Summary
يمكن التلاعب الجينات خلال تطوير القشرة أو الحصين من الفئران في الرحم عن طريق التثقيب الكهربائي (IUE) في E16، لتمكين تعديلات سريعة وهادفة في اتصال الخلايا العصبية للدراسات في وقت لاحق من السلوك أو أمراض الأعصاب في الحيوانات البالغة. يتم تنفيذ ما بعد الولادة في التصوير المجراة من أجل السيطرة على نجاح IUE بواسطة تلألؤ بيولوجي تفعيل luciferase المراسل transfected المشترك.
Abstract
في الرحم التثقيب الكهربائي (IUE) هو الأسلوب الذي يسمح التعديل الوراثي للخلايا في الدماغ عن التحقيق في تطوير الخلايا العصبية. حتى الآن، واستخدام IUE للتحقيق في السلوك أو أمراض الأعصاب في الدماغ الكبار كان محدودا من قبل وسائل كافية لرصد نجاح ترنسفكأيشن IUE بواسطة تقنيات غير الغازية في الحيوانات بعد الولادة.
لهذه الدراسة، تم استخدام الفئران E16 لIUE. بعد الحقن داخل البطينات من الأحماض النووية في الأجنة، وتحديد المواقع من الأقطاب منتاش الحرجة لاستهداف إما القشرة النامية أو قرن آمون.
البطين شارك في حقن و electroporation من الجينات يسمح luciferase المراسل رصد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل بعد الولادة بعد الحقن داخل الصفاق وسيفيرين في تخدير الجرو P7 الحية في الجسم الحي بواسطة تلألؤ بيولوجي، وذلك باستخدام جهاز الطيف IVIS مع برنامج 3D الكمي.
الطبقة = "jove_content"> تعريف المنطقة التي كتبها تلألؤ بيولوجي يمكن التمييز بوضوح بين electroporations القشرية وقرن آمون والكشف عن إشارة طوليا مع مرور الوقت تصل إلى 5 أسابيع بعد الولادة. سمحت هذه التقنية التصوير لنا لتحديد الجراء مع وجود عدد كاف من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يفترض اللازمة لتحريك الآثار البيولوجية، وبعد ذلك لأداء التحقيقات السلوكية في 3 أشهر من العمر. كمثال على ذلك، توضح هذه الدراسة أن IUE مع الإنسان DISC1 كامل طول الجين في الفئران القشرة أدت إلى فرط الحساسية المنشطات. يمكن أن يتم الكشف عن GFP transfected المشارك في الخلايا العصبية عن طريق التشريح المجهري مضان في cryosections يدل التعبير الجيني موجودا في ≥ 6 أشهر بعد الولادة.
فإننا نستنتج أن التصوير تلألؤ بيولوجي يسمح بعدها تقييم نجاح transfections عابرة مع IUE في الفئران. تحقيقات حول تأثير التلاعب الجيني الموضعية خلال neurodevelopmenر على الدماغ الكبار والاتصال به وسهلت إلى حد كبير. بالنسبة لكثير من المسائل العلمية، ويمكن هذا الأسلوب تكملة أو حتى استبدال استخدام الفئران المعدلة وراثيا، وتوفير تكنولوجيا جديدة لعلم الأعصاب السلوكي.
Introduction
تطوير في الرحم التثقيب الكهربائي (IUE) الطريقة التي يسمح التشكيل التعبير الجيني في الدماغ النامية، كانت من خلال كسر لأنها مكنت دراسة النمو العصبي مع السهولة النسبية. 1-7 التغيرات في مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة في وقد أظهرت منطقة محددة في الدماغ أثناء التطور الجنيني و / أو فترة ما حول الولادة في القوارض لانتقادية تأثير انتشار الخلايا العصبية، والهجرة، تشجر، والاتصال. 8-10
الفصام هو مرض عقلي معقد مع الأعراض الحادة والمزمنة التي تم المتصلة تشوهات العصبية النمائية 11، 12، وبالتالي العديد من الجينات التي تم تحديدها لمرشح الفصام يتم التحقيق للآثار المحتملة على النمو العصبي تحوير، مثل على سبيل المثال لعطل في والفصام -1 (DISC1) الجين 13-15.
