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Neuroscience

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150

Summary

Presentiamo una tecnica per l'etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC)

Abstract

In questo articolo viene descritto come etichettare singolarmente i neuroni del sistema nervoso centrale dell'embrione di Drosophila melanogaster mediante iniezione juxtacellular del DiI lipofilo fluorescente marker di membrana. Questo metodo permette la visualizzazione della morfologia delle cellule neuronali nei minimi dettagli. È possibile etichettare qualsiasi cella nel CNS: corpi cellulari dei neuroni bersaglio sono visualizzati sotto DIC ottiche o mediante espressione di un marcatore fluorescente genetico come GFP. Dopo etichettatura, la DiI può essere trasformato in un permanente macchia marrone da fotoconversione per permettere la visualizzazione della morfologia cellulare con luce trasmessa e ottica DIC. In alternativa, le cellule DiI-etichetta possono essere osservati direttamente con microscopia confocale, permettendo geneticamente introdotte proteine ​​reporter fluorescenti da colocalised. La tecnica può essere utilizzata in qualsiasi animale, indipendentemente dal genotipo, rendendo possibile analizzare fenotipi mutanti a risoluzione singola cella.

Introduction

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La conoscenza della morfologia neuronale a livello delle singole celle è un presupposto fondamentale per la comprensione connettività neuronale e la funzione del SNC. Così, fin dai primi giorni di neuroscienze, i ricercatori hanno cercato di sviluppare singole tecniche di marcatura delle cellule (vedi 7 per una trattazione storica di questo numero). Metodi classici come colorazione di Golgi forniscono eccellente risoluzione di morfologia neuronale ma non sono adatti se si cerca di etichettare un particolare tipo di neurone in modo diretto, come colorazione avviene in modo casuale. Lo sviluppo di metodi per la colorazione di cellule singole mediante iniezione intracellulare o juxtacellular di coloranti da un microelettrodo affrontato l'obbligo di etichettatura specifica.

L'applicazione di una singola iniezione di Drosophila neurone colorante rappresentato una sfida importante, a causa delle piccole dimensioni sia dell'organismo e suoi neuroni. Tuttavia, la colorazione singolo neurone di embrionale Drosophila 15. Mentre il metodo è stato eminentemente utile e ha fornito alcuni spunti importanti sui meccanismi per lo sviluppo neuronale in Drosophila nel corso degli ultimi 20-30 anni (ad esempio, 2, 10), molti lavoratori hanno evitato che, in gran parte a causa delle sue esigenze tecniche.

La disponibilità in anni più recenti di tecniche genetiche per l'etichettatura neuronale in Drosophila ha anche contribuito l'impopolarità di singola iniezione colorante neurone. Espressione GAL4-diretto di membrana mirati costrutti GFP in grado di fornire un'eccellente risoluzione della morfologia neurale 1, 20. Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni: la spesso inevitabile espressione di GFP in cellule multiple possono oscurare la struttura dei singoli neuroni e una linea pilota GAL4 possono non essere disponibili per guidare l'espressione in un neurone specifico di interesse. Il marcm (Analisi Mosaico con un addettoMarker ressible Cell) Metodo 8 può fornire etichettatura di ogni neurone essenzialmente a livello di cella singola, ma non può essere usato con successo nell'embrione e larva presto a causa della lenta rotazione della proteina GAL80.

Date queste limitazioni di etichettatura genetica, noi crediamo che una singola iniezione colorante neurone nell'embrione Drosophila rimane una tecnica preziosa e merita una più ampia applicazione. Per promuovere questo obiettivo, forniamo qui una descrizione dettagliata del metodo. Un'illustrazione della sua potenza è fornito dal nostro conto recente della morfologia del set completo di interneuroni in neuromeres addominali dell'embrione ritardo Drosophila 14. Questo studio, che ha rivelato sia la variabilità morfologica dei singoli tipi di cellule neuronali e dei principi di organizzazione neuromere nel SNC dell'embrione, non sarebbe stato possibile con qualsiasi altro metodo di etichettatura attualmente disponibile.

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Protocol

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Abbiamo usato due varianti leggermente diverse del singolo metodo di etichettatura neurone nei nostri laboratori. Le differenze riguardano la raccolta degli embrioni, dechorionisation, devitellinisation e gradini sfilettatura embrioni. Figura 1 fornisce una panoramica dei passaggi comuni e divergenti delle varianti.

