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Neuroscience

केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र में एकल कक्षों के लेबल Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एकल न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए एक तकनीक (सीएनएस) उपस्थित

Abstract

हम इस लेख में वर्णन कैसे व्यक्तिगत रूप ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर lipophilic फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर DiI juxtacellular इंजेक्शन द्वारा भ्रूण सीएनएस में न्यूरॉन्स लेबल. इस विधि महान विस्तार में neuronal सेल morphology के दृश्य की अनुमति देता है. यह CNS में किसी भी सेल लेबल के लिए संभव है: लक्ष्य न्यूरॉन्स की कोशिका निकायों डीआईसी प्रकाशिकी के तहत या GFP के रूप में एक फ्लोरोसेंट आनुवंशिक मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं. लेबलिंग के बाद, DiI photoconversion द्वारा एक स्थायी दाग ​​भूरे रंग में तब्दील किया जा सकता है प्रेषित प्रकाश और डीआईसी प्रकाशिकी के साथ सेल आकारिकी के दृश्य की अनुमति. वैकल्पिक रूप से, DiI लेबल कोशिकाओं confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सीधे देखा जा सकता है, आनुवंशिक रूप से शुरू की फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन colocalised जा करने के लिए सक्षम है. तकनीक किसी भी जानवर में इस्तेमाल किया जा सकता है, जीनोटाइप के बावजूद, यह एकल कक्ष संकल्प संभव उत्परिवर्ती phenotypes का विश्लेषण करने के लिए कर रही है.

Introduction

Neuronal आकारिकी व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर ज्ञान neuronal कनेक्टिविटी और CNS समारोह को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. इस प्रकार, तंत्रिका विज्ञान के जल्द से जल्द दिनों से, शोधकर्ताओं ने एकल कक्ष लेबलिंग तकनीक (इस मुद्दे का एक ऐतिहासिक उपचार के लिए 7 देखें) को विकसित करने की मांग की है. Golgi धुंधला हो जाना जैसे शास्त्रीय तरीकों neuronal आकारिकी उत्कृष्ट संकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन उपयुक्त है अगर एक एक निर्देश रास्ते में न्यूरॉन के एक विशेष प्रकार के लेबल, के रूप में धुंधला हो जाना एक यादृच्छिक फैशन में होता है चाहता है नहीं कर रहे हैं. intracellular या एक microelectrode से रंगों का juxtacellular इंजेक्शन द्वारा एकल कक्षों को धुंधला करने के लिए तरीकों के विकास के विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता को संबोधित किया.

एकल न्यूरॉन डाई इंजेक्शन के ड्रोसोफिला के लिए आवेदन दोनों जीव और उसके न्यूरॉन्स के छोटे आकार की वजह से एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत किया. बहरहाल, भ्रूण ड्रोसोफिला के एकल न्यूरॉन धुंधला हो जाना 15 की प्रयोगशाला में हासिल की थी. जबकि विधि खासे उपयोगी किया गया है और ड्रोसोफिला में पिछले 20-30 साल (2 उदाहरण के लिए, 10) पर neuronal विकास के लिए तंत्र में कुछ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, कई कार्यकर्ताओं दूर से बचते रहे हैं मोटे तौर पर अपनी तकनीकी मांग की वजह से है.

ड्रोसोफिला में neuronal लेबलिंग के लिए आनुवंशिक तकनीक के और हाल के वर्षों में उपलब्धता भी एकल न्यूरॉन डाई इंजेक्शन की अलोकप्रियता के लिए योगदान दिया है. लक्षित GFP constructs झिल्ली GAL4 निर्देशित अभिव्यक्ति तंत्रिका आकारिकी 1, 20 के उत्कृष्ट संकल्प प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, इस पद्धति कुछ सीमाएँ हैं: अक्सर कई कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति अपरिहार्य व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की संरचना अस्पष्ट और एक GAL4 ड्राइवर लाइन ब्याज की एक विशेष न्यूरॉन में अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है. (MARCM एक प्रतिनिधि के साथ मोज़ेक विश्लेषणressible सेल मार्कर) 8 विधि व्यक्तिगत स्तर पर सेल अनिवार्य रूप से किसी भी न्यूरॉन की लेबलिंग, लेकिन और GAL80 प्रोटीन की धीमी गति से कारोबार की वजह से जल्दी लार्वा भ्रूण में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया नहीं कर सकते हैं प्रदान कर सकते हैं.

आनुवंशिक लेबलिंग की इन सीमाओं को देखते हुए, हम मानते हैं कि ड्रोसोफिला भ्रूण में न्यूरॉन डाई इंजेक्शन एक मूल्यवान तकनीक बनी हुई है और व्यापक आवेदन मिलना चाहिए. इस लक्ष्य को बढ़ावा देने के लिए, हम यहाँ विधि का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराते हैं. अपनी शक्ति का एक उदाहरण हमारे देर ड्रोसोफिला 14 भ्रूण के पेट neuromeres में interneurons का पूरा सेट की आकारिकी की हाल ही में खाते द्वारा प्रदान की जाती है. इस अध्ययन है, जो व्यक्ति neuronal सेल प्रकार के दोनों morphological परिवर्तनशीलता और भ्रूण के CNS में neuromere संगठन के सिद्धांतों से पता चला किसी भी वर्तमान में उपलब्ध अन्य लेबलिंग विधि के साथ संभव नहीं होता है.

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Protocol

हम हमारी प्रयोगशालाओं में एकल न्यूरॉन लेबलिंग विधि के दो अलग वेरिएंट का इस्तेमाल किया है. मतभेद भ्रूण संग्रह, dechorionisation, devitellinisation और भ्रूण filleting कदम से संबंधित चित्रा 1 वेरिएंट के आम और diverging कदम के एक सिंहावलोकन देता है.