نمو الدماغ هو regulatإد بواسطة العوامل الوراثية وتفاعلها مع البيئة التي تلعب دورا في، قبل فترات التنموية شبه وبعد الولادة. أحد العوامل الرئيسية للمخاطر الوراثية الاضطرابات السلوكية المختلفة هو DISC1 16 الجينات. DISC1 يؤدي ضربة قاضية لعيوب الهجرة في الفئران 13، 17، ولقد ثبت التلاعب التعبير DISC1 في القشرة النامية عن طريق IUE للتأثير سلوك الفئران البالغة 18.
التلاعب التعبير الجيني الدماغ عن طريق IUE ديها العديد من المزايا أكثر من 19 جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا خطوط. الأولى، ويتحقق التعبير الجيني داخل المناطق ذات الاهتمام في غضون أسابيع أو شهور بدلا من عدة أجيال من تربية القوارض خطوط المعدلة وراثيا. الثانية، وتجنب الآليات التعويضية خلال التنمية في وقت مبكر قد الظواهر حماية الحيوانات في الهندسة سلالة الجرثومية 20. الثالث، من خلال استهداف سوى السكان خلية معينة أو منطقة معينة من الدماغ، migratiأو الاختلافات الانتشار ويمكن مقارنة مباشرة مع غير متحولة أو السيطرة على الجانب المقابل إذا يتم اختيار electroporations من جانب واحد. من ناحية أخرى، لا يملك IUE دقة يحركها المروج لجنة المساواة العرقية / التي يسببها سمك مدخن توقيت التعبير وفقط جزء من السكان من الخلايا في منطقة معينة ويستهدف مما يؤدي إلى نوع من الفسيفساء نمط التعبير الجيني.
للعديد من التطبيقات التجريبية في القوارض الكبار، وهو ترنسفكأيشن عابرة من عدد محدود من الخلايا في منطقة المخ قد تكون كافية، أو حتى المرجوة، حتى أن الميزة الرئيسية لاستقرار والقوارض-سلالة الجرثومية المعدلة وراثيا لا يكاد يذكر. في الواقع، IUE مفيد للتحقيق في ما إذا كانت بعض الخلايا بشكل غير طبيعي قد تؤثر تطوير شبكة كاملة من الخلايا أو الدوائر. قد تكون ميزة أخرى القدرة على إظهار الآثار غير من الجينات خلية مستقلة نظرا لطبيعة الفسيفساء للضرب. وعلاوة على ذلك، فإن الجيل من الفئران المعدلة وراثيا وخروج المغلوب لا تزال في مهدها، واستخداممن IUE في هذا النوع لدراسة عواقب نمو الدماغ الشاذة هي من الفائدة المرتفعة.
حتى الآن، عقبة رئيسية استخدام IUE عن التحقيق في عواقب التدخل في تلك الحيوانات مثل البالغين هو عدم النجاح الرصد التثقيب الكهربائي. حتى الآن، GFP المشارك transfected-الفلورسنت الخلايا العصبية في الفئران حديثي الولادة الجراء الحية لا يمكن أن يتم الكشف عن تحت المجهر مضان مجهر مناسبة أو مع التصوير مضان من الطيف IVIS.
للتغلب على هذه العقبة، ونحن نشارك في transfected الجين مراسل luciferase وتنفيذ تلألؤ بيولوجي التصوير الحي من الجراء قبل 3 الأبعاد (3D) الكميات من منطقة الدماغ IUE.
كمثال لبيان مدى انطباق هذا الأسلوب في فحص وظيفية في وقت لاحق اختبار التلاعب الجيني النمو العصبي، وحقن المشارك البلازميدات تحتوي على DISC1 الإنسان، luciferase المراسل، وGFP إلى البطين الجانبي من أجنة الفئران
Protocol
تم اعتماد جميع التجارب على الحيوانات من قبل Landesministerium مسؤولة FÜR الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz (LANUV NRW؛ 87-51.05.2010.A301) وفقا للتشريعات الوطنية والأوروبية.
1. في الرحم التثقيب الكهربائي
وقد وصفت هذه الطريقة بالتفصيل في إن الرب للجرذ عن طريق Walantus وآخرون. 3، وكذلك رايس وآخرون. 4 وهنا تلخيص فقط لفترة وجيزة. A حجم القمامة من الجراء 6-8 تعطي نتائج جيدة. يجب أن يكون هناك على الأقل اثنان أجنة غير electroporated من أجل زيادة معدل البقاء على قيد الحياة عموما (انظر أدناه).
- إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على خليط 1.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البلازميد المستهدفة (shRNA: pENTR-U6؛ إينفيتروجن، يوجين، OR / DISC1 من overexpression: pCAX 21)، و 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر luciferase المراسل تحتوي على البلازميد (pCAX)، و 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر GFP تحتوي على البلازميد (pCAGGS 22) في برنامج تلفزيوني 1X حل الملون بلو ضوءالبريد السريع مع الأخضر صبغ.
- إعداد إبر الحقن من الشعيرات الدموية الزجاج مع إبرة ماصة بولير. وتعقيم الأدوات الجراحية إما عن طريق التعقيم أو الحضانة مع مطهر على الكحول (kodan Tinktur موطن).
- إدارة جرعة ما قبل منطوق البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) 15 دقيقة قبل الجراحة لفأر حامل بعد 16 أيام الإخصاب (E16). ثم تخدير الحيوان في غرفة isoflurane و.
- عند التخدير، وضع الفئران في موقف ضعيف على طاولة العملية 37 ° C تحسنت مع قناع التنفس متصلا جهاز تخدير، وذلك باستخدام الإعداد الأكسجين عند 0.4 لتر / دقيقة وisoflurane وبنسبة 1.8٪.
- بعد حلق البطن، وتطهير منطقة حلق ثلاث مرات مع kodan Tinktur فورتي (مطهر على الكحول).
- تغطية الفئران مع الملابس المعقمة، وفضح فقط مجال عملية حليق.
- أداء في الرحم التثقيب الكهربائي.
- قطع البطن مع scissoص على طول الخط ألبا (~ 2 سم).
- فضح أبواق الرحم بعناية مع ملقط الحلبة.
- الحرص على الحفاظ على جدار الرحم الرطب مع برنامج تلفزيوني العقيمة تحسنت خلال الجراحة كله.
- حقن محلول الحمض النووي مع إبرة رقيقة الزجاج في واحدة من البطين الجانبي للأجنة.
- وضع 7 ملم الكهربائي في جميع أنحاء رأس الجنين. ليصل عدد سكانها خلية من الطبقات القشرية العليا، نفذ IUE في E16 23 ووضع القطب الموجب على نصف الكرة فوق البطين حقنوا طفيف الظهرية / الوحشي الاتجاه. لاستهداف خلايا قرن آمون تغيير موضع القطب الموجب إلى الجانب الآخر من البطين الجانبي لحقن قليلا الاتجاه الظهري (الشكل 1).
- أداء التثقيب الكهربائي من قبل خمسة البقول 50 مللي ثانية في 55 V مع 950 ميللي ثانية مع فواصل موجة مربعة نبض electroporator.
- تجنيب الجنين الأولى في نهاية المهبل كل قرن الرحم من أجل زيادة روقال انه من فرص البقاء على قيد الحياة من جميع الأجنة.
- وضع قرون الرحم مرة أخرى في الفئران الأم.
- ستيتش جدار البطن حتى مع امتصاص VICRYL مواد خياطة الجروح الجراحية.
- إغلاق الجلد مع مواد خياطة الجروح VICRYL أو مع مقاطع خياطة.
- وضع الفئران الأم مرة أخرى في قفص المنزل وإبقائه دافئا لمدة 2-3 ساعة.
- عقد الفئران وحدها في قفص وطنهم في غرفة منشأة الحيوان وتتغذى بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. أنها تلد بين E22-24.
- الحفاظ على الفئران الوليدة مع والدتهم لمدة ثلاثة أسابيع وفصلها بعد ذلك من قبل الجنسين.
2. تلألؤ بيولوجي التصوير لايف من رد الفعل الأنزيمية luciferase المراسل
ويستخدم هذا الأسلوب لتحليل موقف في الرحم الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. تتم ترجمة electroporated المشترك كدنا] يراعة luciferase في luciferase المراسل النشط، الذي على تأييض D-وسيفيرين لoxyluciferin، تنبعث من الفوتون (الشكل 2 (الشكل 4).
في هذه الدراسة، تم إجراء فحص و luciferase تلألؤ بيولوجي التصوير ابتداء من الساعة P7. وقد تم اختيار هذه النقطة الوقت للسماح الأم والجراء للتعافي من الإجهاد الولادة. عند العمل في البداية مع الجراء في P0، تأثر بشدة في البقاء على قيد الحياة الجرو أن الجراء وعثر عليه ميتا أو تؤكل من قبل الأم.
