Summary
हम यहां उनकी पूरी replicative और / या कालानुक्रमिक उम्र के दौरान एक नवोदित खमीर कोशिकाओं की निरंतर और उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक microfluidic डिवाइस के आपरेशन का वर्णन.
Abstract
हम एक नवोदित खमीर कोशिकाओं को उनके पूरे जीवन काल के दौरान पता लगाया जा सकता है जिसमें एक साधारण microfluidic के सेटअप के उपयोग के प्रदर्शन. microfluidic चिप micropads की एक सरणी का उपयोग कर मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच आकार अंतर का लाभ उठाते. Micropad और गिलास को कवर के बीच की दूरी एक खमीर सेल (3-4 सुक्ष्ममापी) के व्यास के समान है क्योंकि लोड करने पर, कोशिकाओं, इन micropads नीचे फंस रहे हैं. लदान प्रक्रिया के बाद, संस्कृति मध्यम लगातार अपने छोटे आकार के कारण पैड के नीचे बनाए रखा नहीं कर रहे हैं जो उभरते बेटी कोशिकाओं, बाहर flushes भी पूरे प्रयोग के दौरान एक निरंतर और परिभाषित वातावरण बनाता है, जो न केवल चिप के माध्यम से प्लावित है, लेकिन है. सेटअप एक ही प्रयोग में 50 तक व्यक्ति की कोशिकाओं अब, यदि आवश्यक हो, 5 दिनों के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित ढंग से नजर रखी जा सकता है कि इतनी कुशलता मां कोशिकाओं को बरकरार रखे. इसके अलावा, चिप की उत्कृष्ट ऑप्टिकल गुण उच्च की अनुमतिपूरी उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं का संकल्प इमेजिंग.
Introduction
खमीर नवोदित अनुसंधान 1 उम्र बढ़ने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव है. हाल ही में खमीर कोशिकाओं में उम्र बढ़ने replicative का अध्ययन जब तक हर कली मैन्युअल माँ सेल 2,3 से हटा दिया गया था, जिसमें एक विच्छेदन विधि की आवश्यकता होती है एक थका देने वाली प्रक्रिया थी. इस समस्या को हल करने के लिए, हम हाल ही में अपने पूरे जीवन काल 4 के दौरान व्यक्तिगत मां कोशिकाओं को ट्रैक करने में सक्षम एक उपन्यास microfluidic सेटअप प्रस्तुत किया.
हमारे microfluidic चिप में, खमीर कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) मुलायम इलास्टोमेर आधारित micropads में फंसे. मध्यम के एक निरंतर प्रवाह दूर नवगठित बेटी कोशिकाओं washes और ताजा पोषक तत्वों के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है. एक ही प्रयोग में, 50 को मां की कोशिकाओं को उनके पूरे replicative उम्र भर एक पूरी तरह से स्वचालित ढंग से नजर रखी जा सकती है. Microfluidic चिप के उत्कृष्ट ऑप्टिकल गुणों के कारण, यह एक साथ खमीर कोशिका जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं (जैसे नजर रखने के लिए संभव है
शास्त्रीय विच्छेदन विधि की तुलना में, microfluidic सेटअप पर्याप्त लाभ प्रदान करता है. यह पूरी उम्र बढ़ने के प्रयोग के दौरान एक परिभाषित और स्थिर वातावरण सुनिश्चित करता है. यह कोई महंगा विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और स्वचालित ध्यान और समय चूक क्षमताओं के साथ और साथ ही तापमान नियंत्रण सेल खेती के लिए सुसज्जित खुर्दबीन किसी पर चलाया जा सकता है. microfluidic चिप्स का उत्पादन और ऑपरेशन के कुछ ही दिनों के भीतर सीखा जा सकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं को सीधे एक तेजी से बढ़ रही संस्कृति, मां कोशिकाओं की biotinylation की आवश्यकता है जो एक और हाल ही में प्रकाशित microfluidic विधि 5, पर एक लाभ से लोड किया जा सकता है. एक यहाँ वर्णित विधि क्रमिक परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संयुक्त सेलुलर आकारिकी में, खमीर के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण एक अभूतपूर्व ढंग से उम्र बढ़ने की. के लिए क्षमताएकल कक्षों का लंबे समय तक निगरानी भी खमीर कोशिका चक्र के अध्ययन के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है.