1. Preparazione di micro-aghi per la dissezione dell'embrione e Micropipette per iniezione Dye

  1. Aghi vetro per dissezione dell'embrione sono tratti da capillari di vetro (1 mm di diametro e 0,1 mm di spessore) con un estrattore Sutter (Science Instruments) o apparecchio analogo. In alternativa, un elettroliticamente affilato filo di tungsteno 0,15 mm montato in un supporto dell'ago viene utilizzato per dissezioni. (Istruzioni per l'affilatura elettrolitica sono in 9).
  2. Micropipette iniezione Dye sono tratte da pareti sottili capillari di vetro con filamenti interni (i prodotti della scienza; GB 100 TF 8P) con un estrattore Sutter (ScienzaGli strumenti o apparecchiature) comparabili. La punta micropipetta deve essere tagliente, con un graduale, uniforme conicità del codolo per facilitare il passaggio attraverso i tessuti dell'embrione. La micropipetta desiderata è il "microelettrodo ad alta resistenza, Sharp e Long" varietà, come descritto a p.20 del manuale Cookbook strumento Sutter Pipettare ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). In generale, micropipette sono tirato poco prima iniezioni vengono effettuate per garantire i loro suggerimenti rimangono affilati e puliti.

2. Raccolta, montaggio e dissezione di embrioni

  1. Di raccolta di embrioni. Abbiamo utilizzato con successo la tecnica di iniezione neurone descritto qui in embrioni di fasi 12-17 marzo. Gli embrioni sviluppare progressivamente una cuticola durante la fase 17 e diventano sempre più difficili da sezionare. Due approcci alternativi sono disponibili per ottenere embryos in una fase particolare dello sviluppo.
    1. Lasciare mosche a deporre le uova durante la notte sul succo di mela-agar piastre rivestite con pasta di lievito. Regolare la temperatura di raccolta delle uova in base dell'orario previsto per l'iniezione il giorno successivo. Raccogliere tutte le uova il giorno successivo e selezionare gli embrioni allo stadio desiderato utilizzando criteri morfologici 3.
    2. Permettono mosche porre su piastre di agar come sopra, ma scambiare la piastra di agar con una nuova ogni 1,5 ore a 25 ° C. Incubare ciascuna piastra per un periodo di tempo definito, fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase di sviluppo richiesto.
    1. Chemical Dechorionation. Utilizzare una spatola metallica per raschiare embrioni fuori l'agar-agar e trasferirli in un recipiente di vetro (ad esempio piastra di Petri o blocco cavità) contenente circa 10 ml di Drosophila Ringer o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) soluzione. Aggiungere qualche goccia di candeggina concentrata e agitare per qualche minuto su unpiattaforma rotante fino a quando le muta coriali fuori gli embrioni. Lavare gli embrioni diversi cambi di Ringer / PBS fino a quando non vi è nessun odore di candeggina residua. Durante questi lavaggi, affinché gli embrioni non entrino in contatto con la superficie del liquido. In caso contrario, si galleggia e diventano difficili da immergere per la manipolazione successiva. In alternativa, dechorionation chimica può essere effettuata utilizzando la tecnica descritta da carrello 4.
    2. Dechorionation meccanica (vedi Figura 2, i passaggi 1-4). Embrioni trasferimento dalla piastra di agar a una diapositiva coperto con nastro biadesivo appiccicoso. Evitare il trasferimento di agar con gli embrioni come essa possa interferire con la loro adesione al nastro. Lasciare embrioni asciugare per 5-10 minuti fino a quando il corion diventa un po 'fragile. (In attesa, rivestire il coprioggetto necessaria per devitellinisation poi con la colla - 2.3B vedi sotto). Toccare ogni embrione delicatamente con un ago. Il corion si spaccò e l'embrione si attacchi alla NEedle. Embrioni trasferire immediatamente a un blocco di agar per evitare essiccazione e allineare circa 10 di loro in una fila, con i loro lati ventrali rivolte verso l'alto.

Devitellinisation e filettatura vengono eseguite manualmente utilizzando uno dei due metodi descritti in 2.3A e 2.3B.

