Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generering av Topically Transgene Rats etter doi: 10.3791/50146 Published: September 24, 2013

Summary

Gener kan manipuleres under utviklingen av hjernebarken eller hippocampus av rotte via in utero electroporation (iue) på E16, for å muliggjøre rask og målrettede endringer i nevronale tilkobling for senere studier av atferd eller nevropatologi hos voksne dyr. Postnatal in vivo avbildning for kontroll av IUE suksess er utført av bioluminescens for aktivering co-transfektert luciferase.

Abstract

I utero electroporation (iue) er en teknikk som gjør at genmodifisering av celler i hjernen for å undersøke nevronale utvikling. Så langt, har bruken av iue for å undersøke atferd eller nevropatologi i den voksne hjernen er begrenset av utilstrekkelige metoder for overvåking av iue transfeksjon suksess ved ikke-invasive teknikker i postnatal dyr.

For denne studien, ble E16 rotter brukes for iue. Etter intraventrikulær injeksjon av nukleinsyrene til embryoene, anbringelse av pinsetten elektroder var kritisk for målretting enten den tredje cortex eller hippocampus.

Ventrikulær co-injeksjon og elektroporering av et luciferase-genet tillot kontroll av de transfekterte cellene postnatalt etter intraperitoneal injeksjon luciferin i bedøvet levende P7 pup ved in vivo bioluminescens, ved hjelp av en IVIS spektrum enhet med 3D kvantifisering programvare.

DISC1 genet i rotte cortex ført til amfetamin overfølsomhet. Kotransfiseres GFP kunne påvises i nevroner etter post mortem fluorescens mikroskopi i cryosections indikerer genuttrykk stede på ≥ 6 måneder etter fødselen.

Vi konkluderer med at postnatal Bioluminescens bildebehandling tillater evaluere suksessen til forbigående transfections med iue hos rotter. Undersøkelser på påvirkning av aktuelle genet manipulasjoner under neurodevelopment på den voksne hjernen og dens tilkobling er mye lettere. For mange vitenskapelige spørsmål, kan denne teknikken supplere eller erstatte bruk av transgene rotter og gi en ny teknologi for atferdsnevrovitenskap.

Introduction

Utviklingen av den i utero electroporation (iue) metode som lar en modulering av genekspresjon i utviklingen av hjernen, har vært et gjennombrudd fordi det aktivert studere neurodevelopment med relativ letthet. 1-7 Endringer i uttrykk nivåer av et mål gen i en bestemt hjernen regionen under embryonal og / eller perinatal utvikling hos gnagere ble demonstrert til kritisk innflytelse nevronale spredning, migrasjon, arborization, og tilkoblingsmuligheter. 8-10

Schizofreni er en kompleks mental sykdom med akutte og kroniske symptomer som er relatert til nevrologiske abnormiteter 11, 12 og derfor er mange av de identifiserte kandidatgener for schizofreni er undersøkt for potensielle stimulerende effekter på neurodevelopment, som for eksempel for den forstyrret-in-schizofreni -1 (DISC1) genet 13-15.

Hjernens utvikling er regulerted av genetiske faktorer og deres samspill med miljøet som spiller roller i pre-, peri-og postnatal utviklingsperioder. En stor genetiske risikofaktoren for forskjellige adferdsforstyrrelser er de DISC1 16 genet. DISC1 knockdown fører til migrasjon defekter i mus 13, 17, og manipulering av DISC1 ekspresjon i den tredje cortex ved IUE har vist seg å påvirke virkemåten til voksne mus 18.

Manipulere hjernen genuttrykk ved iue har flere fordeler 19 over generasjon av transgene dyr linjer. Først, er genuttrykk innenfor områder av interesse oppnådd i løpet av uker til måneder i stedet for flere generasjoner av avl transgene gnager linjer. For det andre er kompensatoriske mekanismer under tidlig utvikling som kan skjerme for fenotyper i germline-konstruert dyr 20 unngått. Tredje, gjennom målretting bare en bestemt cellepopulasjon eller bestemt område av hjernen, migratipå eller spredning forskjellene kan direkte sammenliknet med ikke-mutant eller styre motsatt side hvis ensidige electroporations er valgt. På den annen side, ikke IUE ikke nøyaktigheten av promoter-drevet cre / lox-indusert tidspunkt for ekspresjon, og bare en subpopulasjon av celler innen et visst område er rettet fører til en mosaikk form av genekspresjon mønster.