एक इस विधि हाल ही में इस पांडुलिपि की समीक्षा में था, जबकि प्रकाशित किया गया था, जो प्रोटोकॉल 16 से biotinylation दूर करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
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Protocol
1. एक सिलिकॉन वेफर मोल्ड के उत्पादन और तैयारी
Microfluidic चिप्स नरम लिथोग्राफी द्वारा उत्पादित मे सिलिकॉन ढालना से बनाया जाता है. ये वेफर्स microfluidic चिप्स का उत्पादन करने के लिए कई बार reused किया जा सकता है. यह एक संबंधित वेफर का उत्पादन microfluidics 6 में विशेषज्ञता प्राप्त एक समूह द्वारा किया जाता है कि सलाह दी जाती है.
वेफर नकारात्मक photoresist की दो अलग परतों, SU-8 7 का उपयोग कर एक दो कदम फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया में किया जाता है. चैनलों के ऊपर परत (; ऊंचाई 10 माइक्रोन SU-8 2010) के साथ बना रहे हैं, जबकि, नीचे की परत सेल फँसाने क्षेत्र (ऊंचाई 3-4 माइक्रोन SU-8 2002) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वेफर उत्पादन प्रक्रिया की एक छाप हुआंग एट अल 8 में पाया जा सकता है. microfluidic चिप्स के चित्र एक संबंधित वेफर प्राप्त करने के तरीके पर इस लेखक के रूप में भी सलाह से प्राप्त किया जा सकता है.
- वेफर प्राप्त हो जाने पर सख्त टैग पूर्णांक में से एक टुकड़ा काटएक छुरी और इनलेट चैनल और micropad सरणी (2A चित्रा) के बीच चैनल संरचना के शीर्ष पर थोड़ा वेफर पर ध्यान से उन्हें जगह के साथ 3 मिमी से 0.5 मिमी की ओ पतली स्ट्रिप्स. यह केवल सेल लोडिंग के दौरान इस्तेमाल नहीं किया जाएगा, जिसमें प्रत्येक चिप में एक बड़े अतिरिक्त चैनल के गठन में परिणाम है, लेकिन microfluidic डिवाइस के स्थिर आपरेशन के लिए भी महत्वपूर्ण है.
- एल्यूमीनियम पन्नी के एक डबल परत के साथ कांच पेट्री डिश कवर और पेट्री डिश में वेफर डाल दिया. एल्यूमीनियम पन्नी वेफर और पेट्री डिश के बीच में चल रहा से PDMS कर पाएगा. PDMS वेफर और गिलास पेट्री डिश के बीच में रेंगना करता है, मे पेट्री डिश में स्थायी रूप से तय हो जाएगा. वेफर अभी भी useable है हालांकि यह टूट जाता है और PDMS बाद में बाहर कटौती करने की आवश्यकता होगी, तो यह गिलास पेट्री डिश को बदलने के लिए संभव नहीं होगा.
2. Microfluidic चिप्स का उत्पादन
- एक खाली प्लास्टिक की जगहसंतुलन और धड़ा संतुलन पर कप. प्लास्टिक के कप (एक 12 सेमी व्यास गिलास पेट्री डिश के लिए) में 40 ग्राम PDMS के आधार डालो. 4 मिलीलीटर के बारे में 1:10, यानी की ओ / w के अनुपात में एक डिस्पोजेबल विंदुक के साथ PDMS इलाज एजेंट जोड़ें.
- कई मिनट के लिए अच्छी तरह से PDMS और इलाज एजेंट मिलाएं. इस इलाज एजेंट पिपेट किया गया था कि डिस्पोजेबल प्लास्टिक विंदुक के साथ किया जा सकता है. यह मिश्रण अच्छी तरह वेफर के शीर्ष पर डालने का कार्य करने से पहले मिश्रित है कि महत्वपूर्ण है. गरीब मिश्रण भाजन करना नहीं PDMS के भाग के कारण होगा.
- गिलास पेट्री डिश में वेफर के शीर्ष पर PDMS डालो.
