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Neuroscience

局所トランスジェニックラットの発生により doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

遺伝子は、成体動物における行動や神経病のその後の研究のために、神経細胞の接続性における迅速かつターゲットの変更を可能にするために、E16での子宮内電気穿孔(IUE) ビア皮質またはラットの海馬の開発中に操作することができます。 IUE成功を制御するためのインビボイメージングにおける出生後の共トランスフェクトし、ルシフェラーゼの生物発光を活性化することによって行われる。

Abstract

子宮内電気穿孔(IUE) 神経発達を調査するため、脳内の細胞の遺伝子改変を可能にする技術である。これまでのところ、成体の脳での行動や神経病理を調査するためのIUEの使用は、出生後の動物での非侵襲的技術によるIUEトランスフェクションの成功を監視するには不十分な方法で制限されています。

本研究のために、E16ラットをIUEのために使用した。胚への核酸の室内注射した後、ピンセット電極の配置は、発展途上皮質や海馬のいずれかを標的とするための重要でした。

3D定量化ソフトウェアでIVISスペクトル装置を用いて、出生後のin vivo生物発光によって麻酔されたライブP7の仔におけるルシフェリンの腹腔内注射後のトランスフェクトされた細胞のルシフェラーゼ遺伝子許可監視の同時注入およびエレクトロポレーション心室。

DISC1遺伝子とIUEはアンフェタミン過敏症につながったことを示している。同時トランスフェクトGFPは生後≥6ヶ月で現在の遺伝子発現を示す凍結切片で死後 、蛍光顕微鏡によって神経細胞で検出することができた。

私たちは、出生後の生物発光イメージングは​​、ラットにおいてIUEと一過性トランスフェクションの成功を評価することができますことを結論付けている。 neurodevelopmen中の局所遺伝子操作の影響に関する調査成人の脳とその接続性Tが大幅に容易になる。多くの科学的な質問については、この技術は補完、あるいはトランスジェニックラットの使用を交換し、行動神経科学のための新規な技術を提供することができます。

Introduction

それが比較的容易に神経発達を研究する有効以来発達中の脳における遺伝子発現の調節を可能にする子宮内電気穿孔(IUE)方法の開発が、ブレークスルーとなっている。における標的遺伝子の発現レベルの1-7の変更げっ歯類における胚および/ ​​または周産期開発中に特定の脳領域が影響神経細胞増殖、遊走、樹枝状分岐、および接続性を批判的することが実証された。8月10日

統合失調症は神経発達異常を11に関連している急性および慢性症状を伴う複雑な精神疾患である12と統合失調症の同定された候補遺伝子のため、多くが中断·イン·統合失調症などのように、神経発達上の潜在的な調節効果を調べた-1(DISC1)遺伝子13〜15。

脳の発達はregulatです前、閉経および出生後発育期において役割を果たす遺伝的要因と環境との相互作用によって編様々な行動障害のための一つの主要な遺伝的危険因子は、マウス13、17にある移行欠陥にDISC1 16遺伝子。DISC1ノックダウンリードであり、IUEによって現像皮質におけるDISC1の発現操作は、成体マウス18の動作に影響を与えることが示されている。

IUEによる操作脳遺伝子発現は、トランスジェニック動物株の生成19に対していくつかの利点有する。まず、関心領域内の遺伝子発現は、ヶ月ではなく、トランスジェニックげっ歯類系統育種、数世代に数週間以内に達成される。第二に、生殖細胞工学動物20の表現型をシールドすることが初期の開発時に代償機構が回避される。特定の細胞集団または脳の特定の領域、migratiをターゲットを通じて、第三上または増殖の違いが直接非変異と比較して、または一方的なエレクトロポレーションが選択された場合、反対側を制御することができます。一方、IUEはプロモーター駆動CRE / LOX誘導発現のタイミングや特定の地域での細胞の唯一の亜集団の遺伝子発現パターンのモザイク種類につながるターゲットにしての精度を持っていません。

安定な、生殖細胞系列トランスジェニックげっ歯類の主な利点が無視できるように、成体げっ歯類における多くの実験用途のために、脳領域における細胞の限られた数の一過性トランスフェクションは、十分な、または所望であり得る。実際には、IUEは、いくつかの異常に開発された細胞が、細胞や回路のネットワーク全体に影響を与える可能性かどうかを調査することは有用である。もう一つの利点は、ヒットのモザイク性質による遺伝子の非細胞自律的な効果を発揮する機能があります。さらに、トランスジェニックおよびノックアウトラットの世代は、まだ初期段階にまだ使用中です異常な脳の発達への影響を研究するためのこの種ではIUE高い関心がある。