For mange eksperimentelle anvendelser i voksne rotter, kan en forbigående transfeksjon av et begrenset antall celler i et hjerne-regionen være tilstrekkelig, eller til og med ønskelig, slik at den store fordelen av stabile, germline-transgen gnagere er ubetydelig. Faktisk er iue nyttig å undersøke om noen unormalt utviklede celler kan påvirke et helt nettverk av celler eller kretser. En annen fordel kan være evnen til å påvise ikke-celle-autonome virkninger av et gen på grunn av den mosaikk arten av treffet. Videre er den generasjonen av transgene og knockout rotter fortsatt i sin barndom og brukav iue i denne arten for å studere avvik hjernens utvikling konsekvensene er av høy interesse.

Så langt, er et stort hinder for å bruke iue for å undersøke intervensjons konsekvenser i de dyrene som voksne mangel på overvåking elektroporering suksess. Hittil GFP-co-transfektert fluorescerende nevroner i live nyfødte rotteunger ble ikke detektert under en passende kikkert fluorescens mikroskop eller med fluorescens-avbildning av IVIS spektrum.

For å overkomme denne hindringen, vi kotransfiseres en luciferase reporter gen og utført Bioluminescens direkte avbildning av unger etter 3-dimensjonale (3D) kvantifisering av iue hjerneområde.

Som et eksempel for å demonstrere anvendeligheten av denne metode i en senere funksjonelt assay tester nevrologiske genetisk manipulering, et ko-injeksjon av plasmider inneholdende human DISC1, luciferase, og GFP inn i den laterale ventrikkel i rotteembryoer in vivo, ble et fast stoff bioluminesens signal utledet fra luciferin metabolisme av co-transfektert luciferase genet detektert opp til fem uker etter fødselen. 3D-målinger av electroporated hjernen området tillatt kvantifisering der unger med manglende eller feilplassert elektroporering ble identifisert fra begynnelsen, og dermed, slik at tildeling av IUE dyr (genet av interesse og egge kontroll) til eksperimentelle grupper med matchet electroporated hjernen områder med lav variabilitet . Bruken av voksne IUE rotter i atferds paradigmer ble vist som et eksempel på nytten av denne protokoll.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av den ansvarlige Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301) i samsvar med nasjonale og europeisk lovgivning.

En. In utero Electroporation

Denne fremgangsmåte er blitt beskrevet i detalj i Jove for rotte ved Walantus et al. Tre, samt Rice et al. 4 og er her bare kort oppsummert. En kullstørrelse på 6-8 valper gir et godt resultat. Det bør være minst to ikke-electroporated embryoer for å øke den totale overlevelse (se nedenfor).