- इलाज के एजेंट के साथ PDMS का मिश्रण PDMS मिश्रण में बुलबुला गठन को बढ़ावा मिलेगा. ये बुलबुले PDMS polymerizes से पहले हटा दिया जाना चाहिए. PDMS एक वैक्यूम पंप से जुड़ा desiccator में पेट्री डिश रखकर वेफर के शीर्ष पर गिरने के बाद degassed किया जा सकता है. इस स्थापना के साथ, यह मिश्रण से सभी बुलबुले को दूर करने के बारे में 30 मिनट लगते हैं.
- वें भाजनएक घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर तो 1 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली के शीर्ष पर वेफर साथ पेट्री डिश रखकर ई PDMS.
- गिलास पेट्री डिश से वेफर और polymerized PDMS के साथ एक साथ एल्यूमीनियम पन्नी निकालें. एल्यूमीनियम पन्नी और वेफर के पीछे से polymerized PDMS की पतली अवशिष्ट परत को छीलकर. वेफर के शीर्ष पर PDMS की परत तो इसे ध्यान से ऊपर उठाने के द्वारा वेफर से अलग किया जा सकता है.
- बेंच पर उल्टा (ऊपर का सामना करना पड़ चैनलों के साथ) PDMS परत रखें और एक स्केलपेल के साथ सावधानी से PDMS पर अंकित सिंगल चिप डिजाइन बाहर कटौती. बाद में कांच कवर करने के लिए चिप की कुर्की सुधार करने के लिए चैनलों के किनारों के आसपास PDMS के बारे में 3 मिमी बनाए रखने की कोशिश करें.
- एक सीधे तरीके से PDMS के माध्यम से एक 20 गेज Luer ठूंठ सभी तरह धक्का द्वारा इनलेट, आउटलेट और साइड चैनल (2A चित्रा) के सिरों पर PDMS में पंच छेद.
सुनिश्चित करें कि PDMS चिपछेद छिद्रण, जबकि अभी भी बेंच पर उल्टा पड़ा हुआ है. इस चैनल की रुकावट पैदा कर सकता है, जो चैनल के अंदर करने के लिए चिपके से PDMS रोकता है.
- प्रत्येक छेद छिद्रण के बाद, फिर से ठूंठ बाहर खींच से पहले चिमटी के साथ Luer ठूंठ में PDMS के स्तंभ को हटा दें. PDMS स्तंभ अन्यथा पीछे रहने के लिए और सिर्फ छिद्रित छेद ब्लॉक सकता है.
- इस पर स्कॉच टेप रखने और तुरंत फिर से टेप हटाने से धूल कणों और अवशिष्ट PDMS से चिप की सतहों को साफ करें. इसी प्रकार जो चिप के साथ संलग्न किया जाएगा करने के लिए कवर कांच साफ.
- Benchtop यूवी ओजोन क्लीनर की यूवी दीपक के नीचे साफ चिप और गिलास को कवर रखें. एक साथ बंधुआ होने की जरूरत है कि पक्षों दीपक का सामना करना होगा.
- PDMS बेनकाब और 6-8 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के गिलास को कवर किया और सीधे बाद में एक दूसरे के शीर्ष पर सतहों उजागर रखकर कांच कवर पर चिप डाल दिया.
- धीरे चिप के किनारों के आसपास नलगिलास को कवर करने के लिए PDMS के लगाव को बढ़ावा देने के लिए और किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए. इस micropads के रूप में अच्छी तरह से कवर गिलास के साथ संलग्न करने के लिए कारण हो सकता है के रूप में चैनल संरचना के शीर्ष पर नल नहीं है.
- 60 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर नव बनाया microfluidic सेटअप रखें. थोड़ा PDMS चिप के किनारों को ऊपर उठाने की कोशिश कर रहा द्वारा कवर कांच और PDMS चिप के बीच संबंधों की ताकत का परीक्षण करें. PDMS ब्लॉक कांच की सतह से उठाया नहीं जा सकता, जब संबंधों में सफल रहा है और चिप के उपयोग के लिए तैयार है.
