Summary
우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.
Abstract
우리는 단 하나 싹 트는 효모 세포가 자신의 전체 수명에 걸쳐 추적 할 수있는 간단한 미세 설정의 사용을 보여줍니다. 미세 유체 칩은 micropads의 배열을 사용하여 어머니와 딸 세포 사이의 크기 차이를 이용합니다. micropad 및 커버 유리 사이의 거리가 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷하기 때문에로드 할 때, 세포는, 이러한 micropads 아래에 갇혀있다. 로딩 과정을 거친 후, 배양액을 연속적으로 그들의 작은 크기로 인해 패드 아래에 유지되지 않습니다 새로운 딸 세포 밖으로 플러시 또한 전체 실험을하는 동안 상수 정의 환경을 만들어뿐만 아니라 칩을 통해 플러시되지만. 설정은 하나의 실험에서 50까지 각각의 세포가 더 필요한 경우 5 일 동안 완전 자동화 된 방식으로 모니터링하거나 할 수 있도록 효율적으로 어머니 세포를 유지합니다. 또한, 칩의 우수한 광학 특성은 높은 수전체 노화 과정에서 세포의 고해상도 영상.
Introduction
효모 신진은 연구 1 노화에 대한 중요한 모델 생물이다. 최근 효모 세포 노화 증식하는 공부를 할 때까지 각각의 봉오리를 수동으로 어머니 세포 2,3에서 제거하는, 해부 방법을 필요로하는 힘든 과정이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근 자신의 전체 수명 4를 통해 각각의 어머니 세포를 추적 할 새로운 마이크로 유체 설치를 발표했다.
우리의 마이크로 유체 칩, 효모 세포는 (그림 1 참조) 부드러운 탄성 중합체 기반 micropads 아래에 갇혀있다. 매체의 지속적인 흐름이 떨어져 새로 형성 딸 세포를 세척하고 신선한 영양소와 세포를 제공합니다. 한 실험에서 50까지 어머니 세포는 그들의 전체 증식하는 수명에 걸쳐 완전 자동화 된 방식으로 모니터링 할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 우수한 광학 특성으로 인해, 그것은 동시에 효모 세포 생물학의 다양한 측면 (예를 들어 모니터링 할 수 있습니다
고전적인 절개 방법에 비해 미세 설정은 상당한 이점을 제공합니다. 그것은 전체 노화 실험 기간 동안 정의 및 지속적인 환경을 보장합니다. 그것은 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 자동 초점과 시간 경과 능력을 가지고뿐만 아니라 온도 제어 세포 재배되어 어떤 현미경에서 실행할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 생산 작업은 몇 일 이내에 배울 수 있습니다. 또한, 세포는 주로 기하 급수적으로 증가 문화, 어머니 세포의 biotinylation을 필요로하는 다른 최근 발표 된 미세 방법 5에 비해 이점에서로드 할 수 있습니다.은 여기에 설명 된 방법은 점진적인 변화를 측정하는 데 사용할 수있는 고해상도 이미지와 결합 세포 형태에서, 효모 동안 단백질 발현 및 현지화은 전례없는 방식으로 노화. 의 기능단일 세포의 장기 모니터링은 또한 효모 세포주기 연구에 대한 독특한 가능성을 제공합니다.
이 방법은 최근에이 원고 검토에있는 동안 출판 된 프로토콜 16에서 biotinylation을 제거하는 최적화되었습니다.
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Protocol
1. 실리콘 웨이퍼 금형의 생산 및 준비
마이크로 유체 칩은 소프트 리소그래피에 의해 생성 된 실리콘 웨이퍼 형에서 만들어집니다. 이 웨이퍼는 마이크로 유체 칩을 생산하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그것은 각각의 웨이퍼 생산 미세 유체 6 전문 그룹에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
웨이퍼 네거티브 포토 레지스트의 두 가지 층, SU-8 7을 사용하여 두 단계의 포토 리소그래피 공정에서 이루어집니다. 채널이 상위 계층 (, 높이 10 μm의 SU-8 2010)로 만들어진 반면,, 바닥 층은 세포 트래핑 지역 (높이 3 ~ 4 μm의 SU-8 2002)를 생성하는 데 사용됩니다. 웨이퍼 생산 공정의 인상 황 등 8에서 찾을 수 있습니다. 미세 유체 칩의 그림은 각각의 웨이퍼를 구하는 방법에 대한 저자뿐만 아니라 조언을 얻을 수 있습니다.