    1. Trasferire un singolo embrione dechorionated della fase di sviluppo dal piatto di soluzione di Ringer a qualche goccia di Ringer in una diga di silicone su un pre-preparati vetrino da microscopio. (Effettuare una diga 3 cm quadrati da spalmare un sottile strato di silicone sigillante su un vetrino da microscopio, quindi aggiungere un calo dello 0,01% di poli-L-lisina soluzione al centro della diga. Lasciare che il silicone per la cura per 24 ore.) trasferire l'embrione con una pipetta Pasteur di vetro, garantendo che l'embrione rimane sotto la superficie del Ringer durante il trasferimento.
      Rinforzare l'estremità posteriore dell'embrione con un paio di pinze sottili, mentre delicatamente Squeezzione l'embrione con un paio di forbici iridectomia sottili, circa un quarto il viaggio di ritorno dalla sua estremità anteriore. Non tagliare a destra attraverso l'embrione. L'obiettivo è quello di rompere basta aprire la membrana vitellina, mentre causando un danno minimo per l'embrione. Con il forcipe ancora in posizione, utilizzare un ago di tungsteno per facilitare l'embrione dalla membrana aperto e posizionarlo faccia ventrale giù sul vetrino. L'embrione deve attenersi al poli-lisina cappotto.
      Filetto l'embrione con un ago di tungsteno affilato. Perforare delicatamente, quindi strappare la parete del corpo lungo la linea mediana dorsale. Con l'ago, spingere verso il basso la parete del corpo in modo che si attacca alla slitta. Per evitare danni alla parete del corpo, spingere la parete del corpo con l'intestino interposto tra esso e l'ago. Quindi utilizzare l'ago per strappare attraverso l'intestino alle estremità anteriore e posteriore e sollevarlo. Se lo si desidera, gli embrioni supplementari possono essere trasferiti alla stessa diapositiva, devitellinised e sfilettate, facendo attenzione a non danneggiare gli embrioni altri già presenti sulla diapositiva.
    2. Un mantello x 24 60 coprioggetto mm con eptano colla (vedi Tabella 1) mettendo una goccia di colla nel centro della diapositiva e stendendolo con un vetrino coprioggetto 18 x 18 mm per una pellicola molto sottile. Posizionare il vetrino su un vetrino da microscopio e fare un telaio di un nastro adesivo lungo i margini. Tagliare agar in eccesso dal blocco di contenimento la fila di 10 embrioni, toccare delicatamente gli embrioni con il coprioggetto eptano colla. Ora dovrebbero aderire al vetrino con i loro lati ventrali rivolti verso il basso. Aggiungere una generosa quantità di PBS per coprire gli embrioni (vedi Figura 2, le fasi 4-6).
      Penetrare la membrana vitellina con un bicchiere o un ago di tungsteno sul lato dorsale di ogni embrione vicino alla sua estremità posteriore. Lacerare la membrana lungo la linea mediana dorsale e trascinare l'embrione dalla membrana. Orientare il lato ventrale dell'embrione di altre direttive sul substrato colla eptano e filetto utilizzando lo stesso metodo descritto in 2,3 A) (vediFigura 2, i passaggi 7-8). Dal momento che diversi embrioni saranno raccordate sulla stessa diapositiva, è utile essere molto preciso con il loro orientamento o fare un disegno del loro orientamento nella diapositiva.
  1. Dopo filettatura, embrioni possono essere leggermente fissato per 10-15 min a 7,4% di formaldeide in PBS, seguita da 4 lavaggi in PBS. Estrema cura deve essere presa non portare l'embrione in contatto con la superficie della soluzione durante questo processo, come le forze di tensione superficiale distruggerà l'embrione. Questa pre-fissazione passaggio non è strettamente necessario, ma è utile per prevenire la contrazione dei muscoli della parete del corpo di embrioni allo stadio in ritardo e per contribuire a stabilizzare i tessuti embrionali in fasi giovani. Tenete a mente che la fissazione rende i tessuti dell'embrione più opaca, e così un po 'immagine compromessi qualità sotto osservazione DIC.