3. सेल लोड हो रहा है के लिए चिप की तैयारी
एक microfluidic डिवाइस की विफलता का संभावित माइक्रोस्कोप में मध्यम से रिसाव हो सकता है. इससे बचने के लिए, यह एक धातु धारक और / या PDMS नेल पॉलिश या epoxy गोंद के साथ कांच से मिलता है, जहां चिप के किनारों को सील करने के लिए सलाहकार है. इस PDMS चिप गिलास को कवर करने के लिए काफी अच्छी तरह से बंधुआ नहीं है मामले में माध्यम के रिसाव को रोकता है. इसके अलावा ट्यूबिंगकनेक्शन के माध्यम के रिसाव से बचने के लिए एक समान तरीके से प्रविष्टि अंक के आस - पास सुरक्षित किया जा सकता है. रिसाव के मामले में सिरिंज पंप बंद स्विच है कि एक घर में बने पानी सेंसर एक अतिरिक्त सुरक्षा एहतियात के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से microfluidic चिप के लिए डिजाइन धातु धारक के चित्र लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है.
- चिप का गिलास और एक निविड़ अंधकार मुहर बनाने धारक की धातु भागों के बीच सिलिकॉन जेल के साथ, धातु धारक में microfluidic चिप रखें. कांच तोड़ने के लिए नहीं, धीरे पागल भाड़ में.
- पतली ट्यूब (सी ए 5-15 सेमी लंबे) की ओर चैनल और चिप की दुकान चैनल से कनेक्ट करें. चिमटी का उपयोग यह आसान छिद्रित छेद में ट्यूबिंग डालने के लिए बनाता है.
- संस्कृति के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर Luer लोक सिरिंज भरें, सिरिंज से हवा निकालने और एक सिरिंज फिल्टर, एक 20 गेज Luer ठूंठ, एक छोटी मोटी ट्यूब (सी ए 2 सेमी लंबे) और एक पतली ट्यूब को क्रमिक रूप से इसे कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि पतली टबई सिरिंज पंप और खुर्दबीन मंच के बीच दूरी की अवधि के लिए लंबे समय पर्याप्त है.
- तेजी से आगे पतली ट्यूब तक पंप पूरी तरह से मध्यम से भर जाता है, सिरिंज पंप में सिरिंज रखें.
- चिप के इनलेट चैनल में सिरिंज से जुड़े पतली ट्यूब पुश और 10 μl / मिनट (चित्रा 2 बी) पर चिप के माध्यम से मध्यम प्रवाह करते हैं. चिप (एक पेट्री डिश में जैसे) छोड़ने मध्यम लीजिए. मध्यम क्योंकि सख्त टैग बड़ी पक्ष चैनल और आउटलेट चैनल बनाया के बीच प्रतिरोध अंतर की तरफ चैनल के माध्यम से बाहर चला जाएगा.
- माइक्रोस्कोप चरण में चिप प्लेस और पैड पर खुर्दबीन ध्यान सेट.
तेल के प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर बाहर सूखी नहीं होगा क्योंकि तेल विसर्जन उद्देश्यों के उपयोग के पानी विसर्जन उद्देश्यों की है कि अधिक पसंद किया जाता है.
माइक्रोस्कोप के आधार पर च बनाए रखने के साथ मुद्दों हो सकता हैप्रयोग के शुरुआती घंटों के दौरान ocus. यह कोशिकाओं लोड हो रहा है और प्रयोग शुरू करने से पहले बसने सकते हैं ताकि खुर्दबीन मंच में एक से दो घंटे के लिए चिप छोड़ने के लिए इसलिए उचित है.
4. Microfluidic चिप में खमीर कोशिकाओं की लोडिंग
- एक 20 गेज Luer ठूंठ और एक मोटी ट्यूब (सी ए 3 सेमी) करने के लिए एक 5 मिलीलीटर Luer टिप सिरिंज कनेक्ट.
- चिप में लोड करने के लिए सेल संस्कृति का एक नमूना ले लो.
लोडिंग के लिए पसंदीदा सेल गिनती मिलीलीटर प्रति 1-5 x 10 6 कोशिकाओं के बीच है. उच्च सेल गिनती के साथ संस्कृतियों को लोड करने से पहले पतला करने की आवश्यकता है. कोशिकाओं को पहले से धोया और लोड करने से पहले एक ऐसी ही ग्लूकोज प्रतिशत जिसमें कम से कम मध्यम में resuspended अगर YPD पर संवर्धन कोशिकाओं, सेल लोडिंग दक्षता कई गुना सुधार किया जा सकता है. चिप के आपरेशन के दौरान, YPD मध्यम फिर सुरक्षित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है.