في البداية، يتم تحديد الفئران الوليدة مع التثقيب الكهربائي الناجحة التي قام بها صورة 2D-تلألؤ بيولوجي مع ومدة التعرض من ثلاث دقائق. بعد ذلك، يتم استخدام الجراء إيجابية لخلق صور 3D من أجل تحديد موقع منطقة electroporated.
- تمييع-D وسيفيرين ملح الصوديوم في برنامج تلفزيوني إلى تركيز 15 ملغ / مل وتعقيمها عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة معقمة.
- تزن الجراء.
- تأخذ الجرو في يد واحدة مع البطن وتمتد على أعلى البطن قليلا. ضخ 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من وسيفيرين داخل الصفاق الحل. لمن كبار السن وأكثر مرونة، قبل تخدير الجراء مع isoflurane وفي غرفة تحريض قبل حقن وسيفيرين.
- بدوره على تدفق isoflurane وللXGI-8 نظام التخدير الغاز داخل الطيف IVIS مع 3٪ isoflurane و.
- وضع خطم الحيوان في المخاريط الزجاج الأنف من نظام التخدير.
- عقد الحيوان في وضعية الرقود حتى أنه في التخدير العميق (2-3 دقيقة). ثم الحد من تدفق isoflurane وإلى 1.5٪.
- اختيار القياس 2D-تلألؤ بيولوجي لتحديد الجراء إيجابية من القمامة كله. استخدام الإعدادات التالية
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .- تعيين إيكولوجياkmark على الصورة مع binning المتوسطة وF / إيقاف في 8، وتلتقط الكاميرا صورة من فوق بعد بدء القياس.
- تعيين مرشح الإثارة: كتلة.
- تعيين مرشح الانبعاثات: مفتوحة.
- تعيين Binning إلى متوسطة.
- مجموعة F / إيقاف في 1.
- تعيين مستوى المرحلة A.
- تعيين التلألؤ وقت التعرض إلى 180 ثانية.
- لخلق صور 3D من أجل تحديد أفضل منطقة electroporated من الجراء إيجابية، استخدم الإعدادات التالية لDLIT يراعة luciferase.
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .- وضع علامة على الصورة، وتلتقط الكاميرا صورة من فوق بعد بدء القياس.
- وضع علامة على الهيكل ويتم تفحص سطح الحيوان من قبل IVIS قبل قياس تلألؤ بيولوجي.
- Uحد ذاتها التالية مرشحات الانبعاثات وضبط وقت التعرض حتى سن أسبوعين:
الانبعاثات مرشح 1: 590 نانومتر، وقت التعرض 300 ثانية
تصفية الانبعاثات 2: 600 نانومتر، وقت التعرض 240 ثانية
تصفية الانبعاثات 3: 620 نانومتر، وقت التعرض 180 ثانية
تصفية الانبعاثات 4: 640 نانومتر، وقت التعرض 120 ثانية
بالنسبة للفئران أكبر سنا من P20
الانبعاثات مرشح 1: 600 نانومتر، وقت التعرض 300 ثانية
تصفية الانبعاثات 2: 620 نانومتر، وقت التعرض 300 ثانية
تصفية الانبعاثات 3: 640 نانومتر، وقت التعرض 300 ثانية
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
ويرجع ذلك إلى انخفاض في قوة الإشارة في الحيوانات الأكبر سنا، يتم تكبير الوقت التعرض للمرشحات أفضل ثلاثة الانبعاثات. - تعيين مستوى المرحلة B
- تعيين Binning إلى متوسطة.
- مجموعة F / إيقاف في 1
- بعد القياس، مارس ك الفئران بواسطة رمز earhole لتمييزها عن بعضها البعض ومطابقتها للصور IVIS يعيش التصوير
- في نهاية الإجراء القياس، إيقاف isoflurane وتدفق والحفاظ على الفئران على لوحة استعد لبعض دقائق قبل إعادته إلى قفصه.
3. تحليل ضوء بارد صور
يتم توليد صور 3D، أفلام 3D والكمي لحجم مصدر إشارة من قبل البرنامج صورة حية مثبتة مسبقا على الطيف IVIS.
- جيل من صور 3D
- أولا، إعادة بناء تضاريس السطح، وبالتالي تحديد عتبة بين 20-30٪.