- 웨이퍼가 얻어지면, 터프 태그 INT의 한 조각을 잘라메스 입구 채널과 micropad 배열 (그림 2A) 사이의 채널 구조의 상단에 약간 웨이퍼 신중하게 장소 3mm로 약 0.5 mm의 O 얇은 스트립. 이것은 세포로드하는 동안 사용하지 않을 각 칩에 큰 추가 채널의 형성을 초래할 있지만, microfluidic 장치의 안정적인 작동을 위해 중요하다 할 것이다.
- 알루미늄 호일의 이중 레이어로 유리 페트리 접시를 커버하고 페트리 접시에 웨이퍼를 넣어. 알루미늄 호일은 웨이퍼와 페트리 접시 사이에서 실행 PDMS를 방지 할 수 있습니다. PDMS는 웨이퍼와 유리 페트리 접시 사이에 크리프 않는 경우, 웨이퍼는 페트리 접시에 영구적으로 고정 될 것입니다. 웨이퍼는 여전히 쓸모 있지만 그것은 휴식과 PDMS 나중에 잘라해야 할 경우, 그것은 유리 페트리 접시를 대체 할 수 없습니다.
2. 미세 유체 칩의 제조
- 빈 플라스틱을 배치균형과 용기 균형 컵. 플라스틱 컵 (12 cm 직경의 유리 페트리 접시 용)에 40g PDMS 기반을 붓는다. 4 ML 약 1:10의 IE AW / W 비율 일회용 피펫 PDMS 경화제를 추가합니다.
- 몇 분 동안 충분히 PDMS와 경화제를 혼합한다. 이 경화제를 피펫하는 데 사용 된 일회용 플라스틱 피펫을 수행 할 수 있습니다. 그것은 혼합이 잘 웨이퍼의 상단에 쏟아져하기 전에 혼합하는 것이 중요합니다. 별로 혼합은 중합하지 PDMS의 일부 원인이됩니다.
- 유리 페트리 접시에 웨이퍼 위에 PDMS를 부어.
- 경화 에이전트와 PDMS의 혼합은 PDMS 혼합물에서 거품 형성으로 이어질 것입니다. 이 거품은 PDMS는 중합하기 전에 제거해야합니다. PDMS는 진공 펌프에 연결된 건조기에 페트리 접시를 배치하여 웨이퍼의 상단에 붓는 한 후 탈기 할 수 있습니다. 이 설정으로, 그것은 혼합물에서 모든 거품을 제거하기 위해 약 30 분 소요됩니다.
- 일을 중합다른 시간 동안 65 ° C에서 다음 1 시간에 대해 120 ° C에서 핫 플레이트의 상단에 웨이퍼 페트리 접시를 배치하여 전자 PDMS.
- 유리 페트리 접시에서 웨이퍼와 중합 PDMS와 함께 알루미늄 호일을 제거합니다. 알루미늄 호일 및 웨이퍼의 후면에서 중합 된 PDMS의 얇은 잔존 층을 벗겨. 웨이퍼 위에 PDMS의 레이어는 조심스럽게 들어 올려서 웨이퍼로부터 분리 할 수 있습니다.
- 벤치에 거꾸로 (위로 향하게 채널) PDMS 층을 놓고 메스 조심스럽게 PDMS에 각인 단일 칩 디자인을 잘라. 나중에 커버 유리에 칩 부착을 향상시키기 위해 채널의 가장자리 주위 PDMS의 약 3 mm의 유지하려고합니다.
- 직선 방식으로 PDMS를 통해 20 게이지 루어 스텁 모든 방법을 밀어 입구, 출구 및 측면 채널 (그림 2A)의 끝에서 PDMS의 펀치 구멍.
확인 PDMS 칩구멍을 뚫는 동안 계속 벤치에 거꾸로 누워있다. 이 채널의 막힘을 일으킬 수있는 채널의 안쪽에 붙는 PDMS를 방지 할 수 있습니다.
- 각각의 구멍을 펀칭 한 후, 다시 스텁을 잡아 당겨 전에 핀셋 루어 스텁에서 PDMS의 열을 제거합니다. PDMS 열 그렇지 않으면 뒤에 남아서 그냥 펀치 구멍을 차단할 수 있습니다.
- 거기에 스카치 테이프를 배치하고 즉시 다시 테이프를 제거하여 먼지 입자와 잔류 PDMS에서 칩의 표면을 청소합니다. 마찬가지로 칩이 장착 될 수있는 커버 유리를 청소하십시오.