- वें में सेल निलंबन के लगभग 1 मिलीलीटर लोडई सिरिंज और सिरिंज से सब हवा निकाल देते हैं.
- 0.5 μl / मिनट के लिए सिरिंज पंप के प्रवाह की दर कम होती है. लोडिंग के दौरान सिरिंज पंप (4.5 कदम में) द्वारा लागू की कम और निरंतर प्रवाह पक्ष चैनल (चित्रा -2) के माध्यम से गैर संलग्न कोशिकाओं को बाहर धक्का होगा.
- आउटलेट चैनल की ट्यूब सेल निलंबन युक्त सिरिंज कनेक्ट. धीरे सिरिंज के सवार पर दबाकर कोशिकाओं लोड. में आ रहा है और आंख के माध्यम से micropads नीचे या कंप्यूटर स्क्रीन के माध्यम से निपटाने के कक्षों का निरीक्षण करें.
- पर्याप्त कोशिकाओं पैड के नीचे बसा तक सवार पर दबाव बनाए रखें. इष्टतम लोड पैड प्रति 1-3 कोशिकाओं है. कोशिकाओं को बेतरतीब ढंग से पैड के नीचे बसा है, यह कुछ पैड किसी भी अन्य कोशिकाओं और पैड पूरी तरह से कोशिकाओं से भर रहे हैं शामिल नहीं है कि बहुत आम है.
- सेल लोडिंग और आउटलेट चैनल की पतली ट्यूबिंग से इससे जुड़े मोटी ट्यूब के लिए इस्तेमाल सिरिंज डिस्कनेक्ट, ओर चर्चा फ्लशउच्च प्रवाह दर (10 μl / मिनट) में कुछ मिनट के लिए annel हवाई बुलबुले और / या अभी तक चिप (चित्रा 2 बी) से बाहर निकलने नहीं था कि कोशिकाओं को हटाने के लिए. कोशिकाओं पक्ष चैनल से नहीं हटा रहे हैं, वे साइड चैनल में बढ़ने लगते हैं और बाद में प्रयोग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
- वापस नीचे 0.5 μl / मिनट के लिए सिरिंज पंप के प्रवाह रखो और अपने अंत (चित्रा 2 डी) में एक कैथेटर प्लग युक्त एक मोटी ट्यूब (सी ए 5 सेमी लंबे) को जोड़ने से कंधा मिलाकर चैनल बंद.
- 1-5 μl / मिनट की एक अंतिम प्रवाह दर को प्रवाह बढ़ाएँ. प्रवाह दर को मध्यम और खमीर तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
- प्रयोग का उद्देश्य के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स के साथ एक फिल्म शुरू करें. खुर्दबीन मंच की गति तेल अनुसरण कर सकते हैं कि इस तरह के एक कम गति के लिए सेट कर दिया जाता है सुनिश्चित करें. Replicative उम्र, छवि कोशिकाओं को हर 10 मिनट के निर्धारण के लिए. हलोजन द्वारा उत्सर्जित पराबैंगनी प्रकाश की मात्रा मिनट से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिएडीआईसी अधिग्रहण के दौरान प्रयोग किया जाता है, जो दीपक,, यह प्रकाश पथ में एक अतिरिक्त यूवी फिल्टर जगह की सलाह दी जाती है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, यह phototoxic प्रभाव से बचने के लिए (हर 20 मिनट जैसे) कम बार छवि कोशिकाओं को पसंद किया जाता है. प्रयोग प्रयोग के शुरू में लोड किए गए सभी कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों में 5 दिनों के लिए ले जाता है जो मर चुके हैं, जब पूरा हो गया है. यह नियमित रूप से प्रयोग के दौरान छवियों का फोकस जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो इसे समायोजित करने की सिफारिश की है.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को सीधे मध्य घातीय संस्कृति से microfluidic चिप में लोड कर रहे हैं. Microfluidic चिप में फंस कोशिकाओं की उम्र वितरण से पहले लोड करने के लिए संस्कृति के समान है कि क्या पता लगाने के लिए, कोशिकाओं कली निशान कल्पना करने के लिए FITC संयुग्मित गेहूं agglutinin (WGA-FITC) के साथ दाग रहे थे. चित्रा 3 में देखा जा सकता है, microfluidic चिप की micropads तहत कोशिकाओं का फंसाने का एक निश्चित उम्र की कोशिकाओं को पक्षपाती नहीं है.