3. Riempimento di Micropipette iniezione

Riempire a metà un 0,5 ml Eppendorf provetta per microcentrifuga conuna soluzione allo 0,1% del colorante carbocynanine DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) in 100% di etanolo (assicurarsi di utilizzare EtOH 'secco' assoluta di evitare la precipitazione DII). Fare un piccolo foro nel coperchio del tubo e inserire l'estremità smussata della micropipetta attraverso il foro del coperchio. Lasciare che il DiI a salire il filamento per almeno 5 min. (Sempre coprire il foro nel coperchio quando non riempire una micropipetta per evitare l'evaporazione di etanolo).

Attrezzatura richiesta per neurone colorante iniettabile (Figura 3).

Microscopio. Un microscopio scena fissa deve essere utilizzato per l'iniezione neurone colorante per evitare il movimento verticale del dell'embrione durante la messa a fuoco. Qualsiasi tali movimenti spostare la pipetta dopo che è entrato in contatto con l'embrione. Abbiamo trovato sia la Zeiss Axioskop FS e le AX50/BX50 modelli fase Olympus fissi per essere adatto per questo scopo. Il microscopio dovrebbe essere dotato di ottiche di luce trasmessi DIC per la visualizzazione di neurons prima della colorazione. Il microscopio dovrebbe essere anche un montante piuttosto che un modello invertito. Con un microscopio verticale, la punta della micropipetta è sullo stesso lato dell'embrione come obiettivo visualizzazione, mentre con un microscopio invertito i due sono su lati opposti l'embrione. La disposizione Quest'ultimo compromette la qualità delle ottiche DIC. Il microscopio dovrebbe essere istituita per la microscopia a fluorescenza, con filtro idoneo per l'osservazione DII. Dal momento che DiI ha uno spettro relativamente ampio, con eccitazione e di emissione massimi a 549 e 565 nm molti set di filtri di questa gamma funzionerà, ad esempio quelli per Alexa 568, Cy3, rodamina, Texas Red o TRITC. Anche se è necessario prevedere un otturatore controllato elettronicamente nel percorso della sorgente di luce a fluorescenza, per consentire il funzionamento dell'otturatore senza contatto delle mani con il microscopio, abbiamo anche effettivamente etichettati in una configurazione che è stato dotato solo di un otturatore manuale. Infine, un alto ingrandimento, numerico ad elevata apertuacqua obiettivo re immersione è necessaria per l'osservazione durante l'iniezione. Tale obiettivo dovrebbe essere progettato per essere utilizzato senza un coprioggetto. Abbiamo utilizzato con successo il Achroplan 100x/1.0W Zeiss, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W, e Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 obiettivi W.

Un micromanipolatore è necessario per posizionare e spostare la micropipetta durante l'iniezione neurone colorante. Abbiamo usato sia il micromanipolatore Leica e un palco montato Narashige 3 assi micromanipolatore idraulico.

Un amplificatore DC intracellulare, con l'impianto per l'iniezione di corrente, è necessario per l'iniezione del iontoforetico DiI dalla micropipetta.