- 벤치 탑 UV-오존 클리너 UV 램프 아래의 청소 칩과 커버 유리를 놓습니다. 함께 결합해야 할 측면은 램프에 직면해야합니다.
- PDMS를 노출하고 6-8 분 동안 UV 빛 유리를 커버하고 직접 그 후 서로의 상단에 노출 된 표면을 배치하여 커버 유리에 칩을 넣어.
- 부드럽게 칩의 가장자리에 살짝커버 유리에 PDMS의 부착을 촉진하고 공기 방울을 제거 할 수 있습니다. 이 micropads이뿐만 아니라 커버 유리에 집착하는 원인이 될 수 있으므로 채널 구조의 상단에 탭하지 마십시오.
- 60 분 동안 100 ° C에서 뜨거운 접시에 새로 만들어진 미세 설정을 놓습니다. 약간 PDMS 칩의 가장자리를 들어 올려 노력에 의해 커버 유리와 PDMS 칩 사이의 결합의 강도를 테스트합니다. PDMS 블록은 유리 표면에서 채취 할 수없는 경우, 결합은 성공하고 칩 사용할 수 있습니다.
3. 셀 로딩을위한 칩을 준비
microfluidic 장치의 고장 가능성 현미경으로 매체의 누출을 일으킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 금속 홀더 및 /를 사용하거나 PDMS 매니큐어 에폭시 접착제로 유리를 충족 칩의 측면을 밀봉하기 위하여 자문이다. 이 PDMS 칩은 커버 유리에 충분히 접착되지 않은 경우 매체의 누설을 방지합니다. 또한 튜브연결 매체의 누설을 방지하기 위해 비슷한 방법으로 삽입 지점 주위에 고정 할 수 있습니다. 누설의 경우에는 주사기 펌프를 꺼 집에서 만든 물 센서는 별도의 안전 조치로 사용할 수 있습니다. 특히 미세 유체 칩 설계 금속 홀더의 그림은 저자에서 얻을 수 있습니다.
- 칩의 유리 방수 씰을 만들 수있는 홀더의 금속 부분 사이에 실리콘 젤, 금속 홀더에 마이크로 유체 칩을 놓습니다. 유리를 깰하지 부드럽게 너트를 고정합니다.
- 얇은 튜브 (ca. 5~15센티미터 긴) 측 채널 칩의 출구 채널에 연결합니다. 족집게의 사용은 쉽게 구멍을 뚫은 구멍에 튜브를 삽입 할 수 있습니다.
- 배지에 50 ML 루어 하이록 주사기를 채우기 주사기에서 공기를 제거하고 주사기 필터, 20 게이지 루어 스텁, 짧은 두꺼운 튜브 (ca. 2cm 길이) 및 얇은 관을 순차적으로 연결합니다. 있는지 확인 얇은 욕조E는 주사기 펌프 및 현미경 스테이지 사이의 거리를 확장 할 충분한 시간이다.
- 빨리 감기 얇은 관까지 펌프가 완전히 배지로 가득합니다, 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다.
- 칩의 입구 채널로 주사기에 연결된 얇은 관을 누르고 10 μL / 분 (그림 2B)에서 칩을 통해 매체의 흐름을 보자. 칩 (페트리 접시에 예) 남겨 매체를 수집합니다. 매체 때문에 터프 태그가 큰 쪽 채널 및 출구 채널을 만든 사이의 저항 차이의 측면 채널을 통해 밖으로 실행됩니다.
- 현미경 단계에 칩을 넣고 패드에 현미경의 초점을 설정합니다.
기름이 실험의 시간 과정을 통해 건조하지 않기 때문에 기름 침지 목적의 사용은 침수 목표의 선호된다.
현미경에 따라 F를 유지에 문제가있을 수 있습니다실험의 초기 시간 동안 ocus. 그것은 세포를로드하고 실험을 시작하기 전에 정착 할 수 있도록 현미경 스테이지에서 하나에 두 시간 동안 칩을두고하는 것이 좋습니다.
4. 미세 유체 칩에 효모 세포의로드
- 20 게이지 루어 스텁과 두꺼운 튜브 (ca. 3cm)에 5 ML 루어 팁 주사기를 연결합니다.
- 칩에로드 할 세포 배양의 샘플을 채취.