1. सूक्ष्म सुई की भ्रूण और डाई इंजेक्शन के लिए विच्छेदन micropipettes के लिए तैयार

  1. भ्रूण विच्छेदन के लिए ग्लास सुई कांच capillaries (1 मिमी व्यास और 0.1 मिमी दीवार मोटाई) से Sutter डांड़ी विज्ञान (उपकरण) या तुलनीय उपकरण के साथ तैयार कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, एक electrolytically बढ़ाई 0.15 मिमी टंगस्टन एक सुई धारक में घुड़सवार तार dissections के लिए प्रयोग किया जाता है. (Electrolytic लिए निर्देश sharpening 9 में दिए गए हैं).
  2. एक Sutter डांड़ी (विज्ञान, डाई इंजेक्शन micropipettes पतली दीवारों कांच capillaries से आंतरिक filaments (जीबी 100 TF 8P विज्ञान उत्पाद) के साथ तैयार कर रहे हैं) उपकरण या तुलनीय उपकरण. micropipette टिप करने के लिए तेजी से एक क्रमिक, पिंडली की वर्दी घटना भ्रूण के ऊतकों के माध्यम से पारित होने के सहायता के साथ, की जरूरत है. वांछित micropipette "उच्च प्रतिरोध microelectrode, तीव्र और लंबी" किस्म, के रूप में p.20 Sutter साधन पिपेट रसोई की किताब पुस्तिका (वर्णित http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). आम तौर पर, micropipettes शीघ्र ही खींच रहे हैं पहले इंजेक्शन के लिए उनके सुझावों को सुनिश्चित करने के तेज और स्वच्छ रहने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.

2. संग्रह, बढ़ते और भ्रूण के विच्छेदन

  1. भ्रूण संग्रह. हम सफलतापूर्वक न्यूरॉन इंजेक्शन विधि का इस्तेमाल किया है, भ्रूण में यहाँ वर्णित 12 चरणों से 3 17. भ्रूण उत्तरोत्तर 17 चरण के दौरान एक छल्ली विकास और तेजी को काटना मुश्किल हो गया है. दो वैकल्पिक तरीकों के लिए उन्हें प्राप्त करने के लिए उपलब्ध हैंएक विशेष विकास मंच पर bryos.
    1. मक्खियों रातोंरात सेब का रस अगर खमीर पेस्ट के साथ लेपित प्लेट पर अंडे देना करने की अनुमति दें. अंडा संग्रह के तापमान को समायोजित करने के लिए इंजेक्शन अगले दिन की योजना बनाई समय के अनुरूप है. सभी अंडे अगले दिन ले लीजिए और वांछित morphological मापदंड 3 का उपयोग करते हुए मंच पर भ्रूण का चयन करें.
    2. मक्खियों अगर प्लेटों पर इसके बाद के संस्करण के रूप में रखना है, लेकिन 25 में एक ताजा हर 1.5 घंटे एक डिग्री सेल्सियस के साथ अगर प्लेट स्वैप की अनुमति दें निर्धारित समय अवधि के लिए एक थाली सेते हैं, जब तक भ्रूण तक पहुँच चुके हैं विकास मंच की आवश्यकता है.
    1. रासायनिक Dechorionation. एक धातु रंग का उपयोग करने के लिए अगर बंद भ्रूण परिमार्जन और उन्हें एक गिलास पोत युक्त लगभग 10 मिलीलीटर ड्रोसोफिला घंटी या फास्फेट buffered खारा (पीबीएस) समाधान (जैसे पेट्री डिश या गुहा ब्लॉक) में स्थानांतरित करने के लिए. केंद्रित ब्लीच की कुछ बूँदें जोड़ें और एक पर कुछ मिनट के लिए को उत्तेजित करना हैभ्रूण बंद जरायु sloughs तक रोटरी मंच. घंटी / पीबीएस के कई परिवर्तन में भ्रूण धोने जब तक वहाँ अवशिष्ट ब्लीच का कोई गंध है. इन washes के दौरान यह सुनिश्चित करें कि भ्रूण तरल सतह के साथ संपर्क में नहीं आते हैं. अन्यथा, वे तैरने लगते हैं और बाद में हेरफेर डूब करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. वैकल्पिक रूप से, रासायनिक dechorionation टोकरी 4 द्वारा वर्णित तकनीक का उपयोग किया जा सकता है.
    2. यांत्रिक dechorionation (चित्र देखें 2, 1-4 कदम) स्थानांतरण भ्रूण अगर थाली से एक डबल पक्षीय चिपचिपा टेप के साथ कवर स्लाइड. भ्रूण के साथ अगर स्थानांतरित के रूप में यह उनके टेप करने के लिए आसंजन के साथ हस्तक्षेप करेगा से बचें. भ्रूण 5 से 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें जब तक गर्भवष्ट थोड़ा भंगुर हो जाता है. (प्रतीक्षा करते हुए, कोट coverslip गोंद के साथ बाद में devitellinisation के लिए आवश्यक - 2.3B नीचे देखें). एक सुई के साथ प्रत्येक भ्रूण धीरे स्पर्श. जरायु खुले विभाजित और भ्रूण पूर्वोत्तर के लिए रहना होगाedle. तुरंत एक अगर सुखाने को रोकने के लिए और एक पंक्ति में उनमें से 10 के बारे में उनके उदर को सामना करना पड़ रहा पक्षों के साथ तालमेल, ब्लॉक स्थानांतरण भ्रूण.

Devitellinisation और filleting मैन्युअल दो 2.3A और 2.3B में वर्णित विधियों से किसी का उपयोग किया जाता है.