今のところ、成人としてこれらの動物における介入の影響を調査するためIUEを使用する主な障害は、エレクトロポレーションの成功を監視するの欠如である。これまで、生新生児ラット仔好適双眼蛍光顕微鏡下またはIVISスペクトルの蛍光イメージングを用いて検出することができなかった蛍光ニューロンをGFP-同時トランスフェクトした。

この障害を克服するために、我々はルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時トランスフェクトし、IUE脳領域の3次元(3D)定量により仔の生物発光ライブイメージングを行った。

神経発達遺伝子操作、ラットの胚の側脳室に人間のDISC1、ルシフェラーゼ、およびGFPを含むプラスミドの同時注入をテストし、後で機能アッセイにおいて、この方法の適用可能性を実証するための例として、インビボで出生後の段階で検出することができなかった一方で、同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼ遺伝子によってルシフェリン代謝に由来する固体生物発光信号は、出生後5週間までに検出された。低変動性の一致したエレクトロポレーションの脳領域で実験群と3D-測定のエレクトロポレーション脳領域許可定量化の不十分または見当違いのエレクトロポレーションとの仔がIUE動物の割り当てを可能にする、このようにして、最初から同定されたことにより、(目的の遺伝子と制御をスクランブル) 。行動パラダイムにおける成人IUEラットの使用は、このプロトコルの有用性の例として示された。

Protocol

国家と欧州の法律に基づいて、すべての動物実験は責任Landesministeriumエリーゼ漢方、環境世界ウントVerbraucherschutz(87-51.05.2010.A​​301 LANUV NRW)によって承認された。

1。 子宮内電気穿孔法

この方法は、Walantus によるラット3、ならびにRice 。4についてJoveのに詳細に記載されており、ここでは簡単に要約されている。 6-8匹の産子数は、良好な転帰が得られます。 (下記参照)、全体的な生存率を増加させるために、少なくとも2つの非胚のエレクトロポレーションがあるべきである。

  1. 1.5μgの/μLを含むDNA-混合物を製造ターゲットプラスミド(shRNAを:をpENTR-U6、Invitrogen社、ユージーン、OR / DISC1の過剰発現:pCAX 21)、0.5μgの/プラスミド(pCAX)、0.5μgの/ GFPμLを含むルシフェラーゼμL 1X PBS溶液で染色ライトブルーにプラスミド(のpCAGGS 22)を含むファストグリーン色素でE。
  2. ニードルピペットプラーとガラスキャピラリーの外に注射針を準備します。アルコール系消毒剤(講談Tinkturフォルテ)と高圧蒸気滅菌またはインキュベーションのいずれかにより手術器具を滅菌する。
  3. 16日受精(E16)の後に妊娠したラットに手術前にブプレノルフィンの術前の用量(0.05 mg / kg)を15分を管理します。その後、イソフルランチャンバー内に動物を麻酔。
    1. 麻酔時には、1.8%で0.4リットル/分であり、イソフルランで酸素の設定を使用して、麻酔装置に接続された呼吸マスク37℃温めておいた操作テーブル上の仰臥位でのラットを置く。
    2. 腹部を剃毛した後、講談社Tinkturフォルテ(アルコール系消毒剤)で剃毛面積を3回消毒する。
    3. 唯一の剃毛オペレーションフィールドを公開、無菌布でラットをカバーしています。
  4. 子宮内電気穿孔法行う。
    1. scissoで腹部を切る白線に沿ってR(〜2センチメートル)。
    2. リングピンセットで慎重に子宮角を公開します。
    3. 全体手術中に温めた滅菌PBSで濡れた子宮壁を維持するように注意してください。
    4. 胚の側脳室のいずれかに薄いガラス針でDNA溶液を注入する。
    5. 胚の頭の周りに7ミリメートルの電極を配置します。上層皮質層の細胞集団をヒットするには、E16 23でIUEを実行し、わずかに背側/横傾向を注入心室上半球上の正極を配置。海馬細胞を標的とすることは、わずかに背側方向( 図1)の横を注射された脳室とは反対側に正電極配置を変更してください。
    6. 方形波パルスエレクトロと950ミリ秒休憩で55 Vで5 50ミリ秒パルスでエレクトロポレーションを行う。
    7. トンを増加させるために、各子宮角の膣の端部に第胚スペア彼のすべての胚の生存の可能性。
    8. バック母ラットへの子宮角を置く。
    9. 吸収性ビクリル縫合糸材料と腹壁をスティッチ。
    10. ビクリル縫合材料または縫合クリップで皮膚を閉じます。
    11. バックホームケージに母ラットを置き、2〜3時間保温し。
    12. 動物施設の部屋や飼料を自由摂取でのホームケージに一人でラットを開催しています。彼らは、E22-24の間に出産する。
    13. 3週間の彼らの母と仔ラットを維持し、男女別、その後それらを分離。