로딩 선호 세포 수는 ML 당 1-5 X 10 6 세포 사이입니다. 높은 세포 수와 문화 적재하기 전에 희석해야합니다. 세포가 처음으로 세척 및로드하기 전에 유사한 포도당 비율을 포함하는 최소 배지에 현탁 된 경우 YPD에 배양 세포는 세포 적재 효율은 많은 배 향상 할 수있는 경우. 칩의 동작 중에, YPD 배지를 다시 안전하게 사용할 수 있습니다.
- 일에 세포 현탁액의 약 1 mL를로드전자 주사기와 주사기에서 모든 공기를 제거합니다.
- 0.5 μL / 분에 주사기 펌프의 유량을 감소시킨다. 로딩 중 주사기 펌프 (단계 4.5)에 의해 적용 낮고 지속적인 흐름 측면 채널 (그림 2C)를 통해 비 부착 세포를 밀어 것입니다.
- 출구 채널의 튜브에 세포 현탁액을 포함하는 주사기를 연결합니다. 조심스럽게 주사기의 플런저를 눌러 셀을로드합니다. 들어오고 눈을 통해 micropads 아래 나 컴퓨터 화면을 통해 침전 세포를 관찰합니다.
- 충분한 세포 패드 아래에 정착 될 때까지 플런저에 압력을 유지한다. 최적의 부하 패드 당 1-3 세포이다. 세포가 무작위 패드 아래에 정착, 그것은 몇 패드는 모든 세포와 다른 패드가 완전히 세포로 채워 포함하지 않는 것이 매우 일반적입니다.
- 셀 로딩 및 출구 채널의 얇은 튜브에서 연결된 두꺼운 튜브에 사용되는 주사기를 분리 측 채널을 플러시높은 유량 (10 μL / 분)에서 몇 분에 대한 annel 기포 및 / 또는 아직 칩 (그림 2B)를 종료하지 않은 세포를 제거합니다. 세포는 옆 채널에서 제거되지 않을 경우, 그들은 측 채널에 성장을 시작하고 나중에 실험을 방해 할 수 있습니다.
- 다시 아래 0.5 μL / 분에 주사기 펌프의 흐름을 넣고 그 끝 (그림 2D)에서 카테터 플러그인을 포함하는 두꺼운 튜브 (ca. 5cm 길이)에 연결하여 사이드 채널을 닫습니다.
- 1-5 μL / min의 최종 유속 흐름을 증가. 유량은 중간과 효모 균주에 따라 달라질 수 있습니다.
- 실험의 목표에 적합한 현미경과 카메라 설정에 동영상을 시작합니다. 현미경 스테이지의 속도는 오일이 따를 수있는 그런 낮은 속도로 설정되어 있는지 확인합니다. 증식하는 수명, 이미지 세포를 10 분 간격으로 측정합니다. 할로겐에 의해 방출 된 UV 빛의 미세한로부터 세포를 보호하려면DIC 수집하는 동안 사용되는 램프, 그것은 빛의 경로에 추가 UV 필터를 배치하는 것이 좋습니다. 형광 현미경을 사용하는 경우, 그것은 광독성 효과를 방지하기 위해 (매 20 분 등) 자주 이미지 셀을하는 것이 바람직하다. 실험은 실험 시작시에로드 된 모든 세포가 정상적인 조건 아래에서 일이 소요되는 죽은 때 완료됩니다. 그것은 정기적으로 실험하는 동안 이미지의 초점을 검사하고 필요한 경우이를 조정하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서는, 세포는 주로 중간 지수 문화 미세 유체 칩에로드됩니다. 미세 유체 칩에 갇혀 세포의 연령 분포가로드되기 전에 문화의 그것과 유사 여부를 확인하기 위해, 세포 봉오리 상처를 시각화하는 FITC에 복합 밀 agglutinin을 (WGA-FITC)로 염색 하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 미세 유체 칩의 micropads에 따라 세포의 함정 수사는 특정 연령의 세포에 편향되지 않습니다.
증식하는 수명은 단순히 하나의 어머니 세포에 의해 생산되는 싹의 수를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 이 데이터는 생성 꽃 봉오리의 수에 대한 가능한 세포의 비율을 플로팅하여 수명 곡선으로 변환됩니다. 같은 Kaeberlein, 외. 9에 의해 수행 된 것과 통계적 테스트는 서로 다른 실험에서 수명 데이터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4는 수명 곡선의 예를 보여줍니다WT BY4741 효모 균주와 두 개의 돌연변이 (SIR2 Δ, fob1 Δ)를 취득.