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
التابعين 6 "سرك =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> - بدء DLIT إعادة الإعمار 3D مع عتبة صورة 10٪ لكل طول موجي.
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
انقر هنا لعرض أكبر شخصية . - إنشاء أفلام 3D باستخدام الزر الأرواح داخل شريط الأدوات 3D.
- اختيار توجهات مختلفة من صورة 3D، وكذلك وجهات النظر التكبير كما الأطر الرئيسية والضغط على 'سجل & #39؛ زر، وتسجيل التحول من موقف واحد / التوجه إلى أخرى.
انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
- أولا، إعادة بناء تضاريس السطح، وبالتالي تحديد عتبة بين 20-30٪.
4. اختبار السلوكية
تم إجراء اختبار السلوكية من أجل تحديد ما إذا كان التلاعب الجيني IUE بوساطة في الفئران قد بدء الآثار الطويلة الأجل التي تستمر حتى سن البلوغ. في قضية معينة الحاضر، وتأثير عابر، من جانب واحد كامل طول DISC1 الإنسان القشرية من overexpression بعد IUE تم التحقيق من خلال اختبار تحرك في حقل مفتوح (OF)، مع وبدون جرعة منخفضة من المنشطات، كاختبار محددة للذات الصلة الدوبامين السلوك 24. في إجراء مماثل يؤديها نيوا آخرون في الفئران باستخدام IUE ضربة قاضية DISC1 والفئران IUE لكن ليس أظهرت الضوابط فرط الحساسيةلالأمفيتامين 18.
عقدت الفئران التي تم electroporated في الرحم مع DISC1 ناقلات overexpressing تحت ظروف المختبر مع ضوء 12 ساعة 07:00 حتي 19:00 وتم تغذيتها بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. في 3 أشهر من العمر، وخضع لاختبار الفئران السلوكية.
لقياس تحرك بوصفها قراءات من آثار المنشطات، حقل مفتوح من نظام النشاط ترو المسح الضوئي التي تقع في دائرة الصوت والضوء معزولة تم استخدامه. يقيس هذا النظام الوقت والنأي مدة يتحرك الحيوان، والوقت والمسافة البقاء على الهامش أو وسط الميدان مفتوح، وكذلك تربية السلوك 25.
- في اليوم الأول، اختبار بعد الحقن بالمحلول الملحي
- وزن الحيوانات.
- حقن الغشاء البريتونى 1 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من محلول ملحي (برنامج تلفزيوني 1X).
- مباشرة بعد الحقن، ووضع الحيوان في الحقل المفتوح والبدء في قياس النظام TruScan. سجل لمدة 15 دقيقة لد تقسيم البيانات إلى 3 × 5 دقائق أجزاء.
- وضع الحيوان مرة أخرى في قفص وطنه.
- اليوم الثاني، الاختبار على حقن المنشطات
- وزن الحيوانات.
- حقن الغشاء البريتونى 1 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من 0.5 ملغ / مل حل المنشطات.
- مباشرة بعد الحقن وضع الحيوان في الحقل المفتوح والبدء في قياس النظام TruScan. سجل لمدة 15 دقيقة وتقسيم البيانات إلى 3 × 5 دقائق أجزاء.
- عودة الحيوان إلى قفص وطنه.
- تحليل تحرك وتربية السلوك التي تولدها محددة ترو المسح الضوئي البرمجيات. إنشاء الرسوم البيانية مع GraphPad (بريزم) وحساب إحصاءات SPSS الاحصائيات البرمجيات.
Representative Results
ويبين الشكل 3 يعيش القياسات التصوير من ثلاثة الفئران الوليدة في P7 بعد حقن 150 ملغ وسيفيرين / كجم من وزن الجسم. الاختلافات في قوة الإشارة التي تشير إلى التباين في كفاءة IUE مرئية. وسجلت إشارات تلألؤ بيولوجي قوي حتى P36 (الشكل 4). في الشكل 5، وصفت القدرة على تحديد القشرية (أرقام 5A و5C) وقرن آمون (أرقام 5B و 5D) التثقيب الكهربائي عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي. وصفت علاقة للإشارة تلألؤ بيولوجي (الشكل 7A) مع إشارة مضان لها بعد إزالة الجمجمة (الشكل 7B) والخلايا electroporated GFP المقابلة في الدماغ cryosectioned (الشكل 8) في P14 في أرقام 6-8. من المذكرة، لم يكن هناك الكشف عن إشارة مضان في الفئران الحية في أي نقطة زمنية.
