Summary
Vi beskriver her driften av en microfluidic enhet som tillater kontinuerlig og høy oppløsning mikroskopisk avbildning av single spirende gjærceller under deres komplette replicative og / eller kronologisk levetid.
Abstract
Vi demonstrerer bruken av en enkel mikrofluidteknisk oppsett, hvor enkelt-spirende gjærceller kan spores gjennom hele sin levetid. Microfluidic chip utnytter størrelsen forskjellen mellom mor og datter celler ved hjelp av en rekke micropads. Ved lasting blir celler fanget under disse micropads, fordi avstanden mellom micropad og dekkglass er lik diameteren av en gjær-celle (3-4 um). Etter lastingen prosedyren, er dyrkningsmedium kontinuerlig spylt gjennom brikken, noe som ikke bare skaper en konstant og definert miljø gjennom hele forsøket, men også spyler ut de fremvoksende datterceller som ikke beholdes under elektrodene på grunn av deres mindre størrelse. Oppsettet beholder mor celler så effektivt at det i et enkelt eksperiment opp til 50 individuelle celler kan overvåkes på en helautomatisk måte i 5 dager, eller, om nødvendig, lengre. I tillegg er de utmerkede optiske egenskaper brikken tillater høy-Oppløsning avbildning av celler under hele aldringsprosessen.
Introduction
Spirende gjær er en viktig modell organisme for aldring forskning en. Inntil nylig studere replikative aldring i gjærceller var en arbeidskrevende prosess som krever en disseksjon metoden, hvor hver knopp ble manuelt fjernet fra morcellen 2,3. For å løse dette problemet, vi nylig presentert en ny microfluidic oppsett i stand til å spore individuelle mor celler gjennom hele sin levetid fire.
I vår microfluidic chip, er gjærceller fanget under myke elastomer-baserte micropads (se figur 1). En kontinuerlig strøm av medium vasker bort nydannede datterceller og gir cellene med friske næringsstoffer. I et enkelt eksperiment, kan opptil 50 mor celler bli overvåket på en helautomatisk måte gjennom hele replicative levetid. På grunn av de gode optiske egenskaper mikrofluidteknisk brikke, er det mulig å samtidig overvåke forskjellige aspekter av gjær cellebiologi (f.eks
Sammenlignet med den klassiske disseksjon metoden gir microfluidic oppsett betydelige fordeler. Det sikrer et definert og konstant miljø under hele aldring eksperimentet. Det krever ingen dyre spesialisert utstyr og kan kjøres på alle mikroskop utstyrt med automatisk fokus og time-lapse evner samt temperatur-kontroll for celle dyrking. Produksjon og drift av microfluidic chips kan læres i løpet av få dager. I tillegg kan cellene være direkte lastet fra en eksponensielt voksende kultur, en fordel fremfor en annen nylig publisert metode mikrofluidteknisk 5, som krever biotinylering av mor-celler. Kombinert med en høy oppløsning avbildning, den her beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å måle gradvise endringer i mobilnettet morfologi, protein uttrykk og lokalisering under gjær aldring på en enestående måte. Muligheten forlangsiktig overvåking av enkeltceller gir også unike muligheter for gjær cellesyklus studier.
en Denne metoden har nylig blitt optimalisert for å fjerne biotinylering fra 16-protokollen, som ble publisert mens dette manuskriptet var i gjennomgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Produksjon og klargjøring av en Silicon Wafer Mold
Microfluidic chips er laget av en silisium wafer mold produsert av myk litografi. Disse wafere kan brukes om igjen mange ganger for å produsere microfluidic chips. Det er tilrådelig at produksjonen av en respektiv skive er utført av en gruppe spesialisert på MicroFluidics 6..
Skiven er laget i en to-trinns prosess ved hjelp av fotolitografi to forskjellige lag av negativ fotoresist, SU-8 7. Det nederste laget blir brukt til å generere celle fangst-området (SU-8 2002, høyde 3-4 mikrometer), mens kanalene er laget med det øverste laget (SU-8 2010, høyde 10 mm). Et inntrykk av skiven produksjonsprosessen kan bli funnet i Huang et al 8.. Tegninger av microfluidic chips kan fås fra forfatterne samt råd om hvordan du får en respektive wafer.