    1. घंटी समाधान के पकवान से एक माइक्रोस्कोप पूर्व तैयार स्लाइड पर एक सिलिकॉन बांध में घंटी की कई बूँदें उपयुक्त विकास मंच की एक एकल dechorionated भ्रूण स्थानांतरण. (सिलिकॉन सीलेंट के एक खुर्दबीन स्लाइड पर एक पतली परत smearing से एक 3 सेमी वर्ग बांध तो बांध के केंद्र के लिए 0.01% समाधान पाली एल lysine की एक बूंद जोड़ने के 24 घंटे के लिए सिलिकॉन का इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं.) एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ भ्रूण स्थानांतरण, यह सुनिश्चित करना है कि भ्रूण के स्थानान्तरण के दौरान घंटी की सतह के नीचे रहता है.
      ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण के पीछे अंत संभालो, जबकि squeez धीरेआईएनजी भ्रूण ठीक iridectomy कैंची की एक जोड़ी के साथ, एक चौथाई के बारे में अपने पूर्वकाल अंत से वापस तरीका है. भ्रूण के माध्यम से कटौती सही नहीं है. उद्देश्य सिर्फ खुला पीतक झिल्ली दरार जबकि भ्रूण को कम से कम नुकसान के कारण है. स्थिति में अब भी संदंश के साथ, एक टंगस्टन सुई का उपयोग भ्रूण को कम करने के लिए बाहर खोला झिल्ली और स्थिति की स्लाइड पर यह उदर पक्ष नीचे. भ्रूण कोट पाली lysine रहना चाहिए.
      एक तेज टंगस्टन सुई के साथ पट्टिका भ्रूण. धीरे सालना, तो पृष्ठीय midline साथ शरीर दीवार आंसू. सुई का प्रयोग, शरीर दीवार पर नीचे धक्का इतना है कि यह स्लाइड पर चिपक जाता है. शरीर की दीवार को नुकसान को रोकने के लिए, और यह सुई के बीच interposed पेट के साथ शरीर दीवार धक्का. पूर्वकाल और कूल्हों छोर पर पेट के माध्यम से आंसू और इसे उठा दूर फिर सुई का उपयोग. अगर वांछित, अतिरिक्त भ्रूण एक ही स्लाइड पर स्थानांतरित किया जा सकता है, devitellinised और filleted, देखभाल करने के लिए पहले से ही अन्य भ्रूण को नुकसान नहींस्लाइड.
    2. एक 24 x 60 हेपटैन गोंद (1 टेबल देखें) के साथ स्लाइड के केंद्र में गोंद की एक छोटी सी बूंद रखने और यह एक 18 x 18 मिमी coverslip साथ एक बहुत पतली फिल्म फैल मिमी coverslip कोट. एक खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip प्लेस और इसके किनारों के आसपास एक तरफा चिपकने वाला टेप के एक फ्रेम बनाने. दूर 10 भ्रूण की पंक्ति पकड़ ब्लॉक से अतिरिक्त अगर कट, धीरे coverslip हेपटैन गोंद coverslip साथ भ्रूण छुओ. अब वे अपने उदर के नीचे का सामना करना पड़ रहा है पक्षों के साथ coverslip का पालन करना चाहिए. पीबीएस के एक उदार राशि के लिए भ्रूण को कवर (चित्रा 2, 4-6 कदम) जोड़ें.
      एक गिलास के साथ या इसके पीछे के अंत के पास प्रत्येक भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष पर टंगस्टन सुई पीतक झिल्ली घुसना. पृष्ठीय midline साथ झिल्ली खुला आंसू और भ्रूण झिल्ली के बाहर खींचें. भ्रूण उदर नीचे हेपटैन गोंद सब्सट्रेट और यह एक ही 2.3A में वर्णित विधि का उपयोग पट्टिका पर कहीं ओर) (देखने के ओरिएंटचित्रा 2, 7-8 कदम). के बाद से कई भ्रूण एक ही स्लाइड पर filleted जाएगा, यह उपयोगी है या तो अपने उन्मुखीकरण के साथ बहुत सटीक होना या स्लाइड पर ओरिएंटेशन के अपने एक ड्राइंग बनाने.
  2. Filleting के बाद, भ्रूण पीबीएस में 7.4% formaldehyde में 10-15 मिनट के लिए हल्के से तय किया जा सकता है, पीबीएस में 4 washes द्वारा पीछा किया. चरम देखभाल के संपर्क में समाधान की सतह के साथ इस प्रक्रिया के दौरान भ्रूण लाने के लिए, के रूप में सतह तनाव बलों भ्रूण को नष्ट कर देगा करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह कदम पूर्व निर्धारण सख्ती से आवश्यक नहीं है, लेकिन देर चरण भ्रूण में शरीर की दीवार की मांसपेशियों के संकुचन को रोकने के लिए और मदद करने के युवा चरणों में भ्रूण के ऊतकों को स्थिर करने के लिए उपयोगी है. ध्यान रखें कि निर्धारण भ्रूण के ऊतकों को अधिक अपारदर्शी और इसलिए कुछ डीआईसी निगरानी के तहत समझौता छवि गुणवत्ता पड़ता.

3. इंजेक्शन micropipettes भरना

आधे से एक 0.5 मिलीलीटर Eppendorf microfuge ट्यूब भरने100% इथेनॉल में carbocynanine डाई (आणविक जांच, यूजीन, या) DiI ('सूखा' पूर्ण EtOH उपयोग लिए DiI वर्षण की संभावना से बचने के लिए सुनिश्चित हो) के 0.1% समाधान. ट्यूब के ढक्कन में एक संकीर्ण छेद बनाओ और ढक्कन में छेद के माध्यम से micropipette की कुंद अंत डालने. DiI कम से कम 5 मिनट के लिए रेशा चढ़ना करने की अनुमति दें. (हमेशा ढक्कन में छेद को कवर जब भरने इथेनॉल के वाष्पीकरण से बचने के एक micropipette नहीं).