خيمة "> في الجسم الحي التصوير تلألؤ بيولوجي يمكن التمييز التقريبية لمناطق الدماغ electroporated مختلفة من قبل 2D (أرقام 5A و 5B) التي تحسنت كثيرا مع برنامج DLIT من البرنامج IVIS الطيف توليد 3D الصور (أرقام 5C و 5D). في الأمثلة المعروضة ، يمكن تمييز التثقيب الكهربائي للقشرة الفص الجبهي والحصين. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين تهدف ل electroporate الحصين، وبعض الخلايا الاصلية للقشرة الكذب الظهري للقرن آمون كما يمكن ضرب (الشكل 7).وقد تم التحقيق من جانب واحد في الرحم الفئران electroporated مع ناقلات pCAX في القشرة وبالتالي overexpressing كامل طول DISC1 الإنسان على حد سواء العفوية والتي يسببها الأمفيتامين فرط النشاط مثل البالغين. وكانت الفئران electroporated مع pCAX-DISC1 شديدة الحساسية لجرعة منخفضة من المنشطات. انتقلت هذه الفئران بشكل ملحوظ موإعادة بعد العلاج من المنشطات بعد لحقن المياه المالحة، في حين أن الحيوانات لم تحكم (الشكل 10).
الشكل 1. مخطط لموقف القطب A) التثقيب الكهربائي القشرة وباء) التثقيب الكهربائي الحصين؛ الخضراء = حقن الحمض النووي ميكس داخل البطين.
الشكل 2. رد فعل luciferase المراسل.
الرقم 3. قياس التلألؤ من الفئران P7 بعد حقن 150 ملغم / كغم من وزن الجسم luciferine؛ زمن التعرض 180 ثانية؛ A) الفئران مع عدم وجود إشارة التلألؤ؛ B) الفئران مع إشارة ضعيفة تلألؤ بيولوجي؛ C) الفئران مع إشارة التلألؤ قوية.
الشكل 4. خط الزمن من القياسات تلألؤ بيولوجي متتالية من نفس الفئران بعد حقن 150 ملغم / كغم luciferine إظهار نافذة زمنية كبيرة حيث يمكن أن يتم الكشف عن نجاح IUE.
. الرقم 5 توضيحات من الاختلافات بين التثقيب الكهربائي القشرية وقرن آمون في P7 A) B و) الصور 2D؛ C) & D) صور 3D، A) & C) من القشرة؛ B) & D) من الحصين.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الرقم 6. التوضيح من E16 التثقيب الكهربائي الحصين من الجرو الفئران في P14 A)-2D صورة تلألؤ بيولوجي B) التوضيح 3D من تلألؤ بيولوجي إشارة C) تشريح الدماغ مع تلألؤ بيولوجي إشارة D) الدماغ مع GFP إشارة برنامج التحصين الموسع ومضان. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 7. التفاصيل من صورة مضان من قسم البرد 20 ميكرومتر من نفس P14 الدماغ الفئران electroporated مع GFP البلازميد والتي تحتوي على luciferase المراسلناقلات، نوى تلطيخ مع دابي؛ CA1-3 = كورنو آمون 1-3؛ DG = التلفيف المسنن؛ FC = Fasciolarum الرمادية.
الفيديو 1. 3D الرسوم المتحركة من الحصين electroporated الفئران في P14.
الرقم 8. المنشطات اختبار مخطط: حقن المياه المالحة اليوم الأول قبل المحاكمة 15 دقيقة، 24 ساعة في وقت لاحق حقن المنشطات قبل إجراء الاختبار في غرفة حقل مفتوح.
الرقم 9. اختبار المنشطات. شريط يظهر الرسم البياني مسافة المنقولة (في سم) للحيوان سجلت عن طريق نظام TrueScan أكثر من 15 دقيقة القضبان الأبيض = المجموعة الضابطة؛ القضبان الرمادية = DISC1 مجموعة overexpressing، ومراقبة مجموعة ن = 10؛ DISC1 مجموعة من overexpression ن = 11؛ أنوفا: * العلاج جينو ع = 0.043؛ تي اختبار لمجموع المالحة الوقت مقابل نانوثانية المنشطات = لا pcontrol كبيرة = 0.172، 0.001 = pDISC1.
