.
- Legen Sie die neu gemacht mikrofluidischen Setup auf einer Heizplatte bei 100 ° C für 60 min. Testen Sie die Stärke der Bindung zwischen dem Deckglas und PDMS-Chip, indem Sie versuchen, heben die Kanten des PDMS-Chip leicht. Wenn der PDMS-Block nicht aus der Glasoberfläche angehoben werden, ist die Verbindung erfolgreich und der Chip ist betriebsbereit.
3. Vorbereiten der Chip für Handy geladen
Der Ausfall einer Mikrofluidik-Vorrichtung kann somit zu Leckage von Medium in das Mikroskop. Um dies zu vermeiden, ist es, um eine beratende Halter aus Metall zu verwenden und / oder dichten die Seiten des Chips, wo die PDMS erfüllt das Glas mit Nagellack oder Epoxid-Kleber. Dies verhindert das Auslaufen des Mediums bei der PDMS-Chip ist nicht gut genug, um das Deckglas geklebt. Auch die SchläucheVerbindungen kann um die Ansatzstellen in ähnlicher Weise befestigt werden, um eine Leckage von Medium zu vermeiden. Ein hausgemachtes Wasser-Sensor, schaltet die Spritzenpumpe im Falle einer Leckage kann als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme verwendet werden. Zeichnungen der Halter aus Metall speziell für die Mikrofluidik-Chip konstruiert sind den Autoren erhalten werden.
- Platzieren des mikrofluidischen Chips in dem Metall-Halter, mit Silikon-Gel zwischen dem Glas des Chips und den Metallteilen der Halterung, um eine wasserdichte Abdichtung zu schaffen. Schrauben Sie die Muttern vorsichtig, damit das Glas nicht brechen.
- Verbinden dünne Röhren (ca. 5-15 cm lang) auf dem Seitenkanal und dem Auslasskanal des Chips. Die Verwendung einer Pinzette erleichtert, um den Schlauch in die gestanzten Löcher einzufügen.
- Füllen Sie eine 50 ml Spritze Luer-Lok mit Kulturmedium, entfernen Sie die Luft aus der Spritze und verbinden Sie es nacheinander mit einer Spritze Filter, einem 20 Spur Luer Stummel, einen kurzen dicken Schlauch (ca. 2 cm lang) und einen dünnen Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die dünne Wannee ist lang genug, um den Abstand zwischen der Spritzenpumpe und dem Mikroskoptisch erstrecken.
- Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe, schneller Vorlauf, bis die Pumpe den dünnen Schlauch vollständig mit Medium gefüllt ist.
- Schieben Sie den dünnen Schlauch mit der Spritze in den Einlasskanal des Chips und lassen Sie das Medium durch den Chip bei 10 ml / min (Abbildung 2B). Sammeln Sie das Medium verlässt den Chip (zB in einer Petrischale). Das Medium zur Neige gehen über den Seitenkanal wegen des Widerstandes zwischen der Tough-Tag groß gemacht Seitenkanal und den Auslasskanal.
- Platzieren Sie den Chip im Mikroskop Bühne und den Fokus des Mikroskops auf den Pads.
Die Verwendung von Ölimmersionsobjektive wird über die von Wasser Immersionsobjektive bevorzugt, weil das Öl nicht austrocknet über den zeitlichen Verlauf des Experiments.
Abhängig von der Mikroskop könnte es Probleme mit der Beibehaltung der focus in den ersten Stunden des Experiments. Es ist daher ratsam, den Chip für ein bis zwei Stunden in dem Mikroskop Bühne zu verlassen, damit es zu begleichen können sich vor dem Laden Zellen und Beginn des Experiments.
4. Laden von Hefezellen in der Mikrofluidik-Chip
- Schließen Sie ein 5 ml Luer Spritze zu einer 20 Spur Luer Stub und einem dicken Rohr (ca. 3 cm).
- Nehmen einer Probe von der Zellkultur in den Chip geladen.
Die bevorzugte Zellzahl für die Beladung zwischen 1-5 x 10 6 Zellen pro ml. Kulturen mit höheren Zellzahlen müssen vor der Beladung verdünnt werden. Wenn Kultivierung von Zellen auf YPD können Zellenbelastung verbessert viele-fach werden, wenn die Zellen zunächst mit gewaschen und erneut in Minimalmedium mit Glucose einen ähnlichen Prozentsatz vor dem Laden. Während des Betriebs des Chips kann YPD-Medium wieder sicher verwendet werden.
- Legen etwa 1 ml der Zellsuspension in the Spritze und entfernen Sie die Luft aus der Spritze.