उपकरण न्यूरॉन डाई इंजेक्शन (3 चित्रा) के लिए आवश्यक है.

माइक्रोस्कोप. ध्यान केंद्रित करने के दौरान भ्रूण के ऊर्ध्वाधर आंदोलन से बचने के एक निश्चित स्तर खुर्दबीन न्यूरॉन डाई इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ऐसी कोई भी आंदोलन विंदुक विस्थापित के बाद यह भ्रूण के साथ संपर्क में आ गया है. हम दोनों Zeiss Axioskop एफएस और ओलिंप AX50/BX50 निश्चित चरण मॉडल अच्छी तरह से इस प्रयोजन के लिए उपयुक्त हो पाया है. खुर्दबीन neur के दृश्य के लिए प्रेषित प्रकाश डीआईसी प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिएधुंधला हो जाना पहले ons. माइक्रोस्कोप भी एक औंधा मॉडल के बजाय एक ईमानदार होना चाहिए. माइक्रोस्कोप के साथ एक ईमानदार, micropipette के टिप को देखने के उद्देश्य के रूप में भ्रूण का एक ही पक्ष पर है, जबकि एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ दो भ्रूण के विपरीत पक्षों पर हैं. उत्तरार्द्ध व्यवस्था डीआईसी प्रकाशिकी की गुणवत्ता के साथ समझौता है. खुर्दबीन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए सेट किया जाना चाहिए DiI अवलोकन के लिए एक उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ. चूंकि DiI 549 और 565 एनएम इस श्रेणी में कई फिल्टर सेट काम करेंगे पर उत्तेजना और उत्सर्जन मॅक्सिमा के साथ एक comparably व्यापक स्पेक्ट्रम है, Alexa 568, Cy3, rhodamine, टेक्सास रेड या TRITC के लिए उदा. हालांकि यह प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत के रास्ते में एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित शटर फिट खुर्दबीन के साथ हाथ से संपर्क के बिना शटर के ऑपरेशन की अनुमति के लिए सुविधाजनक है, हम भी प्रभावी ढंग से एक सेटअप है जो केवल एक मैनुअल शटर के साथ सुसज्जित किया गया था पर लेबल. अंत में, एक उच्च वृद्धि, उच्च संख्यात्मक apertuफिर पानी विसर्जन उद्देश्य के अवलोकन के लिए इंजेक्शन के दौरान आवश्यक है. इस उद्देश्य एक coverslip बिना उपयोग के लिए तैयार किया जाना चाहिए. हम सफलतापूर्वक Zeiss Achroplan 100x/1.0W ओलिंप LUMPlan FL 100x/1.0W, और ओलिंप LUMPlan / FL IR 60x/0.9 डब्ल्यू उद्देश्यों का इस्तेमाल किया है.

एक micromanipulator स्थिति और न्यूरॉन डाई इंजेक्शन के दौरान micropipette स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है. हम दोनों Leica micromanipulator और एक मंच में घुड़सवार Narashige 3-अक्ष हाइड्रोलिक micromanipulator का इस्तेमाल किया है.

वर्तमान इंजेक्शन के लिए सुविधा के साथ एक intracellular डीसी एम्पलीफायर, micropipette से DiI की iontophoretic इंजेक्शन के लिए आवश्यक है.