2。酵素ルシフェラーゼ反応の生物発光ライブイメージング

この方法は、 子宮内でトランスフェクトされた細胞の位置を分析するために使用される。共同エレクトロポレーションホタルルシフェラーゼcDNAは、オキシルシフェリンのD-ルシフェリンを代謝すると、光子( 図2を発するアクティブルシフェラーゼに翻訳されている図4)約35日齢までIVISスペクトラムの正エレクトロポレーションの若いラットの脳で検出することができる。

本研究では、ルシフェラーゼアッセイおよび生物発光イメージングは​​、P7から始まる行った。この時点は、母と仔が誕生ストレスから回復できるようにするために選ばれました。当初はP0に子犬を操作する場合は、仔の生存率は大幅​​に子犬が死亡して発見または母に食べたことの影響を受けました。

最初に、成功したエレクトロポレーションを有する仔ラットを、3分間の露光時間で2D-生物発光画像により識別される。続いて、正の仔はエレクトロポレーション領域の位置を特定するために、3D画像を作成するために使用される。

  1. 溶液15mgの/の濃度にPBS中でD-ルシフェリンナトリウム塩を希釈し、滅菌シリンジフィルターで濾過して滅菌する。
  2. 子犬の重さ。
  3. 上部の腹部に片手で子犬を取り、少し腹部を伸ばす。ルシフェリン溶液の腹腔内の体重の10μL/ Gを注入。古く、より機敏なものについては、ルシフェリンを注入する前に、誘導チャンバー内のイソフルランで子犬を事前に麻酔し。
  4. 3%のイソフルランでIVISスペクトル内XGI-8ガス麻酔システムのイソフルランの流入をオンにします。
  5. 麻酔システムのガラスノーズコーンに動物の鼻を入れてください。
  6. それは深い麻酔(2〜3分)になるまで、腹臥位で動物を保​​持します。その後、1.5%イソフルラン流入を減らすことができます。
  7. 全体ごみから正の子犬を選択するために2D-生物発光測定を選択します。次の設定を使用
    画面1
    大きな画像を見るにはここをクリックしてください
    1. CHECを設定kmarkは8でメディアビニングとF /ストップと写真上、カメラは、測定を開始した後、上からの写真をとります。
    2. 励起フィルターセット:ブロック。
    3. 発光フィルタを設定します。開いた。
    4. メディアにビニングを設定します。
    5. 1のF /停止を設定します。
    6. 設定ステージレベルAに
    7. 180秒に発光露光時間を設定します。
  8. よりよいホタルルシフェラーゼの次DLIT設定を使用すると、正の子犬からエレクトロポレーションの領域を定量化するために3次元画像を作成するため。
    画面3
    大きな画像を見るにはここをクリックしてください
    1. 写真の上にチェックマークを設定し、カメラが測定を開始した後、上からの写真をとります。
    2. 構造上のチェックマークを設定して、動物の表面は、IVIS前生物発光測定によりスキャンされる。
    3. Uそれ二週間の年齢まで、発光フィルタおよび露光時間の設定を、次
      発光フィルター1:590nmで、露出時間300秒
      発光フィルタ2:600nmの露光時間240秒
      発光フィルター3:620nmの露光時間180秒
      放射フィルタ4:640nmの露光時間120秒
      P20より古いラット
      発光フィルター1:600nmで、露出時間300秒
      発光フィルタ2:620nmの露光時間300秒
      発光フィルター3:640nmの露光時間300秒
      画面3
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください
      による高齢の動物における信号強度の減少に、露光時間は三大発光フィルタに拡大される。
    4. 設定段階レベルB
    5. メディアにビニングを設定します。
    6. 1のF /停止を設定
  9. 測定後、月互いに区別するために耳孔コードによってラットをkとIVISイメージングライブ画像にそれらを一致させる
  10. そのケージに戻す前に、測定手順の最後に、イソフルラン流入をオフにして数分間温めプレートにラットを保つ。