- Når wafer er oppnådd, kuttet ett stykke Tough-Tag into tynne strimler av omtrent 0,5 mm til 3 mm med en skalpell og plassere dem forsiktig på silikonskiven litt på toppen av kanalstrukturen mellom innløpskanaler og den micropad array (figur 2A). Dette vil resultere i dannelse av en stor ekstra kanal i hver brikke, som ikke bare vil bli brukt under lasting celle, men er også viktig for stabil drift av mikrofluidteknisk enheten.
- Dekk glass petriskål med et dobbelt lag med aluminiumsfolie og legg den wafer i petriskål. Aluminiumsfolien vil hindre PDMS å kjøre i mellom wafer og petriskål. Hvis PDMS gjør krype inn mellom skiven og glasset Petriskål, vil skiven bli permanent fiksert i petriskålen. Selv om skiven er fortsatt brukbar, vil det ikke være mulig å erstatte glass petriskål hvis det bryter og PDMS må bli kuttet ut etterpå.
2. Produksjon av Microfluidic Chips
- Sett en tom plastkoppen på balanse og tare balansen. Hell 40 g PDMS basen inn i plast kopp (for en 12 cm diameter petriskål glass). Legg PDMS herder med en engangspipette i aw / w forholdet 1:10, dvs. ca 4 ml.
- Bland PDMS og herder grundig i flere minutter. Dette kan gjøres med den engangs plast pipette som ble brukt til å pipettere herdemidlet. Det er viktig at blandingen er godt blandet før fylling den på toppen av skiven. Dårlig blanding vil føre til en del av PDMS ikke å polymerisere.
- Hell PDMS på toppen av skiven på glasset petriskål.
- Blanding av PDMS med herderen vil føre til dannelse av bobler i den PDMS blandingen. Disse boblene må fjernes før PDMS polymerizes. PDMS kan avgasses etter å helle den på toppen av skiven ved å plassere petriskål i en eksikator koblet til en vakuumpumpe. Med dette oppsettet, tar det ca 30 min for å fjerne alle boblene fra blandingen.
- Polymerisere the PDMS ved å plassere petriskål med skiven på toppen av en varm plate ved 120 ° C i 1 time og deretter ved 65 ° C i enda en time.
- Ta av folien sammen med skiven og polymerisert PDMS fra glass petriskål. Trekk av aluminiumsfolien og den gjenværende tynne lag av polymerisert PDMS fra baksiden av skiven. Sjiktet av PDMS på toppen av skiven kan deretter bli separert fra wafer ved å løfte den opp forsiktig.
- Plasser PDMS laget opp ned (med kanaler vendt oppover) på benken og kutte ut de enkelte chip design trykt på PDMS forsiktig med en skalpell. Prøv å beholde omtrent 3 mm av PDMS rundt kantene av kanalene for å forbedre feste av brikken til den dekkglass senere.
- Hulle PDMS ved endene av innløps-, utløps-og side-kanal (figur 2A) ved å trykke en 20 Gauge Luer stump hele veien gjennom PDMS i en rett måte.
Kontroller at PDMS chiper fortsatt ligge opp ned på benken mens punching hullene. Dette hindrer PDMS fester seg til innsiden av kanalen, noe som kan føre til blokkering av kanalen.
- Etter punching hvert hull, fjerne kolonnen av PDMS i Luer kupong med pinsett før du trekker spire ut igjen. PDMS kolonne ellers kunne bli igjen og blokkere bare slo hull.
- Rens overflatene av brikken fra støvpartikler og residual PDMS ved å plassere Scotch tape på den og straks å fjerne tapen igjen. Tilsvarende rengjøre dekkglass som brikken skal festes.
- Plasser renset chip og cover glass under UV lampe av Benkeplate UV-Ozone Cleaner. Sidene som må limes sammen må møte lampen.