4. Procedura per l'iniezione Dye

  1. Posizionare il vetrino con l'embrione (s) montati sulla scena del microscopio iniezione (Figura 3). Utilizzare un obiettivo 10x per individuare un embrione e portarlo al centro del campo visivo.
  2. Swzione l'obiettivo alto di alimentazione nella posizione di visualizzazione e portare l'embrione a fuoco. Individuare la cella di interesse sotto ottiche DIC (o usando fluorescenza se la cellula bersaglio esprime GFP) e portarlo al centro del campo visivo. Assicurarsi che il diaframma di campo del microscopio è aperto solo al bordo del campo di vista, non oltre. Un fascio di luce stretto aiuterà posizionamento della micropipetta (vedi punto 4.4). Sollevare l'obiettivo finché non è più in alto possibile sopra l'embrione pur rimanendo in contatto con il Ringer / PBS soluzione.
  3. Posizionare l'elettrodo bagno per l'amplificatore DC nel pozzo chiaro dell'embrione e il percorso della micropipetta PBS.
  4. Inserire la micropipetta iniezione nel relativo supporto, che è stato riempito con una soluzione 0,1 M LiCl. Fissare il supporto micropipetta al micromanipolatore. Utilizzando i controlli micromanipolatore grossolane, portare la micropipetta nello spazio tra la punta dello scopo e l'embrione.Assicurarsi che sia ben al di sopra del livello dell'embrione. A causa della breve distanza di lavoro dell'obiettivo alta potenza, la micropipetta dovrà essere tenuto in un angolo poco profondo per portarla a fuoco (vedere Figura 3). Si dovrà stabilire il giusto angolo per tentativi ed errori in prima istanza. Se l'angolo è troppo ripida, non sarà in grado di ottenere la punta micropipetta a fuoco. Se è troppo bassa, l'albero micropipetta si sporcano contro la parete della diga contenente la soluzione balneazione in posizione.
  5. Centro la punta della micropipetta nel campo di vista. Per ottenere questo, modo gli occhi al livello dell'embrione e spostare la micropipetta e indietro nel asse Y del microscopio. Quando la punta attraversa il percorso della luce, si vedrà il riflesso luminoso dei raggi di luce da esso. Spostare la punta della micropipetta in avanti l'asse X in modo che oltrepassa il fascio di luce. Sarà più facile individuare la micropipetta nel piccolocampo di vista l'obiettivo ad alta potenza, se siete alla ricerca di suo albero, piuttosto che la sua punta. Ora guardare attraverso gli oculari del microscopio e ridurre gradualmente l'obiettivo elevata potenza fino all'albero della micropipetta viene messa a fuoco. Spostando la micropipetta e indietro nel asse Y con i controlli micromanipolatore aiuta a localizzarlo, come viene gradualmente a fuoco. Quando l'albero è a fuoco, spostare la micropipetta in asse X finché la punta si trova al centro del campo visivo. In questa fase la punta micropipetta dovrebbe essere ben al di sopra del livello dell'embrione. Passare alla illuminazione a fluorescenza ed esaminare la punta per verificare l'assenza di perdite di DII. Regolare la corrente per evitare la formazione di cristalli DiI alla punta.
  6. Utilizzando i controlli micromanipolatore, abbassare la micropipetta in asse Z. Riportarlo a fuoco con il controllo di fuoco microscopio. Progressivamente abbassare la micropipetta verso l'embrione in questo modo. Inizialmente, si può fare questo con la grossaZ-asse comandi del micromanipolatore e microscopio. Tuttavia, poiché l'embrione viene messa a fuoco si dovrebbe passare alle manopole di controllo sottili.
  7. Quando la superficie dell'embrione è a fuoco, spostare la punta della micropipetta verso il bordo del campo visivo, in direzione del micromanipolatore. Concentrarsi sulla cella da iniettare e verificare che si trova al centro del campo visivo. Rifocalizzare sulla punta micropipetta e spostarlo nella Y finché non si trova allo stesso livello della asse Y della cella. Spostare la punta della micropipetta verso la cella l'asse X, come si abbassa in asse Z. Se si utilizza un micromanipolatore Leica, probabilmente troverete che la fase microscopio controlli di darvi un maggiore controllo del movimento dell'asse X rispetto ai controlli micromanipolatore, quindi passare alla fase di controllo come la punta si avvicina alla cella.
  8. Porta la punta della micropipetta a contatto con la cella e fare una depressione sulla sua superficie. Passare nA diversi depolarizicorrente ng per alcuni secondi. Si dovrebbe vedere un piccolo cristallo di DiI formando sul cellulare. Per confermare che la cella è stato etichettato, aprire brevemente il pulsante di scatto per illuminare l'embrione con la luce fluorescente, quindi tornare alla DIC. Se il corpo della cella di interesse mostra segni di etichettatura, applicare corrente per diversi secondi più. Spegnere la corrente e rapidamente tirare l'embrione dalla micropipetta in asse X utilizzando il controllo del microscopio. Poi ritirare la micropipetta dalla soluzione. In mancanza di etichettatura DiI è evidente, la micropipetta può essere bloccato e richiede la sostituzione con una micropipetta fresca. Potreste scoprire che la punta della micropipetta ha portato a casa altri tessuti in rotta verso la cella di interesse e questo tessuto è macchiato piuttosto che la cella. In questo caso, provare a ritirare la micropipetta un po ', e ri-avvicinarsi alla cella. Potrebbe essere necessario sostituire la micropipetta e riprovare.
  1. Se desiderato, più celle possono essere singolarmenteallearsi etichettati stesso embrione.
  2. Rimuovere la maggior parte della soluzione nella camera di iniezione, poi fissare gli embrioni aggiungendo 7,4% di formaldeide / PBS per 10 minuti seguita da 4 lavaggi con PBS. L'embrione viene quindi lasciata a temperatura ambiente per almeno 4 ore (o per una notte a 4 ° C) in un buio, camera umida (per evitare di sbianca o cadere secco) per consentire la DiI di diffondere nell'intera processi neuronali. In questa fase, le cellule DII marcati possono essere sia photoconverted o visualizzati direttamente nel microscopio confocale.