3。生物発光画像の解析

3D画像、3D映画、信号源の体積の定量化の発生をリビングImageソフトウェアIVISスペクトルにプリインストールすることによって行われる。

  1. 3D画像の生成
    1. まず、表面形状を再構築する、そのため20から30パーセントの間の閾値を設定してください。
      画面4
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください
      画面5
      EEN 6 "SRC =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. 波長ごとに10パーセントの画像閾値とDLIT 3D再構成を開始します。
      画面7
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください
      画面8
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください
      画面9
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください
    3. 3Dツールバー内のアニメイトボタンを使用して3D映画を作成します。
    4. 3D画像の他の方向を選択するだけでなく、キーフレームなどのビューをズーム、 'レコード&#を押してください39、ボタン、別の位置/方向からの切り替えを記録。
      画面10
      大きな画像を見るにはここをクリックしてください

4。行動実験

行動試験は、ラットにおけるIUE媒介遺伝子操作は、成人期まで持続する長期的な効果を開始するかどうかを決定するために行った。存在する特定の場合、一過性の効果では、IUE後一方的な全長ヒトDISC1皮質過剰発現はドーパミン関連の具体的なテストとして、アンフェタミンの低用量とすることなく、(OF)オープンフィールドに移動をテストすることによって調べた行動24。丹羽が行う。IUEマウスにおけるDISC1ノックダウン、IUEマウスではなく、コントロールを使用して、同様の手順で過敏症を示したアンフェタミン18。

子宮内で 、DISC1過剰発現ベクターを用いてエレクトロポレーションしたラットは、午後7時まで午前7時から12時間の明との実験室条件下で行われたと自由摂取を与えた。生後3ヶ月で、ラットは行動試験を受けた。

アンフェタミンの影響の読み出し、音と光隔離室に位置トゥルースキャン活性系のオープンフィールドとして移動を定量するために使用した。このシステムは、継続時間を測定し、オープンフィールドの余白やセンターで過ごした動物が移動し、時間と距離を距離だけでなく、行動25の飼育。

  1. 初日には、生理食塩水注射後の試験
    1. 動物を秤量する。
    2. 腹腔内に生理食塩水(1×PBS)を1μl/ g体重を注入する。
    3. 右注射の後、オープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始します。 15分ANのレコード3×5分間の部分にデータを細分dは。
    4. 背中そのホームケージに動物を置く。
  2. 二日目、アンフェタミン注射でのテスト
    1. 動物を秤量する。
    2. 0.5 mg / mlのアンフェタミン溶液の腹腔内に1μlの/ g体重を注入する。
    3. 注射はオープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始した直後。 15分間の記録と3×5分間の部分にデータを分割します。
    4. そのホームケージに動物を返します。
  3. 運動を分析し、特定のトゥルースキャンソフトウェアによって生成挙動を飼育。グラフパッド(プリズム)でグラフを作成し、SPSS Statisticsのソフトウェアで統計を計算します。

Representative Results

図3は 150mgのルシフェリン/ kg体重を注射した後、P7で3ラットの子のイメージング測定を住んでいます。 IUEの効率の変動を示す信号強度の違いが見える。強い生物発光シグナルを、P36( 図4)まで記録した。 図5において、生物発光イメージングにより皮質( 図5Aおよび5C)および海馬( 図5Bおよび5D)エレクトロポレーションを定義することが示されている。頭蓋骨を除去した後、その蛍光シグナルと生物発光信号( 図7a)の相関( 図7B)とP14での凍結切片脳内の対応するGFP-エレクトロポレーションした細胞( 図8)は図6〜図8に示す注目すべきは、ないていたいずれの時点でも生きたラットにおける蛍光シグナルの検出。

10トン"> インビボ生物発光イメージングは、図示例では、2次元だけ異なるエレクトロポ脳領域のおおよその判別大きく3D画像( 図5Cおよび5D)を生成IVIS SpectrumソフトウェアのDLITプログラムを用いて改善される( 図5Aおよび5B)を可能に、前頭前皮質と海馬のエレクトロポレーションを識別することができた。これは、海馬をエレクトロポレーションを目指しながら、海馬の皮質横たわっ背部のためのいくつかの前駆細胞はまた、( 図7)を打つことができることに留意すべきである。