- Eksponer PDMS og frontglasset til den UV-lys i 6-8 min og direkte etterpå sette brikke på dekkglass ved å plassere de eksponerte flater på toppen av hverandre.
- Banke forsiktig rundt sidene av chipfor å fremme festing av PDMS til dekkglass og for å fjerne luftbobler. Ikke trykk på toppen av kanalen struktur, da dette kan føre til at micropads å få festet til dekselet glass også.
- Plasser den nylig gjort mikrofluidteknisk oppsett på en varm plate ved 100 ° C i 60 min. Test styrken av binding mellom dekkglass og PDMS-brikken ved å løfte opp kantene av PDMS-brikken svakt. Når PDMS-blokk ikke kan løftes fra glassoverflaten, er liming vellykket og brikken er klar til bruk.
3. Klargjøre Chip for Cell Loading
Svikt i en microfluidic enhet kan potensielt føre til lekkasje av medium inn i mikroskopet. For å unngå dette, er det rådgivende å bruke et metall-holderen og / eller forsegle sidene av brikken hvor PDMS møter glasset med neglelakk eller epoksylim. Dette forhindrer lekkasje av medium i tilfelle PDMS brikken ikke er bundet godt nok til dekselet glass. Også slangenforbindelser kan sikres rundt incisjonen på en lignende måte for å unngå lekkasje av medium. En hjemme-laget vann sensor som slår av sprøyten pumpen i tilfelle lekkasje kan brukes som en ekstra sikkerhetsforanstaltning. Tegninger av metall holder spesielt utviklet for microfluidic chip kan fås fra forfatterne.
- Plasser mikrofluidteknisk chip i metallholderen, med silikongel mellom glasset av brikken og de metalldeler på holderen for å skape en vanntett forsegling. Skru mutrene forsiktig, for ikke å bryte glasset.
- Koble tynne rør (ca. 5-15 cm lang) til siden kanalen og utløpskanalen av brikken. Bruk av pinsett gjør det lettere å sette inn slangen i hullene.
- Fyll en 50 ml Luer-Lok sprøyte med kultur medium, fjerne luft fra sprøyten og koble den sekvensielt til en sprøyte filter, en 20 Gauge Luer spire, en kort tykk slange (ca. 2 cm lang) og en tynn slange. Sørg for at den tynne kare er lang nok til å spenne over avstanden mellom sprøytepumpe og mikroskopet stadium.
- Plasser sprøyten i sprøytepumpe, spole frem pumpen til den tynne slangen er helt fylt med medium.
- Skyv tynne rør festes til sprøyten inn i innløpskanalen av brikken og la mediet strømme gjennom brikken ved 10 mL / min (Figur 2B). Samle mediet forlater chip (for eksempel i en petriskål). Mediet vil kjøre ut via siden kanalen på grunn av motstand forskjellen mellom Tough-Tag gjort store side-kanalen og uttaket kanal.
- Plasser brikken i mikroskopet scenen og sette fokus av mikroskopet på pads.
Bruken av olje nedsenking mål er å foretrekke fremfor det av vann nedsenking mål fordi oljen ikke vil tørke ut over tid løpet av eksperimentet.
Avhengig av mikroskop kan det være problemer med å beholde focus løpet av de første timene av forsøket. Det er derfor tilrådelig å forlate chip i en til to timer i mikroskopet scenen slik at den kan slå seg ned før du legger celler og starter eksperimentet.
4. Lasting av gjærceller i Microfluidic Chip
- Koble en 5 ml sprøyte med Luer spiss til en 20 Gauge Luer stump og en tykk slange (ca. 3 cm).
- Ta en prøve av cellekultur som skal lastes inn i brikken.
Foretrukket celletall for lasting er mellom 1-5 x 10 6 celler per ml. Kulturer med høyere celletall må fortynnes før lasting. Når dyrking celler på YPD, kan cellen lasteeffektivitet bli forbedret mange ganger hvis cellene er først vasket med og resuspendert i minimal medium som inneholder en lignende glukose prosentandel før lasting. Under drift av brikken, kan YPD-medium igjen trygt brukes.