  1. Forbered DNA-blanding som inneholder 1,5 mikrogram / ​​mL av target-Plasmid (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 overekspresjon: pCAX 21), 0,5 mikrogram / ​​mL Luciferase inneholder Plasmid (pCAX), 0,5 mikrogram / ​​mL GFP inneholder plasmid (pCAGGS 22) i 1x PBS løsning farget lys blue med Fast grønt fargestoff.
  2. Forbered injeksjonsnåler ut av glasskapillærer med en Needle Pipette avtrekker. Og sterilisere kirurgiske instrumenter enten ved autoklavering eller inkubasjon med et alkoholbasert desinfeksjonsmiddel (kodan Tinktur forte).
  3. Administrer en preoperativ dose av buprenorfin (0,05 mg / kg) 15 minutter før operasjonen til en gravid rotte 16 dager etter befruktning (E16). Deretter anesthetize dyret i en isofluran kammer.
    1. Ved anestesi, plassere rotte i en liggende stilling på en 37 ° C-varmet operasjonsbordet med pustemaske koblet til anestesi-enhet, ved hjelp av oksygen innstilling på 0,4 L / min og isofluran på 1,8%.
    2. Etter barbering magen, desinfisere det barberte området tre ganger med kodan Tinktur Forte (en alkoholbasert desinfeksjonsmiddel).
    3. Dekk rotte med sterile kluter, utsette bare barbert operasjonsfelt.
  4. Utfør in utero electroporation.
    1. Skjær magen med en pedikyr langs linea alba (~ 2 cm).
    2. Expose livmor horn nøye med en ring tang.
    3. Pass på å holde livmor veggen våt med varmet sterile PBS under hele operasjonen.
    4. Injiser DNA-løsning med en tynn glass nål inn i en av de laterale ventrikkel av embryoene.
    5. Plasser 7 mm elektrode rundt hodet av embryoet. Å treffe en cellepopulasjon av øvre cortical lag, utføre iue på E16 23 og plassere den positive elektroden på halvkule over den injiserte ventrikkel med en liten rygg / lateral tendens. For å målrette hippocampus celler endre den positive elektrodeplasseringen til den motsatte siden enn det injiserte ventrikkel med sideveis til svakt dorsal retning (fig. 1).
    6. Utfør elektroporering av fem 50 msek pulser på 55 V med 950 msek bryter med en firkantet bølge puls electroporator.
    7. Reserve første embryo ved vaginal ende av hver uterus horn for å øke than sjansene for overlevelse av alle embryoer.
    8. Sett livmor horn tilbake i moder rotte.
    9. Stich bukveggen opp med en absorberbare Vicryl kirurgisk sutur materiale.
    10. Lukk huden med Vicryl sutur materiale eller med sutur klipp.
    11. Plasser mor rotte tilbake i hjemmet buret og holde den varm for 2-3 hr.
    12. Hold rottene alene i sitt hjem bur i dyre anlegget rom og mate ad libitum. De føder mellom E22-24.
    13. Hold rotteunger med sin mor i tre uker og skille dem etterpå av kjønn.

2. Bioluminesens Levende Imaging av den enzymatiske Luciferase Reaction

Denne metoden er benyttet for å analysere posisjonen til i utero transfekterte celler. Co-electroporated ildflueluciferase cDNA er oversatt til aktiv luciferase, som ved metabolizing D-luciferin å oxyluciferin, sender ut et foton (figur 2 (figur 4).

I denne studien ble luciferase assay og Bioluminescens bildebehandling utført starter på P7. Denne gangen punktet ble valgt å tillate mor og valper for å komme seg fra fødselen stress. Når først jobbe med valpene på P0, var overlevelse av unger hardt rammet ved at valpene ble funnet døde eller spist av moren.

I første omgang blir rotteunger med vellykket electroporation identifisert av en 2D-Bioluminescens bilde med en eksponeringstid på tre minutter. Deretter er positive unger som brukes for å lage 3D-bilder for å angi plasseringen av electroporated området.