一方的に子宮内でラットの大脳皮質にpCAXベクターでエレクトロポレーションし、その後、完全長ヒトDISC1を過剰発現しているが、成人としての自発的およびアンフェタミン誘発多動の両方について調査した。 pCAX-DISC1でエレクトロラットはアンフェタミンの低用量に過敏であった。これらのラットは大幅にMOを移動対照動物( 図10)しなかった、生理食塩水注入の後よりもアンフェタミン治療後の再。

図1
図1。 A)皮質エレクトロポレーションおよびB)海馬エレクトロポレーション用電極位置の方式は、緑=心室内のDNAミックスを注入した。

図2
図2。ルシフェラーゼ反応。

図3
図3。 150 mg / kg体重のルシフェリンの注射後P7ラットの発光測定、露出時間180秒、無発光信号A)ラット; B)ラット弱い生物発光信号に、強い発光信号とC)のラット。

図4
図4。 IUE成功を検出することができる大きな時間窓を実証150 mg / kgのルシフェリンの注射後の同じラットの連続した生物発光測定のタイムライン。

図5
図5 P7 Aでの皮質と海馬のエレクトロポレーションの違いイラストB)の2D写真】。C)&D)3D画像を、A)およびC)皮質から、B)&D)海馬から。files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg ">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

図6
図6。 P14 Aのラットの子犬のE16海馬エレクトロポレーション)生物発光Bの2Dピクチャ)生物発光信号Cの3Dイラスト)の図は、生物発光信号D)は、脳のGFPエピ蛍光シグナルと、脳を解剖した。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図7
図7。 GFPを含むプラスミドおよびルシフェラーゼでエレクトロ同じP14のラット脳の20ミクロンの低温部分からの蛍光画像の詳細ベクトル、DAPIで核染色、CA1-3 =アンモン角1-3、DG =歯状回、FCは= Fasciolarum cinereum。

ビデオ1。海馬の3Dアニメーションは、P14のラットをエレクトロポレーション。

図8
図8。オープンフィールドチャンバーでテストする前に、15分のトライアルの前の最初の日の生理食塩水注射、24時間後にアンフェタミン注入:アンフェタミンテストスキーム。

図9
図9。アンフェタミンテスト。 15分かけてTrueScanシステムによって記録動物の(cm単位)の移動距離を示す棒グラフで白バー=対照群;。灰色のバー= DISC1過剰発現しているグループ、対照群はn = 10、DISC1の過剰発現のグループN = 11; ANOVA:GENO *トリートメントP = 0.043、T-テストアンフェタミンNS =有意ではなかっpcontrol対総時間の食塩水= 0.172、pDISC1 = 0.001。

Discussion

我々の研究は、この介入の結果として、これらの動物が行わ操作の機能性を示す行動の変化を示し、IUEは、選択脳の領域と、その中で導入遺伝子を発現する神経細胞と成体ラットを生成するのに適していることを示している。本研究では、一例として、前頭前皮質の小部分に一方的にDISC1を過剰発現するラットは、アンフェタミン( 図9)に向かって過敏症を示した。

in vivoでの生物発光イメージングによるエレクトロポレーションの成功のためにラットを選択すると、IUE細胞トランスフェクションの固有の可変性を制御するのに有効であったと、後の調査のための低被験者間変動の均質IUE面積を持つグループを生成するために適用した。

本研究では、新生児動物における共エレクトロポレーション、GFP誘起蛍光を検出することによってゴミからエレクトロポ子犬を選択することができなかったとしてもカントーぐふ同時に同じ動物でも同様に共同エレクトロポレーションルシフェラーゼの生物発光シグナルはルシフェリン注射( 図6)後に検出することができ、神経細胞をGFPを発現は、6ヶ月齢ではまだ、脳内に存在していた。我々は、ラットにおいて、ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応が成功したエレクトロポレーションの脳( 図3)で動物を区別するために非常に適している、と結論付けている。

IUE成功の定量的モニタリングは、同じ露光時間( 図3)内の光子の計数によって測定し、共発現ルシフェラーゼの酵素活性に対応する生物発光信号の強度に関する。小さ ​​な生物発光シグナルは、6ヶ月のラット脳内の組織学における〜1×10 4の光子/秒/ cm 2 /ステラジアンショー1,000-2,000 GFP染色細胞の輝きで、光子の100〜200カウントによって検出可能である、と。最高の信号DISPの輝きをレイアウトさ〜5×10 6の光子/秒/ cm 2 /ステラジアンと〜64,000カウントまで。