- Load omtrent 1 ml av cellesuspensjonen i the sprøyten og fjern all luft fra sprøyten.
- Reduser strømningshastigheten av sprøytepumpen til 0,5 mL / min. Den lave og fortsatt flyt håndheves av sprøytepumpe under lasting (i trinn 4.5) vil presse ikke-tilknyttede celler ut via siden kanalen (figur 2C).
- Koble sprøyten inneholdende cellesuspensjonen til røret av utløpsrennen. Laste cellene ved å trykke på stempelet på sprøyten forsiktig. Følg de cellene som kommer inn og bosatte seg under micropads via okulære eller via dataskjermen.
- Opprettholde trykket på stempelet inntil tilstrekkelige celler bosette under putene. Den optimale belastningen er 1-3 celler per blokk. Som celler bosette under putene tilfeldig, er det ganske vanlig at noen få pads ikke inneholder celler og andre pads er helt fylt med celler.
- Koble sprøyten brukes for celle lasting og tykk slange koblet til det fra den tynne slangen fra uttaket kanal, skylle side lmAnnel i et par minutter ved høyere strømningshastigheter (10 mL / min) for å fjerne luftbobler og / eller celler som ikke ennå gå ut av brikken (figur 2B). Dersom cellene ikke blir fjernet fra siden kanalen, kan de begynner å vokse i side-kanalen og forstyrre forsøket senere.
- Sett strømmen av sprøytepumpen tilbake ned til 0,5 mL / min og lukke sidekanal av ved å koble den til en tykk slange (ca. 5 cm lang) inneholdende et kateter plugg ved sin ende (figur 2D).
- Øke strømmen til en slutt-strømningshastighet på 1-5 mL / min. Flow prisene kan variere avhengig av medium og gjær belastning.
- Start en film med mikroskop og kamera innstillinger som passer til formålet med forsøket. Kontroller at hastigheten av mikroskopet stadium settes til en slik lav hastighet at oljen kan følge. For bestemmelse av replicative levetid, bildet celler hvert 10 min. For å beskytte cellene fra de ørsmå mengder UV lys slippes ut av halogenlampen, som brukes under DIC oppkjøpet, er det lurt å plassere en ekstra UV filter i lyset banen. Ved bruk av fluorescens-mikroskopi, er det foretrukket å avbilde cellene sjeldnere (for eksempel hver 20 min) for å unngå fototoksiske effekt. Eksperimentet er ferdig når alle celler lastet ved starten av eksperimentet er døde, som under normale betingelser tar opptil 5 dager. Det anbefales å regelmessig kontrollere fokuset på bildene under forsøket og om nødvendig justere den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen, er celler lastet inn i microfluidic chip direkte fra midten av eksponentiell kultur. Å fastslå om aldersfordelingen av celler fanget i microfluidic chip er lik som den kulturen før lasting, ble cellene farget med hvete agglutinin konjugert til FITC (WGA-FITC) for å visualisere knopp arr. Som kan sees i figur 3, er innlagring av celler under micropads av mikrofluidteknisk brikken ikke forspent til celler av en viss alder.
Replikative levetid kan ganske enkelt bestemmes ved å telle antallet av knopper som er produsert av en enkelt celle mor. Denne data blir omformet til en levetid ved å plotte prosent av levedyktige celler mot antall knopper produsert. Statistiske tester, slik som de utføres av Kaeberlein, et al. 9, kan brukes til å sammenligne levetid data fra forskjellige eksperimenter. Figur 4 viser et eksempel på kurver levetidanskaffes til en WT BY4741 gjærstamme og to mutanter (SIR2 Δ, fob1 Δ).
Movie en Time-lapse film fra en enkelt WT BY4741 gjær celle vokser på YPD medium. Bilder ble tatt hvert 10 min. Cellen produserer totalt 30 knopper før den dør. Scale bar, 5 mikrometer. Klikk her for å se film .