4. डाई इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया

  1. इंजेक्शन माइक्रोस्कोप (3 चित्रा) के मंच पर मुहिम शुरू की भ्रूण (ओं) के साथ स्लाइड रखें. एक 10x उद्देश्य का उपयोग करने के लिए एक भ्रूण का पता लगाने के लिए और यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में लाना.
  2. तैरआईएनजी देखने की स्थिति में उच्च शक्ति के उद्देश्य और ध्यान में भ्रूण लाने. डीआईसी प्रकाशिकी (या प्रतिदीप्ति का उपयोग अगर लक्ष्य सेल GFP व्यक्त करता है) के तहत ब्याज की सेल का पता लगाने के लिए और यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में लाना. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप के क्षेत्र डायाफ्राम सिर्फ देखने के क्षेत्र के किनारे करने के लिए खोला जाता है, नहीं परे. एक संकीर्ण रोशनी बीम micropipette की स्थिति में सहायता (4.4 नीचे चरण देखें). उद्देश्य उठाएँ जब तक यह संभव के रूप में के रूप में भ्रूण के ऊपर उच्च है, जबकि अभी भी घंटी / पीबीएस समाधान के साथ संपर्क में शेष है.
  3. डीसी एम्पलीफायर के लिए अच्छी तरह से भ्रूण और micropipette की राह स्पष्ट पीबीएस में स्नान इलेक्ट्रोड रखें.
  4. इसके धारक है, जो एक 0.1 एम LiCl समाधान के साथ भर दिया गया है में इंजेक्शन micropipette डालें. Micromanipulator micropipette धारक संलग्न. Micromanipulator मोटे नियंत्रण का प्रयोग, उद्देश्य और भ्रूण की नोक के बीच अंतरिक्ष में micropipette ले आओ.सुनिश्चित करें कि यह अच्छी तरह से भ्रूण के स्तर से ऊपर है. उच्च शक्ति के उद्देश्य से कम काम दूरी की वजह से, micropipette एक उथले कोण में आयोजित किया क्रम में यह ध्यान में लाने (चित्र देखें 3) होगा. आप पहले उदाहरण में परीक्षण और त्रुटि के द्वारा उचित कोण स्थापित करना होगा. यदि कोण भी खड़ी है, तो आप micropipette टिप को ध्यान में प्राप्त करने में सक्षम नहीं होगा. यदि यह भी उथले है, micropipette शाफ्ट जगह में स्नान समाधान पकड़े बांध की दीवार के खिलाफ बेईमानी जाएगा.
  5. केंद्र को देखने के क्षेत्र में micropipette की नोक. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, भ्रूण के स्तर पर अपनी आँखें लाने और micropipette मंच खुर्दबीन के शाफ़्ट में आगे और पीछे ले. जब इसकी टिप प्रकाश रास्ते को पार करता है, तो आप इसे से प्रकाश की किरणों का उज्ज्वल प्रतिबिंब देखेंगे. Micropipette की नोक के आगे X-अक्ष में इतना है कि यह प्रकाश किरण overshoots हटो. यह आसान हो सकता है छोटे में micropipette पता लगाने जाएगाउच्च शक्ति के उद्देश्य के देखने के क्षेत्र अगर आप इसके बजाय अपने टिप शाफ्ट के लिए देख रहे हैं. अब खुर्दबीन eyepieces के माध्यम से देखो और धीरे - धीरे उच्च शक्ति के उद्देश्य कम जब तक micropipette की शाफ्ट ध्यान में आता है. Micropipette micromanipulator नियंत्रण के साथ आगे और पीछे Y-अक्ष में चल रहा है यह पता लगाने में मदद करता है, के रूप में इसे धीरे - धीरे ध्यान में आता है. जब शाफ्ट ध्यान में है, X-अक्ष में micropipette कदम जब तक इसकी टिप देखने के क्षेत्र के केंद्र में स्थित है. इस स्तर पर micropipette टिप भ्रूण के स्तर से ऊपर अच्छी तरह से होना चाहिए. प्रतिदीप्ति रोशनी करने के लिए स्विच और टिप जांच DiI के रिसाव की जांच करने के लिए. डीसी नोक पर बनाने से किसी भी DiI क्रिस्टल को रोकने के लिए वर्तमान समायोजित करें.
  6. Micromanipulator नियंत्रणों का उपयोग, Z-अक्ष में micropipette कम है. खुर्दबीन ध्यान नियंत्रण के साथ ध्यान में इसे वापस लाने. उत्तरोत्तर micropipette कम नीचे इस तरह से भ्रूण की ओर. प्रारंभ में, आप मोटे के साथ ऐसा कर सकतेZ-अक्ष नियंत्रण micromanipulator और माइक्रोस्कोप की. हालांकि, के रूप में भ्रूण ध्यान में आता है आप ठीक नियंत्रण knobs के लिए स्विच चाहिए.
  7. जब भ्रूण की सतह ध्यान में आता है, देखने के क्षेत्र के किनारे की ओर micromanipulator की दिशा में micropipette की नोक, हटो. इंजेक्शन सेल पर ध्यान दें और जाँच करें कि यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में स्थित है. Micropipette टिप पर refocus और Y-अक्ष में कदम जब तक यह सेल के रूप में वाई अक्ष में एक ही स्तर पर है. X-अक्ष में सेल की ओर micropipette की नोक कदम के रूप में आप यह z-अक्ष में कम. एक Leica micromanipulator का उपयोग, तो आप शायद लगता है कि मंच खुर्दबीन X-अक्ष में बेहतर आंदोलन के micromanipulator नियंत्रण से नियंत्रण दे, तो मंच को नियंत्रित करने के लिए स्विच के रूप में टिप सेल करने के लिए बंद हो जाता है नियंत्रण होगा.
  8. Micropipette टिप सेल के साथ संपर्क में लाने के लिए और इसकी सतह पर एक अवसाद. दर्रा depolarizi के कई nanoampsएनजी कुछ सेकंड के लिए मौजूदा. आप DiI का एक छोटा सा क्रिस्टल सेल के गठन को देखना चाहिए. पुष्टि की जाती है कि सेल को चिह्नित किया गया है, संक्षेप में शटर खोलने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ भ्रूण कोरोशनी देने, तो डीआईसी के लिए वापस स्विच. यदि ब्याज की सेल के शरीर लेबलिंग के संकेत से पता चलता है, कई और अधिक सेकंड के लिए वर्तमान में लागू होते हैं. बंद वर्तमान बारी और जल्दी से X-अक्ष में micropipette खुर्दबीन मंच नियंत्रण का उपयोग कर से भ्रूण दूर खींच. तो समाधान से micropipette वापस लेने. अगर कोई DiI लेबलिंग स्पष्ट है, micropipette और अवरुद्ध किया जा सकता है एक ताजा micropipette के साथ बदलने की आवश्यकता होगी. आप पा सकते हैं कि micropipette की नोक हित के सेल के लिए रास्ते में अन्य ऊतकों snagged है और इस ऊतक कोशिका बजाय दाग है. इस मामले में, micropipette थोड़ा वापस लेने की कोशिश की, और सेल फिर से दृष्टिकोण. Micropipette जगह और फिर कोशिश करें यह आवश्यक हो सकता है.
  1. अगर वांछित, एकाधिक कोशिकाओं व्यक्ति हो सकता हैएक ही भ्रूण में लेबल सहयोगी.
  2. इंजेक्शन कक्ष में समाधान निकालें, तो 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 4 washes द्वारा बाद 7.4% formaldehyde / पीबीएस जोड़कर भ्रूण को ठीक. भ्रूण तो कम से कम 4 घंटा (4 डिग्री सेल्सियस पर या रातोंरात) के लिए कमरे के तापमान पर एक काले, नम चैम्बर में (विरंजन या शुष्क गिरने से बचने के लिए) के लिए छोड़ दिया neuronal प्रक्रियाओं भर में फैलाना DiI की अनुमति. इस स्तर पर, DiI लेबल कोशिकाओं को या तो हो सकता है या photoconverted confocal खुर्दबीन में सीधे देखा.