  1. Fortynn D-luciferin-natriumsalt i PBS til en konsentrasjon på 15 mg / ml og steriliseres ved filtrering gjennom et sterilt sprøytefilter.
  2. Vei valpene.
  3. Ta valpen i den ene hånden med magen på toppen og strekke magen litt. Injiser 10 mL / g kroppsvekt på luciferin-løsning intraperitonealt. For eldre og mer smidige seg, pre-anaesthetize valpene med isofluran i induksjonskammeret før injisere luciferin.
  4. Slå på isofluran tilstrømningen av XGI-8 Gas Anesthesia System innenfor IVIS Spectrum med 3% isofluran.
  5. Sett snuten på dyret inn i glass nese kjegler i Anesthesia System.
  6. Hold dyret i en utsatt stilling inntil den er i dyp anestesi (2-3 min). Deretter redusere isofluran tilstrømningen til 1,5%.
  7. Velg en 2D-Bioluminescens måling for å velge positive unger fra hele kullet. Bruk følgende innstillinger
    Screen 1
    Klikk her for å se større figur .
    1. Sett en Checkmark på Photograph med middels binning og F / stopp på 8, tar kameraet et bilde ovenfra etter start målingen.
    2. Sett Eksitasjon filter: blokk.
    3. Sett Emission filter: åpen.
    4. Sett Binning til medium.
    5. Sett F / stopp på en.
    6. Sett Stage nivå A.
    7. Sett luminescence eksponeringstid til 180 sek.
  8. For etablering av 3D-bilder for bedre å kunne kvantifisere electroporated området fra de positive unger, kan du bruke følgende innstillinger DLIT for ildflueluciferase.
    Screen 3
    Klikk her for å se større figur .
    1. Sett en hake på Photograph, kameraet tar et bilde ovenfra etter start målingen.
    2. Sett en hake på struktur, overflaten på dyret skannes av IVIS før Bioluminescens måling.
    3. Use følgende utslipps filtre og eksponering tidsinnstillingene til fylte to uker:
      Utslipp filter 1: 590 nm, eksponeringstid 300 sek
      Utslipp filter 2: 600 nm, eksponeringstid 240 sek
      Utslipp filter 3: 620 nm, eksponeringstid 180 sek
      Utslipp filter 4: 640 nm, eksponeringstid 120 sek
      For rotter eldre enn P20
      Utslipp filter 1: 600 nm, eksponeringstid 300 sek
      Utslipp filter 2: 620 nm, eksponeringstid 300 sek
      Utslipp filter 3: 640 nm, eksponeringstid 300 sek
      Screen 3
      Klikk her for å se større figur .
      På grunn av reduksjon i signalstyrken i eldre dyr, blir eksponeringstiden forstørret for de tre beste emisjonsfiltre.
    4. Sett Stage nivå B
    5. Sett Binning til medium.
    6. Sett F / Stopp ved en
  9. Etter måling, mar k rottene ved en earhole kode for å skille dem fra hverandre, og for å matche dem til IVIS Levende Imaging bilder
  10. Ved slutten av måleprosedyren, slå av isofluran tilstrømningen og holde rat på den varme plate i noen minutter før retur til sin bur.

Tre. Analyse av bioluminescence Images

Den generasjonen av 3D-bilder, 3D-filmer og kvantifisering av volumet av signalkilden er laget av levende bilde programvaren forhåndsinstallert på IVIS Spectrum.

  1. Generering av 3D-bilder
    1. Først rekonstruere en overflate topografi, og derfor sette terskelen mellom 20-30%.
      Screen 4
      Klikk her for å se større figur .
      Screen 5
      een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/>
    2. Begynn DLIT 3D rekonstruksjon med en bildegrense på 10% for hver bølgelengde.
      Skjerm 7
      Klikk her for å se større figur .
      Screen 8
      Klikk her for å se større figur .
      Screen 9
      Klikk her for å se større figur .
    3. Lag 3D-filmer ved hjelp av animere knappen innen 3D-verktøylinjen.
    4. Velg forskjellige orienteringer av 3D-bildet, samt zooming synspunkter som viktige rammer og trykk på "Record & #39; knappen, innspilling overgangen fra en posisjon / orientering til en annen.
      Skjerm 10
      Klikk her for å se større figur .

4. Behavioral Testing

Behavioral testing ble utført for å finne ut om iue-mediert genet manipulasjoner i rotte kan initiere langsiktige virkninger som vedvarer inn i voksenlivet. I det foreliggende tilfellet, effekten av transient, unilateral full lengde human DISC1 kortikale overekspresjon etter IUE ble undersøkt ved å teste bevegelse i et åpent felt (OF), med og uten en lav dose av amfetamin, som en spesifikk test for dopamin-relaterte atferd 24. I en tilsvarende prosedyre utføres av Niwa et al. I IUE mus ved hjelp DISC1 knockdown, IUE mus, men ikke kontroller viste overfølsomhettil amfetamin 18.

Rotter som ble in utero electroporated med en DISC1 overekspresjon vektor ble holdt under laboratorieforhold med 12 timers lys fra 7 am til 19:00 og ble matet ad libitum. Ved tre måneders alder, rotter gikk atferds testing.

For å kvantifisere locomotion som en avlesning av amfetamin effekter, et åpent felt av en Tru Scan aktivitet systemet som ligger i et lyd-og lys-isolert kammer ble brukt. Dette systemet måler varigheten tid og avstand dyret beveger seg, tid og distanse tilbrakt i margen eller midten av det åpne feltet, samt å oppdra oppførsel 25.