5. Fotoconversione per l'esame con Ottica DIC

Il principio di fotoconversione è il (foto-) ossidazione del DAB dalla luce fluorescente emessa dalla cellula colorata durante l'illuminazione con la lunghezza d'onda appropriata. Questo significa che le cellule luminose sono photoconverted in tempi più brevi rispetto alle cellule debolmente colorate. Se le cellule più marcate in un campione troppo differente per quanto riguarda la loro luminosità questo può portare a difficulties in photoconverting tutti in stessa qualità (si veda la Figura 4C): in questo caso si può decidere su un compromesso fra trascurare le cellule più deboli (con illuminazione breve) o accettare che le cellule luminose cominciano a gonfiarsi (con più illuminazione) . Se tutte le celle sono troppo debolmente etichettati (e quindi la necessità di illuminazione molto lunga), fondo causata da perossidasi endogene può diventare un problema. Poiché DAB è tossico deve essere maneggiato con cura. I rifiuti possono essere 'disattivato' con il 7% di cloro sbiancante.

  1. Fotoconversione deve essere eseguita per ogni embrione singolarmente. Nei casi in cui viene iniettato solo embrione per diapositiva, la soluzione PBS copre l'embrione viene sostituito con una soluzione DAB (3 mg DAB / ml di tampone Tris), la slitta posto su un microscopio a fluorescenza e la cella riempita visualizzato con un obiettivo 100x. (Utilizzando un microscopio in posizione verticale i tuffi oggettivi nella soluzione DAB e deve essere pulito più volte con acqua dopo la fotoconversione pROCEDURA è finito, questo può essere evitato se un microscopio invertito è utilizzato). Un Cy3 set di filtri e una lampada da 100W Hg vengono utilizzati e la cellula esposta alle lunghezze d'onda di eccitazione rosso fino a marrone prodotto di reazione DAB diventa evidente nel neurone marcato (controllare periodicamente passando per illuminazione in campo chiaro). Il tempo necessario per la colorazione DAB ottimale è variabile, ma richiede l'esposizione alla luce di eccitazione oltre la fase in cui la fluorescenza è completamente sbiadito. Dopo fotoconversione è completa, la preparazione lavare più volte con PBS. Sostituire il PBS con un calo del 70% glicerolo, raschiare via il silicone con una lama da bisturi, sostituirlo con un anello di vaselina e aggiungere un vetrino coprioggetti.
  2. Quando più embrioni sono stati riempiti sulla diapositiva uno, trasferire ogni embrione di una piccola goccia di PBS in un separato coprioggetto 24 x 60 mm con il lato ventrale dell'embrione di fronte al vetro. Posizionare una cornice di nastro adesivo attorno ad ogni embrione per creare un pozzo e coprire la preparazione con PBS. Conservare i vetrini in una camera umida prima fotoconversione per evitare che si secchi. Sostituire la PBS che copre l'embrione con la soluzione di DAB. Porre immediatamente il vetrino su un microscopio invertito dotato di una lampada da 100W Hg e utilizzare un filtro impostato Cy3 per eccitare il DiI, utilizzando AX 50 obiettivo. Dopo fotoconversione, trasferire l'embrione a una diapositiva fresco in un calo del 70% glicerolo, aggiungere un coprioggetto e sigillare con smalto.

6. L'esame al microscopio confocale

  1. Dopo il passo 4,10, il trasferimento di embrioni ad una piccola goccia di PBS su un nuovo 24 x 60 coprioggetto mm. Otteniamo ottica ottimale montando gli embrioni appiattiti con il lato dorsale verso il coprioggetto (lasciando solo una piccola quantità di PBS tra il vetrino ed embrione).
  2. Posizionare una cornice di nastro adesivo intorno l'embrione e ampliare il calo PBS per riempire il fotogramma quando sono coperte di una diapositiva. Inserire una diapositiva su di esso con attenzione e fissarlo con lo smalto. Filled neuroni dovrebbero essere esamiinato su un confocale (o fluorescenza) microscopio appena possibile.