5. डीआईसी प्रकाशिकी का उपयोग करते हुए परीक्षा के लिए photoconversion

photoconversion के सिद्धांत फ्लोरोसेंट उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के साथ रोशनी के दौरान दाग सेल द्वारा उत्सर्जित प्रकाश द्वारा (फोटो) थपका के ऑक्सीकरण है. इसका मतलब यह है कि उज्ज्वल कोशिकाओं कमजोर दाग कोशिकाओं की तुलना में कम समय में photoconverted. यदि एक नमूना में एकाधिक लेबल कोशिकाओं को बहुत ज्यादा अलग उनकी चमक के बारे में इस difficu के लिए नेतृत्व कर सकते हैंउन सभी को एक ही गुणवत्ता में photoconverting में lties (चित्रा 4C देखें): इस मामले में एक कमजोर कोशिकाओं (कम रोशनी का उपयोग) की उपेक्षा करने या स्वीकार है कि उज्जवल कोशिकाओं को प्रफुल्लित शुरू (अब रोशनी का उपयोग) के बीच एक समझौते पर फैसला हो सकता है . यदि सब कुछ कोशिकाओं को भी कमजोर चिह्नित कर रहे हैं (इस प्रकार बहुत लंबे समय रोशनी की जरूरत है), अंतर्जात पराक्सिडेजों की वजह से पृष्ठभूमि एक समस्या बन सकता है. चूंकि थपका विषैला होता है इसे सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए. अपशिष्ट क्लोरीन विरंजन 7% के साथ कर सकते हैं 'निष्क्रिय'.

  1. Photoconversion प्रत्येक भ्रूण के लिए चाहिए व्यक्तिगत रूप से किया जाता है. मामलों में जहां केवल एक भ्रूण स्लाइड प्रति इंजेक्ट किया जाता है, पीबीएस समाधान को कवर भ्रूण एक थपका (3 मिलीग्राम थपका / एमएल Tris बफर) समाधान, एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और भरे एक 100x उद्देश्य के साथ देखी सेल पर रखा स्लाइड के साथ बदल दिया है. (एक ईमानदार माइक्रोस्कोप थपका समाधान में उद्देश्य dips का उपयोग करना है और पानी के साथ कई बार photoconversion पी के बाद साफ किया जाना चाहिएrocedure समाप्त हो गया है, यह अगर एक औंधा माइक्रोस्कोप प्रयोग किया जाता है) से बचा जा सकता है. एक Cy3 फिल्टर सेट और एक 100W पारा दीपक का इस्तेमाल कर रहे हैं और एक भूरे रंग थपका प्रतिक्रिया उत्पाद जब तक लाल उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को अवगत कराया सेल लेबल न्यूरॉन में स्पष्ट हो जाता है (उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी करने के लिए स्विचन द्वारा समय समय पर जांच). इष्टतम थपका धुंधला के लिए लिया गया समय परिवर्तनशील है, लेकिन मंच है जहां प्रतिदीप्ति पूरी तरह से फीका है परे उत्तेजना प्रकाश के लिए जोखिम की आवश्यकता है. बाद photoconversion पूरा हो गया है, तैयारी पीबीएस के साथ कई बार धोने. पीबीएस 70% ग्लिसरॉल की एक बूंद के साथ विस्थापित, दूर एक स्केलपेल ब्लेड के साथ सिलिकॉन परिमार्जन, वेसिलीन की एक अंगूठी के साथ जगह और एक coverslip जोड़ने.
  2. जब कई भ्रूण एक स्लाइड पर भर दिया गया है, एक अलग 24 x 60 मिमी कांच का सामना करना पड़ रहा भ्रूण के उदर पक्ष के साथ coverslip पर PBS के छोटे ड्रॉप करने के लिए प्रत्येक भ्रूण स्थानान्तरण. प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर चिपकने वाली टेप के एक फ्रेम प्लेस करने के लिए एक अच्छी तरह से बनाने के लिए और पी के साथ तैयारी को कवरबी एस. Photoconversion पहले एक नम चैम्बर के लिए उन्हें बाहर सुखाने से रोकने में स्लाइड्स रखें. विनिमय PBS थपका समाधान के साथ भ्रूण को कवर. तुरंत एक औंधा एक 100W पारा दीपक के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर स्लाइड जगह और Cy3 लिए DiI उत्तेजित सेट फिल्टर का उपयोग करें, कुल्हाड़ी 50 उद्देश्य का उपयोग. Photoconversion के बाद, 70% ग्लिसरॉल की एक बूंद में एक ताजा स्लाइड भ्रूण हस्तांतरण, और नेल पॉलिश के साथ सील coverslip जोड़ें.

6. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा परीक्षा

  1. 4.10 कदम के बाद, एक ताजा 24 x 60 मिमी coverslip पर एक पीबीएस की एक छोटी सी बूंद को हस्तांतरण भ्रूण. हम coverslip की ओर पृष्ठीय पक्ष (coverslip और भ्रूण के बीच केवल एक पीबीएस की एक छोटी राशि छोड़कर) के साथ चपटा भ्रूण बढ़ते द्वारा इष्टतम प्रकाशिकी प्राप्त करने के.
  2. चिपकने वाला टेप के भ्रूण के चारों ओर एक फ्रेम जगह और पीबीएस ड्रॉप का विस्तार करने के लिए फ्रेम को भरने के लिए जब एक स्लाइड के साथ शामिल किया गया है. उस पर एक स्लाइड ध्यान रखें और नेल पॉलिश के साथ इसे ठीक. भरा न्यूरॉन्स परीक्षा होना चाहिएएक confocal खुर्दबीन (या प्रतिदीप्ति) जितनी जल्दी हो सके पर ined.