- Verringern Sie die Flussrate der Spritzenpumpe bis 0,5 ml / min. Die niedrigen und kontinuierlichen Fluss von der Spritzenpumpe während des Ladens (in Schritt 4.5) durchgesetzt wird Push fraktionslosen Zellen erfolgt über den Seitenkanal (Abbildung 2C).
- Die Spritze mit der Zellsuspension in das Rohr des Auslasskanals. Laden der Zellen durch Drücken auf den Kolben der Spritze vorsichtig. Beachten Sie die Zellen, die in und Abrechnung unter den micropads über die Augen oder über den Computer-Bildschirm.
- Behalten Sie den Druck auf den Kolben, bis genügend Zellen unter den Pads zu begleichen. Die optimale Belastung 1-3 Zellen pro Pad. Als Zellen unter den Pads zufällig zu regeln, ist es durchaus üblich, dass ein paar Pads enthalten keine Zellen und andere Polster vollständig mit Zellen gefüllt.
- Trennen Sie die Spritze für die Zell-Beladung und dem dicken Schlauch verbunden, um sie von der dünnen Schlauch des Auslasskanal verwendet, spülen Sie die Seite channel für ein paar Minuten bei höheren Flussraten (10 ul / min), um Luftblasen zu entfernen und / oder Zellen, die noch nicht verlassen den Chip (2B). Wenn Zellen, die nicht von der Seite-Kanal entfernt sind, können sie beginnen, in dem Seitenkanal wachsen und stören das Experiment später.
- Setzen Sie den Fluss von der Spritzenpumpe wieder auf 0,5 ml / min und schließen Sie den Seitenkanal durch den Anschluss an einen dicken Schlauch (ca. 5 cm lang) mit einem Katheter Stecker an seinem Ende (2D).
- Erhöhen Sie die Durchflussmenge zu einer endgültigen Flussrate von 1-5 ml / min. Durchflussmengen je nach Medium und Hefestamm.
- Starten Sie einen Film mit dem Mikroskop und Kamera-Einstellungen für das Ziel des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die Geschwindigkeit des Mikroskops auf einen so niedrigen Geschwindigkeit, daß das Öl folgen ist. Für die Bestimmung der replikativen Lebensspanne, Bild-Zellen alle 10 min. Um Zellen aus den winzigen Mengen von UV-Licht durch die Halogen emittiert schützenLampe, die während DIC Übernahme verwendet wird, empfiehlt es sich, einen zusätzlichen UV-Filter in den Strahlengang zu platzieren. Bei der Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, ist es bevorzugt, Bild der Zellen weniger häufig (zB alle 20 Minuten) phototoxische Wirkungen zu vermeiden. Das Experiment wird beendet, wenn alle Zellen zu Beginn des Experiments geladen tot, die unter normalen Bedingungen dauert bis zu 5 Tagen. Es wird empfohlen, regelmäßig zu überprüfen, den Fokus der Bilder während des Experiments und gegebenenfalls einstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In diesem Protokoll werden die Zellen in dem mikrofluidischen Chip direkt vom mittleren exponentiellen Kultur geladen. Um festzustellen, ob die Altersverteilung der Zellen in der mikrofluidischen Chips gefangen ähnlich wie der Kultur vor dem Beladen wurden die Zellen mit Weizen agglutinin konjugiert FITC (WGA-FITC) zu visualisieren Sprossnarben gefärbt. Wie in 3 zu sehen ist, ist der Einschluß von Zellen unter den micropads des mikrofluidischen Chips nicht an Zellen eines bestimmten Alters vorgespannt.
Replikative Lebensdauer kann durch einfaches Zählen der Anzahl von Knospen, die von einer alleinerziehenden Mutter Zelle produziert werden bestimmt werden. Diese Daten werden in einer Lebensdauer ermitteln durch Auftragen der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen gegen die Anzahl der Knospen produziert verwandelt. Statistische Untersuchungen, wie sie von Kaeberlein, et al. 9 durchgeführt wird, kann verwendet werden, um Daten aus unterschiedlichen Lebensdauer Experimente vergleichen. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel der Lebensdauer Kurvenerhalten für einen WT Hefestamm BY4741 und zwei Mutanten (sir2 Δ, Δ FOB1).