En viktig fordel ved den mikrofluidteknisk fremgangsmåte er evnen til å benytte kontinuerlig høy oppløsning avbildning. Å overvåke endringer i mitokondrie morfologi som celler alder, ble en aldrende eksperiment utført med BY4742 gjærceller uttrykker ILV3-GFP, som er ment til mitokondriene. Figur 4 gir en oversikt over mitokondrie morfologi for det samme settet av celler på forskjellige replicative aldre ( 0 knopper, 10 knopper og før døden). Morfologi endringer sett i mid-alderen celler ligner de som er rapportert ilitteratur før ti. Selv i dette spesielle eksperiment representative, strømningshastigheten for mediet var ikke optimal og datter-celler ble opprettholdt med en relativt høy frekvens i motsetning til en film, var kvaliteten av forsøket fremdeles tilstrekkelig til å analysere mitokondrielle morfologi i 49 individuelle celler over sine hele levetiden.
Movie 2 Time-lapse film fra en enkelt BY4742 gjær celle uttrykker ILV3-GFP, som brukes til å visualisere mitokondriene. Bilder ble tatt hvert 30 min. Både lysfelt samt GFP bildene ble bakgrunnen korrigeres før sammenslåing av de to kanalene til ett enkelt bilde ved hjelp ImageJ. Scale bar, 5 mikrometer. Klikk her for å se film .
Figure en. Skjematisk oversikt over mikrofluidteknisk oppsett. Høydeforskjellen mellom PDMS micropad og dekkglass er lik diameteren av en gjærcelle (omtrent 3-4 mikrometer). Loading: Gjærceller er lastet under PDMS micropads. Dyrking: Frisk medium strømmer kontinuerlig de fanget celler (blå pil). Dissection: Emerging datter celler blir spylt bort av strømmen av medium (oransje pil).
Figur 2. Skjematisk illustrasjon av kanalen utformingen av mikrofluidteknisk chip. A. Sorte sirkler indikerer plasseringen av de utstansede hullene i enden av innløps-, utløps-og side-kanalen. B. Medium strømmer gjennom innløpskanalen (10 mL / min) og slippes ut via større side-kanal (oransje pil). Det er ingen strømning gjennom utløpskanalen, på grunn av den motstand forskjellen mellom than side og utløp kanal. C. Celler blir lastet inn i brikken (sort pil) via utløpsrennen. Strømningen gjennom side-kanalen er redusert til 0,5 mL / min D:. Etter spyling er sidekanal er den siden kanalen er blokkert, og mediet begynner å strømme over cellene inni og under de micropads (1-5 mL / min).
Figur 3. Cell lasting på brikken ikke er forspent mot en bestemt celle alder. A mid-eksponentiell YSBN6 WT kultur (10 7 celler / ml) ble merket med WGA-FITC (2 ul av 5 mg / ml stamløsning pr 10 seks celler) for 1.5 hr. Cellene ble deretter satt på et glass lysbilde eller lastet inn i microfluidic chip. Z stabler ble gjort (15 z-skiver til 0,8 mikrometer avstand) ved en eksitasjonsbølgelengde på 470 nm ved hjelp av en 63X forstørrelse vannimmersjonsobjektiv. Antallet knopp arr på hvercellen ble talt manuelt. Bud arr ble bestemt fra 75 celler i kultur og 79 celler i microfluidic chip.
Figur 4. Eksempler på Levetiden kurvene oppnådd for BY4741 WT (n = 76), SIR2 Δ (n = 63) og fob1 Δ (n = 58) med den her beskrev mikrofluidteknisk enhet. Både slettinger har en sterk, men motsatt, virkning på den målte median replikative levetid i gjærcellene. For hvert eksperiment ble stammene dyrket over natten i YPD-medium til stasjonær fase, og deretter tillatt å gjenoppta eksponensiell vekst ved fortynning i frisk YPD-medium og inkubering ved 30 ° C i 3 timer før start av eksperimentet. Data er basert på Lee et al. 4..