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Representative Results

चित्रा 4 तकनीक के ठेठ परिणाम दिखाता है, हम यहाँ वर्णन 4A चित्रा एक DiI से भरा एकल interneuron कि सफाई photoconverted था का एक उदाहरण से पता चलता है. यह अच्छी तरह से विस्तार की राशि इन तैयारियों के प्रस्ताव को दर्शाता है. जब डीआईसी प्रकाशिकी के तहत देखा गैर लेबल आसपास के ऊतक के भीतर लेबल सेल के स्थानिक संदर्भ दिखाई हो जाता है, प्रांतस्था भीतर और neuropile भीतर फाइबर प्रक्षेपण की सेल शरीर की स्थिति उदा.

चित्रा 4B एक मामले में जहां डाई ड्रॉप एक छोटे से भी बड़ा था और कई पड़ोसी कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप बनने एक साथ लेबल है. यह अक्सर मुश्किल व्यक्तिगत अनुमानों अलग सेल निकायों से संबंधित करने के लिए बनाता है. यह भी पता चलता है कि जब सीधे फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे देखा (कोई photoconversion) पृष्ठभूमि संकल्प बहुत कम है.

चित्रा 4C में नमूना

चित्रा 4D से पता चलता है कि confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन विस्तार में लेबल की कोशिकाओं की आकारिकी का पता चलता है. DiI लेबलिंग एक तनाव है कि एक GFP संवाददाता का निर्माण किया जाता है में प्रदर्शन किया गया था. यह स्थानिक संदर्भ के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी (और पहचान) डाई भरा सेल के विशिष्ट आबादी के भीतर उपलब्ध करा सकता है neuronal या जीएलial सेल प्रकार (जीन की अभिव्यक्ति के रूप में परिभाषित किया गया है).

पहचान न्यूरॉन के morphological परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रतिमान के रूप में हम बेपर सकारात्मक न्यूरॉन्स 14 में से एक चुना है. इस न्यूरॉन एक पृष्ठीय और औसत दर्जे का स्थिति neuropile के करीब (डीएपी, चित्रा 5A, Lundgren एट अल. 1995) अन्य बेपर सकारात्मक न्यूरॉन्स से अलग है और इसलिए आसानी से apGal4 UASGFP जानवरों में पहचान चित्रा 5B एक डीएपी सेल से पता चलता है. कि DiI और photoconverted साथ भरा हुआ था. सेल शरीर पूर्वकाल संयोजिका के स्तर पर है और एक अक्षतंतु पता चलता है कि पहले midline की ओर बढ़ता है और फिर एक औसत दर्जे का संयोजी क्षेत्र में पूर्वकाल उत्तेजित करता है. यह नोक पर सूजन और निर्णायक बिंदु की तरह विकास कोन है. इस सेल, छवि के ढेर से अधिकतम अनुमानों के रूप में तैयार की है, के 19 लेबल चित्र 5C में संक्षेप हैं. सेल आकारिकी महान विस्तार दिखाई हो जाता है. केवल कुछ कोशिकाओं के विकास शंकु की तरह दिखाने संरचनाओं, 19 कोशिकाओं के छह भी भेजने के एक शाखा पश्च है कि हमेशा पूर्वकाल शाखा की तुलना में कम है और अच्छी तरह से एक क्षणिक सुविधा हो सकती है. चित्रा 5D में सभी 19 डीएपी लेबल की कोशिकाओं प्रत्येक कोशिका केवल 12% की अस्पष्टता होने के साथ खड़ी दिखती हैं. गहरा जा रहा है और अधिक कोशिकाओं क्षेत्रों में यह परिणाम उन्हें साझा करें. जबकि सेल शरीर के एक से अधिक केंद्र की स्थिति के आसपास सेल व्यास बदलता है, अक्षतंतु की neuropile भीतर mediolateral स्थिति बहुत कम बदलता जब neuropile चौड़ाई नौ भागों यह औसत दर्जे दो पदों में से एक में हमेशा रहता है में विभाजित है.

चित्रा 1
चित्रा 1. न्यूरॉन लेबलिंग विधि के कदम और इसके दो वेरिएंट के योजनाबद्ध सिंहावलोकन.

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चित्रा 2. न्यूरॉन डाई इंजेक्शन के लिए भ्रूण ड्रोसोफिला की तैयारी में विभिन्न कदम illustrating variant बी के अनुसार, आरेख बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. डाई इंजेक्शन के लिए सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ऊपरी दाएँ डालने नमूना, इंजेक्शन micropipette और स्नान इलेक्ट्रोड की व्यवस्था के एक बढ़े हुए दृश्य एक: micromanipulator, बी: फिक्स्ड मंच खुर्दबीन. micromanipulator एक उथले कोण पर सेट कर दिया जाता है - लगभग 10 और डी:. micropipette, डी के साथ micropipette धारक: स्नान इलेक्ट्रोड प्लास्टिसिन, एफ के साथ तय:: स्लाइड, ई पर नमूना डीसी एम्पलीफायर को कनेक्शन, जी और सी.

चित्रा 4
चित्रा 4 17 भ्रूण चरण के उदर तंत्रिका कॉर्ड में DiI लेबल interneurons के उदाहरण. देखा गया पृष्ठीय, पूर्वकाल के लिए छोड़ दिया है. Midline: बिंदीदार लाइनों.