Film 1 Zeitraffer-Film von einer einzigen WT BY4741 Hefezelle wachsen auf YPD-Medium. Die Bilder wurden alle 10 min gemacht. Die Zelle verfügt über insgesamt 30 Knospen, bevor er stirbt. Maßstab bar, 5 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Ein wichtiger Vorteil des mikrofluidischen Verfahren ist die Fähigkeit, kontinuierlich hochauflösenden Abbildung zu verwenden. Um Änderungen in der mitochondrialen Morphologie Zellen altern, Alterung Experiment wurde mit BY4742 Hefezellen ilv3-GFP, die den Mitochondrien. 4 gezielt durchgeführt überwachen gibt einen Überblick über Mitochondrienmorphologie für den gleichen Satz von Zellen bei verschiedenen Altersgruppen replikativen ( 0 Knospen, 10 Knospen und vor dem Tod). Die Morphologie Änderungen in Mitte gealterten Zellen gesehen ähneln denen berichtet inLiteratur vor 10. Obwohl in dieser speziellen repräsentativen Experiment wurde die Strömungsgeschwindigkeit des Mediums nicht optimal und Tochter-Zellen wurden mit einer relativ hohen Frequenz im Gegensatz zum Film 1 gehalten, die Qualität des Experimentes noch ausreicht, um Mitochondrienmorphologie in 49 Einzelzellen analysieren über ihre gesamte Lebensdauer.
Movie 2 Zeitraffer-Film aus einer einzigen Zelle, die Hefe BY4742 ilv3-GFP, die verwendet werden, um die Mitochondrien sichtbar wird. Die Bilder wurden alle 30 min gemacht. Sowohl die Hellfeld als auch die GFP Bilder wurden vor Hintergrund die Zusammenlegung der beiden Kanäle zu einem einzigen Bild mit ImageJ korrigiert. Maßstab bar, 5 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Abb.Abbildung 1. Schematische Darstellung der mikrofluidischen Einrichtung. Der Höhenunterschied zwischen dem PDMS microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (ca. 3-4 um). Loading: Hefezellen werden unter dem PDMS micropads geladen. Kultivierung: Frisches Medium fließt kontinuierlich über die eingefangenen Zellen (blauer Pfeil). Dissection: Aufstrebende Tochterzellen sind weg von der Strömung des Mediums (orange Pfeil) gespült.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Konstruktion des Kanals des mikrofluidischen Chips. A. Schwarze Kreise geben die Lage der Löcher am Ende der Eingangs-, Ausgangs-und Seitenkanal. B. Medium fließt durch den Einlaßkanal (10 ml / min) und tritt über den größeren Seitenkanal (orange Pfeil). Es gibt keine Strömung durch den Auslasskanal, weil der Widerstand zwischen ter Seite und Auslasskanal. C. Die Zellen werden in den Chip (schwarzer Pfeil) über den Auslaßkanal geladen. . Der Durchfluss durch den Nebenkanal bis 0,5 ml / min reduziert D: Nach dem Spülen der Seitenkanal, der Seitenkanal blockiert ist und Medium beginnt, sich über die Zellen unter den micropads (1-5 ml / min) gefangen zu fließen.
Abbildung 3. Handy Verladung auf dem Chip ist nicht auf eine bestimmte Zelle Alter vorgespannt. A mittleren exponentiellen YSBN6 WT Kultur (10 7 Zellen / ml) mit WGA-FITC (2 ul von 5 mg / ml Stammlösung pro 10 6 Zellen) wurde beschriftet 1,5 Stunden. Die Zellen wurden dann auf einen Objektträger gelegt oder geladen in die Mikrofluidik-Chip. Z-Stapel wurden (15 z-Scheiben bei 0,8 um Abstand) machte bei einer Anregungswellenlänge von 470 nm mit einem 63X Vergrößerung Wasserimmersionsobjektiv. Die Zahl der Knospe Narben auf jederZelle wurde manuell gezählt. Bud Narben wurden aus 75 Zellen in der Kultur und 79 Zellen in der Mikrofluidik-Chip bestimmt.
Abbildung 4. Beispiele für Lebensdauer-Kurven für BY4741 WT (n = 76), sir2 Δ (n = 63) und FOB1 Δ (n = 58) unter Verwendung der hier beschriebenen mikrofluidischen Vorrichtung erhalten. Beide Deletionen haben einen starken, aber entgegengesetzten Effekt auf die gemessenen Median replikativen Lebensdauer der Hefezellen. Für jedes Experiment wurden die Stämme über Nacht in YPD-Medium bis zur stationären Phase gezüchtet und dann exponentielles Wachstum durch Verdünnung in frisches YPD-Medium und Inkubation wieder bei 30 ° C für 3 Stunden vor Versuchsbeginn. Die Daten wurden von Lee et al. 4 erhalten.