YPD 배지에서 성장 하나 WT BY4741 효모 세포의 동영상이 1 시간 경과 영화. 이미지는 매 10 분을 촬영했다. 그것은 죽기 전에 셀은 30 싹이 총을 생산하고 있습니다. 스케일 바, 10 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
미세 방법의 중요한 장점은 연속적인 고해상도 이미지를 사용하는 능력입니다. 세포 나이, 노화 실험은 미토콘드리아. 그림 4를 대상으로 ILV3-GFP를 표현 BY4742 효모 세포로 수행 된 미토콘드리아 형태 변화를 모니터링하려면 다른 증식하는 나이 (에서 세포의 동일한 세트에 대해 미토콘드리아 형태의 개요를 제공합니다 0 싹 10 싹과 죽음 이전). 중년 세포에서 볼 수있는 형태 변경에보고 된 유사10 전 문학. 이 특정 대표적인 실험에서, 매체의 유량이 최적이 아니었다와 딸 세포가 영화 1 대조적으로 비교적 높은 빈도로 유지 되었으나, 실험의 품질은 여전히 이상 49 개인 세포에서 미토콘드리아 형태를 분석하기에 충분했다 수명 전체.
미토콘드리아를 시각화하는 데 사용됩니다 ILV3-GFP를 표현하는 하나의 BY4742 효모 세포의 영화를 2 시간 경과 영화. 이미지는 매 30 분을 촬영했다. 브라이트뿐만 아니라 GFP 이미지 모두 배경 ImageJ에를 사용하여 하나의 이미지로 두 개의 채널을 병합하기 전에 수정 하였다. 스케일 바, 10 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
무화과우레 1. 미세 설정의 도식 개요. PDMS micropad 및 커버 유리 사이의 높이 차이는 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷합니다. 선적 : 효모 세포는 PDMS micropads에서로드됩니다. 배양 : 신선한 매체 갇혀 세포 (파란색 화살표)을 통해 지속적으로 흐른다. 해부 : 신흥 딸 세포가 배지 (주황색 화살표)의 흐름에 의해 멀리 플러시됩니다.
그림 2. 미세 유체 칩의 채널 설계 회로도 그림.. 검은 원은 입구, 출구 및 측면 채널의 끝에 펀치 구멍의 위치를 나타냅니다. B는. 유입 채널 (10 μL / 분)와 큰 쪽 채널 (주황색 화살표)를 통해 출구를 통해 중간 흐른다. 출구 채널을 통해 어떤 흐름이 있기 때문에 t 사이의 저항 차이도 없다그는 측면과 출구 채널입니다. C. 세포는 출구 채널을 통해 칩 (검은 색 화살표)로로드됩니다. . 측 채널을 통해 흐름은 0.5 μL / 분 D로 감소됩니다 측 채널을 세척 한 후, 사이드 채널이 차단 된 매체는 micropads (1-5 μL / 분) 아래에 갇혀있는 세포를 통해 흐름을 시작합니다.
그림 3. 칩에 셀 로딩은 특정 세포 연령 편중되지 않습니다. 중간 지수 YSBN6 WT의 문화 (10 7 세포 / ML)에 대한 WGA-FITC (10 6 세포 당 5 밀리그램 / ML 주식 솔루션의 2 μL)으로 표시 하였다 1.5 시간. 세포는 다음 유리 슬라이드에 넣어 또는 미세 유체 칩에로드 된. Z 스택은 63X 배율 물 침지 목표를 사용하여 470 ㎚의 여기 파장 (15 Z-조각 0.8 μm의 거리)를 만들었다. 각 꽃 봉오리 흉터의 수셀은 수동으로 계산되었다. 버드 흉터는 문화의 75 세포와 미세 유체 칩 79 세포에서 결정되었다.
그림 4. 수명 곡선의 예는 BY4741 WT (N = 76), SIR2 Δ (N = 63)과 여기에 설명 된 미세 유체 장치를 사용하여 fob1 Δ (N = 58)를 취득. 모두 삭제가 측정에 강한, 그러나 반대의 효과가 효모 세포의 평균 증식하는 수명. 각 실험, 균주는 고정 단계로 YPD 배지에서 하룻밤 성장하고 실험을 시작하기 전에 3 시간 동안 30 ° C에서 신선한 YPD 배지 및 배양에 희석하여 기하 급수적 인 성장을 재개 할 수 있었다. 데이터는 Lee 등 4.로부터 얻은 것입니다.