  1. På den første dagen, teste etter saltvann injeksjon
    1. Vei dyrene.
    2. Injiser intraperitonealt 1 mL / g kroppsvekt av en saltoppløsning (1 x PBS).
    3. Rett etter injeksjonen løp dyret inn i det åpne felt og starte måling av TruScan system. Rekord for 15 min end dele dataene inn i 3 x 5 min deler.
    4. Sett dyret tilbake til sitt hjem buret.
  2. Andre dag, test på amfetamin injeksjon
    1. Vei dyrene.
    2. Injiser intraperitonealt 1 mL / g kroppsvekt av en 0,5 mg / ml amfetamin-løsning.
    3. Rett etter injeksjonen løp dyret inn i det åpne felt og starte måling av TruScan system. Element i 15 min, og dele dataene inn i 3 x 5 min deler.
    4. Returner dyret til sitt hjem buret.
  3. Analyser locomotion og oppdrett atferd generert av spesifikke Tru Scan-programvare. Lag en graf med GraphPad (Prism) og beregne statistikk av SPSS Statistikk programvare.

Representative Results

Fig. 3 viser direkte avbildning målinger av tre rotteunger ved P7 etter injeksjon av 150 mg luciferin / kg kroppsvekt. Forskjeller i signalstyrke indikerer variasjonen i effektiviteten av IUE er synlige. Sterke Bioluminescens signalene ble registrert til P36 (figur 4).figur 5, er evnen til å definere kortikale (figurene 5A og 5C) og hippocampus (figurene 5B og 5D) elektroporering ved bioluminescens avbildning avbildet. Korrelasjon av Bioluminescens signal (figur 7A) med den fluorescens-signal etter å skalle fjerning (figur 7B), og de ​​tilsvarende GFP-electroporated celler i cryosectioned hjerne (figur 8) ved P14 er avbildet i figurene 6-8. Til opplysning, var det ikke noe deteksjon av en fluorescens-signal i levende rotter som helst punkt.

telt "> In vivo Bioluminescens bildebehandling gir omtrentlig diskriminering av ulike electroporated hjernen områder av 2D (figur 5A og 5B) som er kraftig forbedret med DLIT program av IVIS Spectrum programvaren genererer 3D-bilder (Tall 5C og 5D). I de viste eksempler , elektroporering av den prefrontale cortex og hippocampus kan skilles fra hverandre. Det skal bemerkes at mens formål å electroporate hippocampus, noen stamceller for cortex liggende dorsal hippocampus kan også være truffet (figur 7).

Rotter ensidig i utero electroporated med pCAX vektor inn i cortex og senere overekspresjon full lengde menneskelige DISC1 ble undersøkt for både spontane og amfetamin-indusert hyperaktivitet som voksne. Rotter electroporated med pCAX-DISC1 var overfølsom til en lav dose amfetamin. Disse rottene flyttet betydelig more etter amfetamin behandling enn i det til saltvann injeksjon, mens kontrolldyrene ikke (figur 10).

Figur 1
Figur 1. Ordningen med elektrode posisjon for A) cortex elektroporering og B) hippocampus elektroporering, grønn = injisert DNA-Mix innenfor ventrikkelen.

Fig. 2
Figur 2. Luciferase reaksjon.

Figur 3
Figur 3. Luminescence måling av P7 rotter etter injeksjon av 150 mg / kg kroppsvekt luciferine; eksponeringstid 180 sek; A) rotte uten luminescens signal; B) rotte med en svak bioluminesens signal, c) rotter med en sterk luminescens signal.

Figur 4
Figur 4. Tids linje med påfølgende bioluminesens målinger av den samme rotte etter injeksjon av 150 mg / kg luciferine demonstrerer en større tidsvindu der IUE suksess kan bli detektert.

Figur 5
. Figur 5 Illustrasjon av forskjeller mellom kortikale og hippocampus elektroporering på P7 A) og B) 2D-bilder;. C) og D) 3D-bilder, A) og C) fra cortex, B) og D) fra hippocampus.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Klikk her for å se større figur.

Figur 6
Figur 6. Illustrasjon av E16 hippocampus elektroporering av en rotteavkom ved P14 A) 2D-bilde av bioluminescence B) 3D illustrasjon av Bioluminescens signal C) dissekert hjernen med Bioluminescens signal D) hjerne med GFP epi-fluorescens signal. Klikk her for å se større figur .