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Representative Results

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La figura 4 illustra i risultati tipici della tecnica, si descrive qui. Figura 4A illustra un esempio di una piena interneurone DiI singolo che è stato pulito photoconverted. Si dimostra in modo esauriente la quantità di dettagli questi offrono preparazioni. Se visto sotto ottiche DIC contesto spaziale della cella etichettata all'interno del tessuto non marcato circostante diventa visibile, ad esempio, la posizione del corpo cellulare all'interno della corteccia e della proiezione fibra nella neuropile.

Figura 4B è un caso dove la goccia colorante era un po 'troppo grande causando diverse celle vicine diventando etichettati simultaneamente. Ciò rende spesso difficile mettere in relazione proiezioni singoli corpi cellulari distinti. Essa mostra anche che quando visualizzate direttamente sotto il microscopio a fluorescenza (senza fotoconversione) risoluzione di fondo è molto più basso.

Il campione in Figura 4C

La figura 4D mostra che l'osservazione al microscopio confocale rivela la morfologia delle cellule marcate in dettaglio. DiI etichettatura è stata eseguita in un ceppo che portava un costrutto reporter GFP. Questo può fornire importanti informazioni sul contesto spaziale (e l'identità) della cella colorante occupati entro specifiche popolazioni di neuroni o glial tipi cellulari (come definito dalla espressione genica).

Come paradigma per valutare la variabilità morfologica di un neurone identificato abbiamo scelto uno dei neuroni atteri positivi 14. Questo neurone si trova in una posizione vicina dorsale e mediale alla neuropile (dAP, Figura 5A, Lundgren et al., 1995) separato dagli altri neuroni positivi atteri ed è quindi facilmente identificabile in apGal4-UASGFP animali. Figura 5B mostra una cella dAP che era pieno di DII e photoconverted. Il corpo cellulare si trova a livello della commessura anteriore e mostra un assone che cresce prima verso la linea mediana e poi si trasforma in una regione anteriore mediale connettivo. Ha cono di crescita, come rigonfiamenti sulla punta e il punto di svolta. 19 etichette di questa cellula, disegnata come proiezioni massime di stack di immagini, sono riassunti nella figura 5C. Morfologia cellulare diventa visibile al grande dettaglio. Solo poche cellule cono di crescita, come mostrano strutture; sei delle 19 celle anche inviare un posteriore ramo che è sempre più corto del ramo anteriore e potrebbe essere una caratteristica transitoria. In Figura 5D tutte le celle 19 DAP etichettati sono accatastati con ogni cella avente solo una opacità del 12%. Ciò si traduce in zone che sono più scure le cellule più condividerli. Mentre il corpo della cella varia più del diametro di cella intorno alla posizione centrale, la posizione mediolaterale dell'assone nel neuropile varia molto meno - quando la larghezza neuropile è diviso in nove parti che risiede sempre in una delle due posizioni mediali.

Figura 1
Figura 1. Schema delle fasi del metodo etichettatura neurone e le sue due varianti.

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Figura 2. Diagramma che illustra le varie fasi di preparazione di embrioni di Drosophila per iniezione neurone colorante, a seconda della variante B. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3
Figura 3. . Rappresentazione schematica della configurazione di iniezione colorante L'inserto superiore destro è una vista ingrandita della disposizione del campione, la micropipetta iniezione e l'elettrodo vasca A:. Micromanipolatore, B: microscopio scena fissa. Il micromanipolatore è fissato a un angolo basso - circa il 10 & de. g C: Porta Micropipetta con micropipetta, D: campione sul vetrino, E: elettrodo Bagno fissato con plastilina, F: Collegamento al amplificatore DC.

Figura 4
Figura 4. Esempi di interneuroni DiI marcati nel cordone nervoso ventrale della fase 17 embrioni. Dorsal vista, anteriore è a sinistra. Linea mediana: linee tratteggiate.