使用のSprague Dawleyラット系統では、加齢に伴って縦方向に生物発光信号の弱体化を観察し、信号がP35の年齢( 図4)を超えて姿を消した。この時点で、我々はルシフェラーゼの一過性のプラスミドベクターベースの式のどちらかが減少、または生物発光信号が原因で増加し、脳の質量、またはその両方が消え信号の原因であるに下落した場合かどうかわからない。成体ラット中に存在する機能的アッセイのために、行動研究のための選択は、単に信号の位置に基づいて行わはなく、生物発光信号強度によるした。

3D量的生物発光の監視は、異なる電気穿孔した領域( 図5)との間の区別を可能にしたにもかかわらず、その正確性、深さDIMEに位置するセルのために制限されていました脳のnsion。 図6は、2Dと3D映像での生物発光測定は、エレクトロポレーションの良いポジショニングを示した海馬エレクトロポレーションの例を示しています。解剖死後脳において、GFP-蛍光シグナルが海馬の正しい標的化を示す、生物発光信号と同じ位置を中心に検出された。しかし、組織学はまた、海馬の皮質背側の細胞は( 図7)目標としていたことを示しています。これは生物発光アッセイが正、IUE子犬を検出し、また、エレクトロポレーション領域のアイデアを持っていることではなく、最終的には、画像が正確に積極的に標的細胞をローカライズするために死後の組織像を置き換えることはできません便利なツールであることを示している。

私たちのデモでは、C言語でaberrancesをシミュレートするために、皮質や海馬の脳領域の微妙なターゲット操作を生成するために、IUE技術の応用のための約束を示しているortical移行または成体動物に影響を与える可能性が他の神経発達の欠陥。二国間の電気穿孔26が行動にそう大きな効果を利用したが、胚のより死亡率もあります。一方的なエレクトロポレーションは、内部対照として、ならびに片側、小領域内であってもIUE操作が動作を変更するのに十分であることを示すものと二つの半球を比較するために選択した。ニューロン間の接続やアーキテクチャのIUEによる変化は、このように、病変し、適切な行動試験で被IUE-操作さ領域が、科学的な疑問に依存しているのに必要な一致を想起させることなく誘導することができる。

トラブルシューティング

縮小産子数 IUE仔の生存率を増加に関するいくつかの提案があります。まず、組織を最小限に抑えるために、エレクトロポレーションの間に非常に薄いガラスキャピラリーの使用lesionがお勧めします。第2に、各子宮角の膣終わりに最初の胚をエレクトロポレーションしない:最初の生まれの胚の死は、他のすべての胚の中止の可能性が高くなります。第三に、出産後、母親ラットは、しばしば周産期のストレスにその子孫の一部を殺す。追加のストレスを低減するためには、右生後ライブイメージングで始まっていませんが、7日間を待つ。

仔のGFP-蛍光検出

生後一週間で、どちらかIVISスペクトルとライブ双眼蛍光顕微鏡イメージングまたは蛍光イメージング使用して蛍光の無信号(エピ蛍光とtransfluorescenceモードを、GFPの励起/発光のために:520分の465 nmおよび540分の500 nm)を。それは、皮膚の頭蓋骨と高い自己蛍光の背景のような組織を通る短い波長の励起および発光光の限られた伝送がお得!の下で蛍光を用いないように、両方の可能性がありますラットの条件をribed。 図6に示すように、生きている動物におけるルシフェラーゼシグナルはまた、(頭蓋骨なし)に解剖脳において検出することができ、そこに、また蛍光シグナル( 図6D)検出可能である。

密集した脳領域における生物発光の分化

でも、3Dイラスト生物発光領域の位置は、100%に予測することはできません。特に、予測領域の上または下に細胞はまた誤って標的とトランスフェクトすることができる。正確な位置は、死後(蛍光)組織学( 図7参照)によって制御されなければならない。

Disclosures

この研究の著者らは、この研究では経済的利害関係を持っていないと、この研究のために産業界が主催されていない。オープンアクセス料はパーキンエルマー社のポスト出版物によって寄与された。

Acknowledgments

著者らは、プラスミドを提供するためのトレイシー·ヤング·ピアースと淳神谷に感謝します。

CKに、そして(DE 792/2-4)の塊に、この作品は、ORおよびCKにニューロンERANET DISCOVER(BMBF 01EW1003)、DFG(GRK1033パンガン1679/3-1)によって賄われていた

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

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References

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局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング
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Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

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