Figur 5. Mitokondrienes morfologi som en funksjon av alder A:. Et representativt eksempel av alder-assosierte forandringer i mitokondriell morfologi i en enkelt celle (hvit pil). Alle bildene er skalert identisk. Scale bar, 5 mikrometer B:. Mitokondrielle morfologi observert i et sett med 49 celler før produsere deres første bud (0), etter 10 knopper (10) og før døden (†). Et eksempel bilde av hvert morfologi klasse er inkludert. De presenterte data ble oppnådd i løpet av et enkelt eksperiment og det samme sett av celler ble brukt for å utføre morfologi på hvert tidspunkt. Mitokondriene ble visualisert i en BY4742 stamme uttrykker et GFP-merket versjon av mitokondrie protein ILV3 (oppnådd fra GFP samling databasen 15). Både lysfelt samt GFP bildene ble bakgrunnen korrigeres før sammenslåing av de to kanalene til ett enkelt bilde ved hjelp ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluidic metoden som beskrives her er en viktig roman verktøy i aldring forskning som det muliggjør enkel og automatisk generering av gjær replicative levetid data i kombinasjon med kontinuerlig høy oppløsning. Disse egenskapene er viktige forbedringer over de eksperimentelle muligheter for den klassiske disseksjon metoden, men det er noen begrensninger i metode som må tas i betraktning.
Merk at fastsatt replicative levetid kan påvirkes av effektiviteten til oppbevaring av mor celler: Hver celle holdt under et micropad har en viss sannsynlighet for å bli vasket ut fra brikken (f.eks spirende celle av en nærliggende celle kunne skyve den vekk fra den micropad). Den integrerte sannsynlighet for en celle for å bli vasket ut med økende levetid. Dermed er det mer sannsynlig at kortvarige celler fullført sin livssyklus før de blir vasket bort enn langlivede celler. Det faktum at tilsvarende li fespan data ble generert med microfluidic oppsett fire som med den klassiske mikrodisseksjon metoden 11-13 indikerer at dette potensielle problemet er bare mindre, om ikke irrelevant.
Det er viktig å merke seg at med den mikrofluidteknisk oppsettet er det ikke mulig å velge jomfruelige datterceller ved starten av forsøket, i motsetning til den klassiske metode disseksjon. Men når du legger celler fra en eksponentielt voksende væske kultur i brikken, er de fleste av de lastede celler nylig født eller relativt ung (dvs. ca 54% av cellene aldri budded før og rundt 27% en gang) 14. Dette betyr at lifespans er undervurdert av 1-2 generasjoner på de fleste. I sjeldne tilfeller hvor alderssammensetningen av cellen befolkningen er vesentlig endret, er det mulig å berike cellen befolkningen for jomfruelige døtre før lasting, for eksempel ved gradient sentrifugering eller elutriation.
ntent "> The microfluidic chip kan i prinsippet brukes til å studere haploide gjær stammer i ulike kultur media. Men forskjellige gjær stammer og / eller media kan kreve noen optimalisering av strømningshastighet for å tillate effektiv oppbevaring av mor celler. Som cellene beholdes basert av deres størrelse, er det ikke mulig å laste gjærstammer som er betydelig større eller mindre enn 3-4 pm i diameter, for eksempel diploide gjærceller. Men ved å produsere en skive med forskjellige fotoresister, kunne microfluidic chips bli generert med en ulik avstand mellom dekkglass og micropads for å tillate lasting av disse forskjellig størrelse celler.Selv om den protokoll som presenteres her beskriver hvordan å lage en brikke med en eneste kanal, er det mulig å legge flere kanaler i en enkelt brikke og løpe parallelle eksperimenter samtidig. Avhengig av antall ønskede kanaler i en enkelt brikke, kan det være nødvendig å opprette et tilpasset skive i hvilken kanalene er adskilttettere sammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Laura Schippers for å skrive de første versjonene av cellen lasting protokollen og Marcus de Goffau og Guille Zampar for å utføre mitokondrielle morfologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E | |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