  1. Un esempio di una cella perfettamente photoconverted singola, mostrando un prominente proiezione controlaterale assonale e fibre dendritiche omolaterali (freccia). Ottica DIC.
  2. mostra una preparazione in cui è stato etichettato più di una cella - questo può oscurare la chiara assegnazione di un corpo singola cellula alla sua proiezione.
  3. 8 celle sono stati etichettati in 3 segmenti consecutivi. Inoltre, in questa preparazione il fotoconversione è stato seguito da una colorazione standard di protocollo di anticorpi contro Fas2 come punto di riferimento.
  4. mostra un singolo neurone DiI pieno documentato con microscopia confocale in un ceppo mosca porta un reporter GFP costrutto.

Figura 5
Figura 5. Mirata DiI etichettatura (contrassegnato da espressione GFP) rivela il range di variabilità morfologica di un neurone identificato 14. Clicca qui per ingrandire la figura .

  1. La cella dAP (colorati artificialmente blu) può essere riconosciuta in modo inequivocabile nel atteri Gal4-UASGFP modello nell'addome (DAP, Figura 5A, Lundgren et unl. 1995). Cellule che esprimono GFP sono stati colorati con un anticorpo anti-GFP. La linea mediana è segnato con linee tratteggiate. ac = commissura anteriore, pc = commissura posteriore.
  2. mostra un esempio di un photoconverted DiI-riempita cella dAP. La cella è stato identificato prima tingere compilando un atteri Gal4-UASGFP embrione con la sua espressione di GFP.
  3. Una galleria di 19 riempie di questa cellula, disegnata come proiezioni massime di stack di immagini. Visualizzazioni dorsali. Anteriore è in alto. Il neuropile è di colore grigio chiaro, la zona corteccia è grigio più scuro.
  4. Le celle 19 DAP sono accatastati con ogni cella avente una opacità del 12%. La regione occupata dalla maggior parte delle cellule ha la tonalità più scura del grigio. Il neuropile di tutti i campioni (blu) è stata scalata per una larghezza simile e le commissure anteriori accanto alla cella sono state allineate in modo che si sovrapponevano. Mentre il corpo della cella varia più del diametro di cella intorno alla posizione centrale, la posizione mediolaterale dell'assone all'interno neuropile mostrameno variazioni.

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Discussion

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Uno dei principali vantaggi di Drosophila come sistema modello è che permette l'analisi di sviluppo e funzione del livello di singole cellule. Questo è particolarmente utile per quanto riguarda il sistema nervoso, in cui la diversità di tipi di cellule è eccezionalmente elevata e la funzione e la morfologia delle cellule vicine può essere totalmente differente.

Il metodo qui presentiamo permette l'etichettatura dei singoli neuroni con un colorante che può essere trasformato in una macchia permanente o esaminato direttamente mediante microscopia a fluorescenza. Rivela la morfologia dei processi neurali in grande dettaglio (Figura 4). Uno dei principali vantaggi del metodo è che consente la morfologia di qualsiasi tipo di neuroni nel SNC da esaminare (per il cavo embrionale nervoso ventrale, vedere Rickert et al, 2011;. Per il cervello embrionale, vedere Kunz et al., 2012). Inoltre, non richiede complesse combinazioni dielementi genetici di essere presenti nell'embrione, dato che alcune delle tecniche di marcatura genetica turistiche. Iniezioni tintura può essere effettuata in cellule di animali che portano costrutti reporter, consentendo morfologie cellulari individuali da visualizzare nel contesto di particolari modelli di espressione genica (Figure 4D e 5) in entrambi wild type o mutanti sfondi. Abbiamo anche utilizzato la tecnica di monitorare le dinamiche di conseguenza assoni nel vivere neuroni embrionali 11, 12.

Il metodo può essere facilmente adattato per etichettare i singoli neuroni in embrioni di altri organismi, purché l'embrione è sufficientemente trasparente da esaminare sotto illuminazione DIC. Lo abbiamo usato per visualizzare la morfologia neurale in una vasta gamma di embrioni artropodi, tra cui cavallette 18, millepiedi 17, crostacei 19 e pesciolini d'argento 16.

Lo svantaggio principale del tecnicoque sta nella sua difficoltà tecnica. Confidiamo che il conto corrente dettagliata del metodo assistere i ricercatori interessati a padroneggiarlo.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della DFG a GMT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

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References

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Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).More

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

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