Figur 7
Figur 7. Detalj av et fluorescens-bilde fra en 20 mikrometer cryo-delen av den samme P14 rottehjerne elektroporert med GFP inneholdende plasmid og luciferasevektor, atomkjerner flekker med DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = dentate gyrus, FC = Fasciolarum cinereum.

Video 1. 3D-animasjon av en hippocampus elektroporert rotte på P14.

Figur 8
Figur 8. Amfetamin test ordningen: første dag saltvann injeksjon før 15 min rettssaken, 24 timer senere amfetamin injeksjon før testing i det åpne feltet kammeret.

Figur 9
Figur 9. Amfetamin test. Søylediagram som viser flyttet avstand (i cm) av dyret registrert av en TrueScan system over 15 min Hvite søyler = kontrollgruppe;. Grå streker = DISC1 overekspresjon gruppe; kontrollgruppe n = 10; DISC1 overekspresjon gruppe n = 11; ANOVA: Geno * behandling p = 0,043, T-test for total tid saltvann vs amfetamin ns = ikke signifikant pcontrol = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

Vårt studium viser at IUE er egnet til å generere voksne rotter med nevroner uttrykke et transgen i en selektiv område av hjernen, og at, som et resultat av dette inngrep, disse dyrene oppviser endringer i oppførsel som indikerer funksjonaliteten til utførte manipulasjon. I denne studien, som et eksempel, rotter overekspresjon DISC1 unilateralt i en liten del av den prefrontale cortex viste overfølsomhet mot amfetamin (figur 9).

Velge rotter for elektroporering suksess ved in vivo Bioluminescens bildebehandling var effektiv i å kontrollere for den iboende variabilitet iue celle transfeksjon og ble brukt til å generere grupper med en homogen iue område med lav inter-individuell variabilitet for senere undersøkelser.

I denne studien, var vi ikke i stand til å velge elektroporert valper fra kullet ved påvisning av co-electroporated GFP-indusert fluorescens i den nyfødte dyr, selv thohuff på samme tid og i samme dyr en Bioluminescens signalet fra like co-electroporated luciferase kunne påvises etter luciferin injeksjon (figur 6), og som uttrykker GFP neuroner var fortsatt til stede i hjernen til en alder på seks måneder. Vi konkluderer med at det i rotte, er luciferase / luciferin reaksjonen godt egnet til å skille dyr med vellykkede electroporated hjerne (figur 3).

Den kvantitative overvåking av IUE suksess vedrører styrken Bioluminescens signal som er målt ved de tellinger av fotoner innenfor samme eksponeringstid (figur 3), og tilsvarer den enzymatiske aktivitet av co-uttrykt luciferase. Små Bioluminescens signaler kan påvises ved 100-200 tilfeller av fotoner, og, på en utstråling av ~ 1x10 4 fotoner / sek / cm 2 / steradian showet 1000-2000 GFP-farget celler i histologi i seks måneder gamle rottehjernen. Den høyeste signal displegges en utstråling av opptil ~ 5x10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian og ~ 64 000 tellinger.

I Sprague Dawley rotte belastning anvendes, observerte vi en svekkelse av Bioluminescens signal i lengderetningen med økende alder, og signalet forsvant utover fylte P35 (figur 4). På dette punktet, vet vi ikke om enten forbigående, plasmidvektor baserte uttrykk for luciferase reduseres, eller hvis Bioluminescens signalet svekkes på grunn av økende hjernemasse, eller begge er årsakene til den forsvinner signalet. For den foreliggende funksjonelt assay i voksne rotter, ble seleksjonen for Adferdsstudier bare laget basert på plasseringen av signalet, men ikke av signalstyrke Bioluminescens.