Replicative उम्र बस एक माँ सेल द्वारा उत्पादित कर रहे हैं कि कलियों की संख्या की गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस डेटा उत्पादित कलियों की संख्या खिलाफ व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की साजिश रचने के एक जीवन की अवस्था में तब्दील हो जाता है. ऐसे Kaeberlein, एट अल. 9 द्वारा प्रदर्शन के रूप में उन सांख्यिकीय परीक्षण, विभिन्न प्रयोगों से जीवन काल डेटा की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 4 उम्र घटता का एक उदाहरण से पता चलता हैएक गुम्मट BY4741 खमीर तनाव और दो म्यूटेंट (Sir2 Δ, fob1 Δ) के लिए प्राप्त की.
YPD माध्यम पर बढ़ रहा है एक एकल गुम्मट BY4741 खमीर सेल की मूवी 1 समय चूक फिल्म. छवियाँ हर 10 मिनट ले जाया गया. यह मर जाता से पहले सेल 30 कलियों के कुल उत्पादन करता है. स्केल बार, 5 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Microfluidic विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि लगातार उच्च संकल्प इमेजिंग उपयोग करने की क्षमता है. कोशिकाओं की उम्र के रूप में, एक उम्र बढ़ने प्रयोग माइटोकांड्रिया. चित्रा 4 को निशाना बनाया है जो ILV3-GFP व्यक्त BY4742 खमीर कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था मितोचोन्द्रिअल आकारिकी में परिवर्तन की निगरानी के लिए अलग replicative उम्र में (कोशिकाओं के एक ही सेट के लिए mitochondrial आकारिकी का एक सिंहावलोकन देता है 0 कलियों, 10 कलियों और मौत से पहले). मध्य आयु वर्ग कक्षों में देखा आकारिकी परिवर्तन की रिपोर्ट में उन जैसे लगते हैं10 से पहले साहित्य. इस विशेष प्रतिनिधि प्रयोग में, मध्यम का प्रवाह दर इष्टतम नहीं था और बेटी कोशिकाओं 1 मूवी के विपरीत एक अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति के साथ बनाए रखा गया है, प्रयोग की गुणवत्ता अभी भी अपने से अधिक 49 व्यक्ति की कोशिकाओं में mitochondrial आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त था उम्र पूरी.
माइटोकॉन्ड्रिया कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो ILV3 GFP, व्यक्त एक भी BY4742 खमीर सेल के 2 फिल्म समय चूक फिल्म. छवियाँ हर 30 मिनट ले जाया गया. Brightfield के रूप में भी GFP छवियों दोनों पृष्ठभूमि ImageJ का उपयोग एक ही छवि में दो चैनलों के विलय से पहले सही थे. स्केल बार, 5 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
अंजीर1 ure. Microfluidic के सेटअप के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. PDMS micropad और गिलास को कवर के बीच ऊंचाई का अंतर एक खमीर सेल (3-4 माइक्रोन के बारे में) के व्यास के समान है. लोड हो रहा है: खमीर कोशिकाओं PDMS micropads तहत भरी हुई हैं. संवर्धन: ताजा मध्यम फंस कोशिकाओं (नीले तीर) पर लगातार बहती है. विच्छेदन: उभरते बेटी कोशिकाओं मध्यम (नारंगी तीर) के प्रवाह से दूर प्लावित कर रहे हैं.
चित्रा 2. Microfluidic चिप का चैनल डिजाइन की योजनाबद्ध चित्रण. ए. काले हलकों इनलेट, आउटलेट और साइड चैनल के अंत में छिद्रित छेद के स्थान का संकेत मिलता है. बी. इनलेट चैनल (10 μl / मिनट) और बड़ा पक्ष चैनल (नारंगी तीर) के माध्यम से बाहर निकल जाता है के माध्यम से मध्यम बहती है. आउटलेट चैनल के माध्यम से कोई प्रवाह क्योंकि टी के बीच प्रतिरोध अंतर का नहीं है,वह पक्ष और आउटलेट चैनल. सी. प्रकोष्ठों आउटलेट चैनल के माध्यम से चिप (काला तीर) में लोड कर रहे हैं. . तरफ चैनल के माध्यम से प्रवाह 0.5 μl / मिनट विकास के लिए कम है: पक्ष चैनल निस्तब्धता के बाद, साइड चैनल अवरुद्ध और मध्यम micropads (1-5 μl / मिनट) के नीचे फंस कोशिकाओं पर प्रवाह शुरू होता है.
चित्रा 3. चिप पर सेल लोड हो रहा है एक निश्चित सेल उम्र के प्रति पक्षपाती नहीं है. एक मध्य घातीय YSBN6 गुम्मट संस्कृति (10 7 कोशिकाओं / एमएल) के लिए WGA-FITC (10 6 कोशिकाओं प्रति 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 2 μl) के साथ चिह्नित किया गया 1.5 घंटे. कोशिकाओं तो एक गिलास स्लाइड पर डाल या microfluidic चिप में भरी हुई थी. जेड के ढेर एक 63X बढ़ाई पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर 470 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (15 Z-स्लाइस 0.8 पर माइक्रोन दूरी) बनाया गया. प्रत्येक पर कली निशान की संख्यासेल मैन्युअल गिना गया था. बड निशान संस्कृति में 75 कोशिकाओं और microfluidic चिप में 79 कोशिकाओं से निर्धारित किया गया है.
4 चित्रा. जीवन काल घटता के उदाहरण BY4741 डब्ल्यूटी (एन = 76), Sir2 Δ (एन = 63) और यहाँ वर्णित microfluidic डिवाइस का उपयोग कर fob1 Δ (एन = 58) के लिए प्राप्त की. दोनों विलोपन मापा पर एक मजबूत, अभी तक विपरीत असर नहीं खमीर कोशिकाओं की औसत replicative उम्र. प्रत्येक प्रयोग के लिए, उपभेदों स्थिर चरण के लिए YPD मध्यम में रातोंरात हो गई है और उसके बाद प्रयोग शुरू करने से पहले 3 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ताजा YPD मध्यम और ऊष्मायन में कमजोर पड़ने से घातीय वृद्धि फिर से शुरू करने की अनुमति दी गई. डाटा ली एट अल. 4 से प्राप्त हुई थी.
चित्रा 5. उम्र के एक समारोह के रूप में mitochondrial आकृति विज्ञान एक:. एक एकल कोशिका (सफेद तीर) में mitochondrial आकारिकी में उम्र जुड़े बदलाव का एक प्रतिनिधि उदाहरण. सभी छवियों हूबहू पहुंचा रहे हैं. स्केल बार, 5 माइक्रोन बी:. 10 कलियों (10) के बाद और पहले मौत (†) के लिए, अपनी पहली कली (0) का निर्माण करने से पहले 49 कोशिकाओं का एक सेट में मनाया Mitochondrial morphologies है. प्रत्येक आकृति विज्ञान वर्ग का एक उदाहरण छवि शामिल है. प्रस्तुत डाटा एक ही प्रयोग के दौरान प्राप्त हुई थी और कोशिकाओं के एक ही सेट हर समय बिंदु पर आकारिकी स्कोरिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. माइटोकॉन्ड्रिया मितोचोन्द्रिअल प्रोटीन ILV3 (GFP संग्रह डेटाबेस 15 से प्राप्त) के एक GFP टैग संस्करण व्यक्त BY4742 तनाव में देखे थे. Brightfield के रूप में भी GFP छवियों दोनों पृष्ठभूमि ImageJ का उपयोग एक ही छवि में दो चैनलों के विलय से पहले सही थे.
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Discussion
यहाँ वर्णित microfluidic विधि यह निरंतर उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संयोजन में खमीर replicative उम्र डेटा का सरल और स्वचालित पीढ़ी सक्षम बनाता अनुसंधान बुढ़ापे में एक महत्वपूर्ण उपन्यास उपकरण है. इन विशेषताओं शास्त्रीय विच्छेदन विधि का प्रयोगात्मक संभावनाओं पर प्रमुख सुधार कर रहे हैं, फिर भी ध्यान में रखा जाना करने की जरूरत है कि विधि की कुछ सीमाएं हैं.
एक micropad तहत रखा हर कोशिका (एक पड़ोसी सेल की नवोदित सेल जैसे इससे दूर धक्का सकता चिप से बाहर धोया जा करने के लिए एक निश्चित संभावना है: निर्धारित replicative उम्र मां कोशिकाओं की अवधारण की कार्यकुशलता से प्रभावित हो सकता है कि नोट micropad). एक सेल के एकीकृत संभावना बढ़ती उम्र के साथ बढ़ जाती है बाहर धोया जाएगा. इस प्रकार, यह अल्पकालिक कोशिकाओं लंबे समय रहते कोशिकाओं से दूर धोया जा रहा से पहले उनके जीवन चक्र पूरा कर लिया है कि अधिक होने की संभावना है. कि इसी तरह ली तथ्य इस क्षमता का मुद्दा अप्रासंगिक ही मामूली है, अगर नहीं इंगित करता है कि शास्त्रीय सूक्षम विधि 11-13 के रूप में fespan डेटा microfluidic सेटअप 4 के साथ उत्पन्न किया गया था.
यह microfluidic स्थापना के साथ यह शास्त्रीय विच्छेदन विधि के विपरीत, प्रयोग के शुरू में कुंवारी बेटी कक्षों का चयन करने के लिए संभव नहीं है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. फिर भी चिप में एक तेजी से बढ़ रही तरल संस्कृति से कोशिकाओं को लोड करते समय, लोड कोशिकाओं के बहुमत के नए पैदा कर रहे हैं या 14 (पहले एक बार और 27% के आसपास अंकुरित कभी नहीं कोशिकाओं यानी 54% के बारे में) अपेक्षाकृत युवा. इस जीवनकाल में सबसे अधिक 1 से 2 पीढ़ियों से कम करके आंका जाता है कि इसका मतलब है. सेल आबादी की उम्र संरचना काफी बदल दिया है कि असाधारण मामले में, यह ढाल centrifugation या धावन से पहले लोड करने के लिए कुंवारी बेटियों के लिए सेल आबादी, जैसे समृद्ध करने के लिए संभव है.
ntent "> microfluidic चिप सिद्धांत में विभिन्न संस्कृति मीडिया में अगुणित खमीर उपभेदों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, अलग खमीर उपभेदों और / या मीडिया माँ कोशिकाओं के कुशल प्रतिधारण की अनुमति देने के प्रवाह की दर के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. कोशिकाओं के आधार पर बनाए रखा जाता है के रूप में उनके आकार पर, यह ऐसे द्विगुणित खमीर कोशिकाओं के रूप में व्यास में 3-4 माइक्रोन, की तुलना में काफी बड़ा या छोटा है कि खमीर उपभेदों लोड करने के लिए संभव नहीं है. हालांकि विभिन्न photoresists साथ एक वेफर निर्माण करके, चिप्स microfluidic एक अलग अंतर के साथ उत्पन्न किया जा सकता है कवर कांच और micropads के बीच इन अलग आकार की कोशिकाओं की लोडिंग की अनुमति है.यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक चैनल के साथ एक चिप बनाने के लिए कैसे का वर्णन करता है, यह एक चिप में कई चैनलों को जोड़ने और एक साथ समानांतर प्रयोगों को चलाने के लिए संभव है. एक चिप में वांछित चैनलों की संख्या पर निर्भर करता है, यह चैनलों स्थान दिया गया है, जिसमें एक अनुकूलित वेफर बनाने के लिए आवश्यक हो सकता हैअधिक निकट एक साथ.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम मितोचोन्द्रिअल morphologies स्कोरिंग के लिए सेल लोड प्रोटोकॉल और मार्कस डे Goffau और Guille Zampar के पहले संस्करण लिखने के लिए लौरा Schippers धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
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- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
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- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
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- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
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- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
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