Abbildung 5. Mitochondriale Morphologie als Funktion des Alters A:. Ein repräsentatives Beispiel für altersbedingte Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie in einer einzigen Zelle (weißer Pfeil). Alle Bilder sind identisch skaliert. Maßstab bar, 5 um B:. Mitochondriale Morphologie in einer Reihe von 49 Zellen vor der Herstellung der ersten Knospe (0) beobachtet, nach 10 Knospen (10) und vor dem Tod (†). Ein Beispiel Bild jedes Morphologie-Klasse enthalten ist. Die gezeigten Daten wurden in einem einzigen Experiment erhalten, und die gleiche Gruppe von Zellen wurde für die Auswertung Morphologie zu jedem Zeitpunkt verwendet werden. Die Mitochondrien wurden in einem BY4742 Stamm ein GFP-markierten Version des mitochondrialen Proteins ilv3 (erhalten aus der GFP Auflistungsdatenbank 15) visualisiert. Sowohl die Hellfeld als auch die GFP Bilder wurden vor Hintergrund die Zusammenlegung der beiden Kanäle zu einem einzigen Bild mit ImageJ korrigiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die mikrofluidischen hier beschriebene Methode ist ein wichtiges Werkzeug in Roman Altersforschung, wie es einfache und automatisierte Erzeugung von Hefe replikativen Lebensspanne Daten in Kombination mit kontinuierlichen hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Diese Attribute sind wesentliche Verbesserungen gegenüber den experimentellen Möglichkeiten der klassischen Dissektion Methode, aber es gibt ein paar Einschränkungen der Methode, die berücksichtigt werden müssen.
Beachten Sie, dass die ermittelte replikativen Lebensdauer durch die Effizienz der Speicherung Mutter Zellen stören kann: Jede Zelle unter einem microPad gehalten hat eine gewisse Wahrscheinlichkeit, aus dem Chip gewaschen werden (zB die angehende Zelle von einer benachbarten Zelle kann es von sich weg die microPad). Die integrierte Wahrscheinlichkeit einer Zelle zu lassen, mit zunehmender Lebensdauer gewaschen. So ist es wahrscheinlicher, dass kurzlebige Zellen ihres Lebenszyklus abgeschlossen, bevor sie weg als langlebige Zellen gewaschen. Die Tatsache, dass ähnliche li fespan Daten wurden mit der mikrofluidischen Einrichtung 4 erzeugt als mit dem klassischen Mikrodissektionsverfahren 11-13 zeigt an, dass dieses Potenzial Problem nur geringfügig ist, wenn nicht irrelevant.
Es ist wichtig zu beachten, dass mit der mikrofluidischen Einrichtung ist es nicht möglich, reines Tochterzellen zu Beginn des Experiments zu wählen, im Gegensatz zu der klassischen Dissektionsverfahren. Dennoch beim Laden Zellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur Flüssigkeit in den Chip, die Mehrheit der geladenen Zellen neu geboren oder relativ jung (dh etwa 54% der Zellen nie budded vor und rund 27% einmal) 14. Dies bedeutet, dass Lebensdauer von 1-2 Generationen in den meisten unterschätzt. In dem Ausnahmefall, dass die Altersstruktur der Bevölkerung deutlich Zelle geändert wird, ist es möglich, die Zellpopulation für jungfräulichen Töchter vor der Beladung, zB durch Zentrifugation oder Auswaschung zu bereichern.
ntent "> Die Mikrofluidik-Chip kann im Prinzip verwendet, um haploide Hefestämme in verschiedenen Kulturmedien zu studieren. jedoch verschiedene Hefestämme und / oder Medien können einige Optimierungen des Durchflusses erforderlich, um eine effiziente Speicherung von Mutter-Zellen zu ermöglichen. Wie Zellen basieren beibehalten nach Größe, ist es nicht möglich, Hefestämme, die erheblich größer oder kleiner als 3-4 um Durchmesser, wie diploiden Hefezellen laden. jedoch durch die Herstellung eines Wafers mit unterschiedlichen Photoresists Mikrofluidik-Chips mit einem unterschiedlichen Abstand erzeugt werden konnte zwischen dem Deckglas und micropads um das Laden dieser unterschiedlich großen Zellen.Obwohl das Protokoll hier beschrieben, wie ein Chip mit einem einzigen Kanal zu machen, ist es möglich, mehrere Kanäle in einem einzigen Chip hinzufügen und parallel Experimente gleichzeitig. Je nach Anzahl der gewünschten Kanäle in einem einzigen Chip, kann es notwendig sein, eine angepasste Wafers, in dem die Kanäle angeordnet erstellenenger zusammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir möchten Laura Schippers zum Schreiben der ersten Versionen der Zelle Laden Protokoll und Marcus de Goffau und Guille Zampar für Scoring mitochondrialen Morphologie danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