Discussion
يوضح دراستنا أن IUE هي مناسبة لتوليد الفئران الكبار مع الخلايا العصبية تعبر عن التحوير في منطقة انتقائية من الدماغ، وأنه نتيجة لهذا التدخل، هذه الحيوانات تظهر التغييرات في السلوك يشير إلى وظيفة من التلاعب يؤدونها. في هذه الدراسة، على سبيل المثال، أظهرت الفئران overexpressing DISC1 جانب واحد في جزء صغير من قشرة الفص الجبهي فرط الحساسية تجاه المنشطات (الشكل 9).
اختيار الفئران للنجاح التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بواسطة التصوير تلألؤ بيولوجي كان فعالا في السيطرة على التنوع الكامن ترنسفكأيشن الخلية IUE وتم تطبيقها لتوليد مجموعات بمساحة IUE متجانسة من انخفاض التباين بين الموضوع للتحقيقات في وقت لاحق.
في هذه الدراسة، لم نتمكن من تحديد الجراء electroporated من القمامة عن طريق الكشف عن electroporated شارك في مضان GFP التي يسببها في الحيوان حديثي الولادة، حتى ثوهتاف اشمئزاز في نفس الوقت وفي نفس الحيوان يمكن أن يتم الكشف عن إشارة تلألؤ بيولوجي من luciferase المراسل بالتساوي شارك electroporated بعد حقن وسيفيرين (الشكل 6)، وكانت لا تزال في التعبير عن GFP الخلايا العصبية الموجودة في الدماغ في سن ستة أشهر. نستنتج أنه في الفئران، فإن رد الفعل luciferase المراسل / وسيفيرين هي مناسبة تماما للتمييز بين الحيوانات مع العقول electroporated الناجحة (الشكل 3).
رصد الكمي للنجاح IUE تتعلق قوة الإشارة تلألؤ بيولوجي التي تقاس التهم من الفوتونات في نفس الوقت التعرض (الشكل 3) ويتوافق مع النشاط الأنزيمي من luciferase المراسل أعرب المشترك. إشارات تلألؤ بيولوجي صغيرة قابلة للكشف من قبل 100-200 التهم من الفوتونات، و، في وهج ~ 1X10 4 الفوتونات / ثانية / سم 2 / المعرض ستيراديان 1،000-2،000 الخلايا ملطخة GFP في الأنسجة في الدماغ الفئران 6 أشهر من العمر. أعلى DISP إشارةالأصغر حجما إشعاع تصل إلى ~ 5X10 6 الفوتونات / ثانية / سم 2 / ستيراديان و~ 64،000 التهم الموجهة إليه.
في سلالة الفئران سبراغ داولي المستخدمة، لاحظنا ضعف إشارة تلألؤ بيولوجي طوليا مع زيادة العمر وإشارة اختفى بعد سن P35 (الشكل 4). عند هذه النقطة، ونحن لا نعرف ما إذا كان إما عابرة، البلازميد التعبير المستندة إلى متجه من luciferase المراسل النقصان، أو إذا كانت إشارة تلألؤ بيولوجي يضعف بسبب زيادة كتلة الدماغ، أو كليهما هي أسباب إشارة الزوال. للمقايسة وظيفية موجودة في الفئران الكبار، وجاء اختيار للدراسات السلوكية مجرد استنادا إلى موقع للإشارة، ولكن ليس من تلألؤ بيولوجي قوة الإشارة.
على الرغم من الرصد الكمي تلألؤ بيولوجي 3D يسمح التمايز بين المناطق المختلفة electroporated (الشكل 5)، وكان لها accurateness محدودة للخلايا الواقعة في عمق الدايميظهر nsion من الدماغ. الشكل 6 مثال على التثقيب الكهربائي الحصين حيث قياس تلألؤ بيولوجي في 2D و 3D الصورة تدل على وجود المواقع الجيدة للالتثقيب الكهربائي. في تشريح الدماغ بعد الوفاة، تم الكشف عن إشارة GFP مضان في حوالي نفس الموقف إشارة تلألؤ بيولوجي، مشيرا إلى استهداف الصحيح الحصين. ولكن يظهر أن الأنسجة أيضا الخلايا في القشرة الظهرية من الحصين قد تم استهداف (الشكل 7). هذا يشير إلى أن فحص تلألؤ بيولوجي هو أداة مفيدة للكشف عن الإيجابية، الجراء IUE وأيضا لدينا فكرة عن المنطقة electroporated، ولكن، في نهاية المطاف، والتصوير لا يمكن أن تحل محل الأنسجة بعد الوفاة بالضبط توطين الخلايا المستهدفة بشكل إيجابي.