그림 5. 연령의 함수로 미토콘드리아 형태 :. 단일 세포 (흰색 화살표)의 미토콘드리아 형태의 연령 관련 변화의 대표적인 예. 모든 이미지는 동일하게 조정됩니다. 스케일 바, 10 μm의 B : 10. 꽃 봉오리 (10) 후 이전에 사망 (†)로, 처음으로 꽃 봉오리 (0) 제작하기 전에 49 세포의 집합에서 관찰 미토콘드리아 형태학. 각각의 형태 클래스의 예제 이미지가 포함되어 있습니다. 제시된 데이터는 하나의 실험 기간 동안 얻은 세포의 동일한 세트가 각 시점에서 형태를 기록 하였다. 미토콘드리아는 미토콘드리아 단백질 ILV3 (GFP 컬렉션 데이터베이스 15에서 얻은)의 GFP - 태그 버전을 표현하는 BY4742 변형으로 시각화했다. 브라이트뿐만 아니라 GFP 이미지 모두 배경 ImageJ에를 사용하여 하나의 이미지로 두 개의 채널을 병합하기 전에 수정 하였다.
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Discussion
여기에 설명 된 미세 메서드는 지속적으로 높은 해상도 이미지와 함께 효모 증식하는 수명 데이터를 간단하고 자동 생성을 가능으로 노화 연구에 중요한 새로운 도구입니다. 이러한 특성은 고전적인 절개 방법의 실험 가능성에 큰 개선이다, 그러나 고려해야하는 방법의 몇 가지 제한이 있습니다.
micropad에서 보관 모든 셀 (이웃 세포의 신진 셀 예를 들어 그것을 멀리 밀어 수있는 칩에서 밖으로 세척 할 특정 확률이있다 : 결정 증식하는 수명이 어머니 세포의 유지의 효율성에 의해 영향을받을 수있는 주 micropad). 셀의 통합 가능성은 증가 수명과 증가 씻어 수 있습니다. 따라서, 수명이 짧은 세포는 수명이 긴 전지보다 멀리 세척하기 전에 자신의 라이프 사이클을 완료 가능성이 높습니다. 그와 비슷한 리튬 사실 이러한 잠재적 인 문제가없는 경미한이고, 그렇지 않으면 나타냅니다 클래식 microdissection을 방법 11-13에서와 같이 fespan 데이터는 미세 설정을 4로 생성되었습니다.
그것은 마이크로 유체 설치를 그것은 고전적인 절개 방법과는 대조적으로 실험의 시작 부분에 처녀 딸 셀을 선택할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그럼에도 불구하고 칩에 기하 급수적으로 증가하고 액체 배양에서 세포를로드 할 때,로드 된 세포의 대부분은 새로 태어난되거나 14 (번 이전과 27 %의 주위에 싹 결코 세포 즉 약 54 %) 상대적으로 젊은. 이 수명은 최대 1 ~ 2 세대 과소 평가하는 것을 의미한다. 세포 인구의 연령 구조가 크게 변경되는 예외적 인 경우는, 그라데이션 원심 분리 또는 elutriation가로드되기 전에 처녀 딸에 대한 세포 인구, 예를 풍부하게 할 수 있습니다.
ntent "> 마이크로 유체 칩은 원칙적으로 다른 문화 미디어 반수체 효모를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 효모 및 / 또는 미디어 어머니 세포를 효율적으로 보존 할 수 있도록 유량의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 세포를 기반으로 유지되기 때문에 그들의 크기에, 그것은 같은 배수체 효모 세포로 직경 3-4 μm의,보다 훨씬 크거나 작은 효모를로드 할 수 없습니다. 그러나 다른 포토 레지스트와 웨이퍼를 생산하여, 미세 유체 칩이 다른 간격으로 생성 할 수 커버 유리와 micropads 사이의 이러한 다른 크기의 세포로로드 할 수 있습니다.여기에 제시 프로토콜은 단일 채널 칩을 만드는 방법을 설명하지만, 그것은 하나의 칩에 여러 채널을 추가하고 동시에 병렬 실험을 실행할 수 있습니다. 단일 칩에서 원하는 채널의 수에 따라, 채널 간격이있는 적응 웨이퍼를 작성해야 할 수도 있습니다더 긴밀하게.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 미토콘드리아 형태학을 기록 세포 로딩 프로토콜과 마커스 드 Goffau 및 인 Guille Zampar의 첫 번째 버전을 작성하기위한 로라 Schippers에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
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