  1. एक बिल्कुल photoconverted एकल सेल, एक प्रमुख contralateral axonal प्रक्षेपण और ipsilateral वृक्ष के समान फाइबर (arrowhead) दिखाने का एक उदाहरण है. डीआईसी प्रकाशिकी.
  2. तैयारी दिखाता है जिसमें एक से अधिक सेल में चिह्नित किया गया है - यह एक एकल कोशिका शरीर के स्पष्ट अपने प्रक्षेपण के लिए काम अस्पष्ट कर सकते हैं.
  3. 8 कोशिकाओं को लगातार 3 क्षेत्रों में चिह्नित किया गया है. इसके अलावा, इस तैयारी में photoconversion एक मील का पत्थर के रूप में एक मानक प्रोटोकॉल Fas2 खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला हो जाना द्वारा पीछा किया गया था.
  4. एक एकल DiI भरा न्यूरॉन एक मक्खी ले जाने के एक GFP संवाददाता का निर्माण तनाव में confocal माइक्रोस्कोपी के साथ दस्तावेज से पता चलता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. लक्षित DiI लेबलिंग (GFP अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित) एक की पहचान 14 न्यूरॉन के morphological परिवर्तनशीलता की सीमा का पता चलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

  1. डीएपी सेल (कृत्रिम रंग नीला) असंदिग्ध रूप से पेट में बेपर पैटर्न Gal4 UASGFP (डीएपी, चित्रा 5A, Lundgren एट एक के भीतर मान्यता प्राप्त किया जा सकता हैएल 1995). GFP व्यक्त कोशिकाओं विरोधी GFP एक एंटीबॉडी के साथ दाग है. midline बिंदीदार लाइनों के साथ चिह्नित है. एसी = पूर्वकाल संयोजिका, पीसी = पीछे संयोजिका.
  2. एक photoconverted डीएपी DiI भरा सेल का एक उदाहरण दिखाता है. सेल पहले की पहचान की थी GFP की अभिव्यक्ति द्वारा एक बेपर Gal4 - UASGFP भ्रूण में भरने डाई.
  3. 19 की एक गैलरी इस सेल, छवि के ढेर से अधिकतम अनुमानों के रूप में तैयार की भरता है. पृष्ठीय दृश्य दिखाई देते हैं. पूर्वकाल है. हल्के भूरे रंग में neuropile है, प्रांतस्था क्षेत्र गहरे भूरे रंग में है.
  4. 19 डीएपी कोशिकाओं प्रत्येक सेल 12% की अस्पष्टता होने के साथ खड़ी दिखती हैं. कोशिकाओं के सबसे द्वारा कब्जा क्षेत्र ग्रे की अंधेरी छाया है. सभी नमूनों की neuropile (नीला) एक समान चौड़ाई को बढ़ाया गया और पूर्वकाल सेल करने के लिए अगले commissures गठबंधन किया गया तो वे छा. जबकि सेल शरीर केंद्रीय स्थान के चारों ओर एक से अधिक सेल व्यास बदलता है, अक्षतंतु के neuropile भीतर mediolateral स्थिति से पता चलता हैकम भिन्नता.

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Discussion

ड्रोसोफिला की एक मॉडल प्रणाली के रूप में एक बड़ा लाभ यह है कि यह और एकल कक्षों के स्तर पर विकास कार्य के विश्लेषण की अनुमति देता है. यह विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र, जहां सेल प्रकार की विविधता असाधारण उच्च है और समारोह और पड़ोसी की कोशिकाओं के morphology पूरी तरह से अलग किया जा सकता है के बारे में उपयोगी है.

विधि हम यहां उपस्थित एक रंग है कि या तो एक स्थायी दाग ​​या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सीधे जांच में तब्दील किया जा सकता है के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की लेबलिंग की अनुमति देता है. यह महान विस्तार में तंत्रिका प्रक्रियाओं की आकारिकी (4 चित्रा) से पता चलता है. विधि का प्रमुख लाभ में से एक यह है कि यह CNS में न्यूरॉन के लगभग किसी भी प्रकार की आकारिकी करने के लिए सक्षम बनाता है की जांच की जा (भ्रूण उदरीय तंत्रिका कॉर्ड के लिए, Rickert एट अल देखने के लिए, 2011, भ्रूण के मस्तिष्क के लिए, Kunz एट अल, 2012). इसके अलावा, यह जटिल संयोजन की आवश्यकता नहीं हैआनुवंशिक तत्वों भ्रूण में उपस्थित होने के लिए रूप में आनुवंशिक लेबलिंग तकनीक है के कई. डाई इंजेक्शन जानवरों है कि संवाददाता constructs ले की कोशिकाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है, जिससे व्यक्ति सेल morphologies या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में विशेष जीन अभिव्यक्ति पैटर्न (आंकड़े 4D और 5) के संदर्भ में देखे जा करने के लिए अनुमति देता है. हम भी तकनीक का इस्तेमाल किया भ्रूण न्यूरॉन्स 11, 12 में रहने वाले अक्षतंतु परिणाम की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए.

विधि आसानी से हो सकता है के अन्य जीवों के भ्रूण में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, भ्रूण प्रदान की लेबल अनुकूलित कर सकते हैं काफी पारदर्शी डीआईसी रोशनी के तहत जांच की जा है. हम इसे इस्तेमाल किया है 18 grasshoppers, 17 सेंटीपीड क्रसटेशियन 19 और 16 silverfish सहित सन्धिपाद भ्रूण की एक विस्तृत विविधता में तंत्रिका morphology कल्पना.

तकनीक के प्रमुख नुकसानque अपनी तकनीकी कठिनाई में निहित है. हमें विश्वास है कि विधि का वर्तमान विस्तृत खाता यह mastering में रुचि शोधकर्ताओं की सहायता करेंगे.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

यह काम GMT DFG से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

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References

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केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र में एकल कक्षों के लेबल<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

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