مظاهرة لدينا يشير إلى وعد لتطبيق التكنولوجيا IUE لتوليد التلاعب استهدفت خفية من مناطق الدماغ القشرية أو قرن آمون لمحاكاة aberrances في جالهجرة ortical أو العيوب العصبية النمائية الأخرى التي قد تؤثر على حيوان بالغ. بينما التثقيب الكهربائي الثنائية 26 لديه ميزة وجود تأثير أكبر على الأرجح السلوك، وهناك أيضا أكثر من وفيات الأجنة. وقد تم اختيار التثقيب الكهربائي من جانب واحد من أجل المقارنة بين نصفي الكرة الأرضية مع واحدة باعتبارها الرقابة الداخلية، وكذلك لإظهار أنه حتى التلاعب IUE في جانب واحد، منطقة صغيرة كافية لتغيير السلوك. وبالتالي قد يكون ذلك حافزا التغييرات IUE التي يسببها في الاتصال بين الخلايا العصبية أو الهندسة المعمارية دون إثارة آفة ومباراة المطلوب من المنطقة ليكون بين IUE التلاعب مع الاختبار السلوكية المناسبة يعتمد على مسألة علمية.
مشكلة اطلاق النار
تخفيض حجم القمامة وهناك عدة اقتراحات بشأن زيادة بقاء الجراء IUE. أولا، واستخدام الزجاج الشعيرات الدموية رقيقة جدا خلال التثقيب الكهربائي من أجل تقليل الأنسجة lesioينصح ن. الثانية، لا electroporate الجنين الأولى في نهاية المهبل كل قرن الرحم: موت الجنين المولود الأول يزيد من فرص إحباط جميع الأجنة الأخرى. الثالث، بعد الولادة، وغالبا ما تقتل الفئران الأم جزءا من ذريتها بسبب الإجهاد في الفترة المحيطة بالولادة. من أجل الحد من التوتر إضافية، لا تبدأ مع التصوير الحي مباشرة بعد الولادة، ولكن الانتظار لمدة سبعة أيام.
الكشف عن GFP مضان من الجراء
في أسبوع واحد بعد الولادة، أي إشارة مضان إما باستخدام مجهر مضان الحية المجهرية أو التصوير التصوير مضان مع الطيف IVIS (epifluorescence وسائط transfluorescence؛ لGFP الإثارة / الانبعاثات: 465/520 نانومتر و 500/540 نانومتر). فمن الممكن أن حد سواء، وانتقال محدود من الطول الموجي القصير الإثارة وانبعاث الضوء من خلال الأنسجة مثل الجمجمة والخلفية تألق ذاتي عالية من الجلد منع استخدام مضان تحت تنازلياribed الأوضاع في الفئران. كما هو مبين في الشكل (6)، ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن إشارة luciferase المراسل في الحيوانات التي تعيش في تشريح الدماغ (دون الجمجمة) وهناك، أيضا إشارة مضان قابلا للاكتشاف (الشكل 6D).
التفريق بين تلألؤ بيولوجي في مناطق الدماغ متباعدة عن كثب
حتى في الرسم التوضيحي 3D لا يمكن توقع موقع منطقة تلألؤ بيولوجي إلى 100٪. ويمكن أيضا خصوصا الخلايا على أعلى أو أقل من مجال وتوقع أن تستهدف بطريق الخطأ وtransfected. الموضع الدقيق له أن يسيطر عليها بعد الوفاة (مضان) الأنسجة (انظر الشكل 7).
Disclosures
واضعو هذه الدراسة لم يكن لديك مصلحة مالية في هذه الدراسة والتي لم يتم برعاية الصناعة لهذه الدراسة. وقد ساهمت رسوم مفتوح وصول PERKINELMER شركة نشر آخر.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر تريسي يونغ بيرس واتسوشي كاميا لتوفير البلازميدات.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الخلايا العصبية، ERANET اكتشاف لأو وCK (BMBF 01EW1003)، DFG (كو 1679/3-1؛ GRK1033) لCK، و (DE 792/2-4) إلى MASS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
| kodan Tinktur forte | Schülke Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical Scissors - sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
| Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
| IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
- Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
- Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
- Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
- Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
- Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
- Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