Selv om 3D kvantitativ Bioluminescens overvåking tillatt differensiering mellom ulike electroporated områder (figur 5), var dens accurateness begrenset til celler som ligger i dybden kronension av hjernen. Figur 6 viser et eksempel på en hippocampal electroporation hvor Bioluminescens målingen i 2D-og 3D-bilde indikerte en god posisjonering av elektroporering. I dissekert post mortem hjernen, ble en GFP-fluorescens signal oppdages på omtrent samme posisjon som Bioluminescens signal, som indikerer riktig målretting av hippocampus. Men histologiske viser også at cellene i cortex dorsal hippocampus hadde blitt rettet (fig. 7). Dette indikerer at Bioluminescens analysen er et nyttig verktøy for å oppdage positive, IUE valper, og også å ha en idé om electroporated området, men til syvende og sist kan bildebehandling ikke erstatte post mortem histologi å nøyaktig lokalisere positivt målrettede celler.

Vår demonstrasjon viser løftet for anvendelsen av iue teknologi for å generere subtile målrettede manipulasjoner av kortikale eller hippocampus områder av hjernen til å simulere aberrances i cortical migrasjon eller andre nevrologiske defekter som kan påvirke den voksne dyr. Mens bilateral electroporation 26 har fordelen av en større sannsynlig effekt på virkemåten, er det også mer dødelighet av embryoer. Unilateral elektroporering ble valgt for å sammenligne de to halvkuler med en som en intern kontroll, og for å vise at selv IUE manipulering i en ensidig, lite område er tilstrekkelig til å endre virkemåten. Iue-induserte endringer i tilkobling eller arkitektur mellom nevroner kan dermed fremkalles uten fremkaller en lesjon og den nødvendige kampen i å-være-iue-manipulert regionen med den aktuelle atferds testen er avhengig av vitenskapelige spørsmål.

Feilsøking

Redusert kullstørrelse Det er flere forslag om å øke overlevelsen av de IUE valpene. Først, ved bruk av meget tynne glasskapillærer på elektroporering for å minimalisere vevet lesion er anbefalt. For det andre, ikke electroporate den første embryo ved vaginal slutten av hver livmor horn: døden av den førstefødte fosteret øker sjansene for en abort av alle andre embryoer. Tredje, etter fødselen, mor rotter ofte drepe en del av deres avkom på grunn av perinatal stress. For å redusere ekstra stress, ikke begynn med direkte avbildning rett etter fødselen, men vente i sju dager.

GFP-fluorescens deteksjon av valpene

På en uke etter fødsel, noe signal av fluorescens ved enten å bruke levende kikkert fluorescens mikroskopisk bildebehandling eller fluorescens bildebehandling med IVIS Spectrum (epifluorescence og transfluorescence moduser; for GFP eksitasjon / utslipp: 465/520 nm og 500/540 nm). Det er mulig at både den begrensede overføring av kort bølgelengde eksitasjon og emisjon lys gjennom vevet som skallen og den høye autofluorescens bakgrunn av huden hindre ved hjelp av fluorescens under described forholdene i rotte. Som vist i figur 6, kan den luciferase-signalet i det levende dyr, som også kan påvises i den dissekerte hjerne (uten skallen) og der også en fluorescens-signalet er påvisbar (figur 6D).

Differensiering av bioluminescence i tett linjeavstand hjerneområder

Selv i 3D-illustrasjon av plasseringen av Bioluminescens område som ikke kan forutsies til 100%. Spesielt celler oppå eller under av den anslåtte området kan også være et uhell målrettet og transfektert. Den nøyaktige posisjon må bli kontrollert av post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).

Disclosures

Forfatterne av denne studien ikke har økonomisk interesse i denne studien, og har ikke blitt sponset av industrien for denne studien. Åpen tilgang avgifter ble overdratt fra PerkinElmer Inc. innlegget publikasjonen.

Acknowledgments

Forfatterne takker Tracy Young-Pearse og Atsushi Kamiya for å gi plasmider.

Dette arbeidet ble finansiert av Neuron-Eranet Discover til OR og CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CK, og (DE 792/2-4) til MASS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors - sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O
100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  2. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  3. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
  4. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
  5. Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  7. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
  8. Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  10. Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
  11. Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
  12. Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder? British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
  13. Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
  14. Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
  15. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
  16. Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  17. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
  18. Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
  19. Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. 169-179 (2012).
  20. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
  21. Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
  22. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
  23. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
  24. Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
  25. Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
  26. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
Generering av Topically Transgene Rats etter<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminesens Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).More

Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter