Summary
Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS) sunmak
Abstract
Bu yazıda tek lipofilik floresan membran işaretleyici DII arasında juxtacellular enjeksiyonu ile Drosophila melanogaster embriyonik MSS nöronları etiketlemek nasıl açıklar. Bu yöntem çok detaylı nöronal hücre morfolojisi görselleştirme sağlar. Bu CNS herhangi bir hücreyi etiketlemek mümkündür: Hedef nöronların hücre gövdeleri DIC optik altında veya GFP gibi bir floresan genetik marker ekspresyonu ile görüntülenmiştir. Etiketleme sonra, Dii iletilen ışık ve DIC optik ile hücre morfolojisi görselleştirme izin photoconversion tarafından kalıcı kahverengi leke dönüşebilir. Alternatif olarak, DII-işaretli hücrelerin genetik olarak ortaya flüoresan raportör proteinlerin colocalised alınabilecek şekilde, konfokal mikroskopi ile doğrudan izlenebilir. Bu teknik, mümkün tek bir hücre çözünürlükte mutant fenotipleri analiz etmek için yapım genotip bağımsız olarak, herhangi bir hayvan da kullanılabilir.
Introduction
Bireysel hücrelerin düzeyde nöronal morfolojinin Bilgi nöronal bağlantı ve MSS fonksiyonu anlamak için önemli bir önkoşuldur. Böylece, nörobilim ilk günlerinden itibaren, araştırmacılar tek bir hücre etiketleme teknikleri (bu konuda tarihsel bir tedavi için 7) geliştirmeye çalışmışlardır. Böyle Golgi boyama gibi klasik yöntemler nöronal morfolojinin mükemmel çözünürlük sağlayan ama bir boyama rastgele bir şekilde oluşur gibi, yönlendirilmiş bir şekilde nöron belli bir tip etikete istiyorsa uygun değildir. Bir mikroelektrot boyaların ya da hücre içi juxtacellular enjeksiyon ile tek bir hücre boyama için yöntemlerin geliştirilmesi spesifik etiketleme ihtiyacı ele.
Drosophila tek nöron boya enjeksiyon uygulaması nedeniyle organizma ve nöronlar hem küçük boyutu, büyük bir meydan okumaydı. Embriyonik Drosophila Bununla birlikte, tek bir nöron boyama 15 laboratuarda 1980'lerin sağlandı. Yöntemi son derece yararlı olmuştur ve son 20-30 yıl içinde (örneğin 2, 10) üzerinde Drosophila nöronal gelişim için mekanizmalar içine bazı temel anlayışlar sağladı da, birçok işçi büyük ölçüde nedeniyle teknik talepleri, bu uzak shied var.
Drosophila nöronal etiketleme için genetik tekniklerin daha son yıllarda durumu da nöronun boya enjeksiyon şöhreti katkıda bulunmuştur. Membran hedefli GFP yapıları gal4 yönettiği ifade nöral morfolojisi 1, 20 mükemmel çözünürlük sağlayabilir. Ancak bu yöntem bazı sınırlamaları vardır: Birden hücrelerinde GFP sık kaçınılmaz ifadesi bireysel nöronların yapısı belirsiz olabilir ve bir gal4 sürücü line ilgi belirli bir nöron ifade sürücü mevcut olmayabilir. MARCM (Bir Tecrübe ile Mozaik Analiziressible Hücre Marker) yöntemi 8 tek hücre düzeyinde aslında herhangi nöronun etiketleme, ancak başarıyla çünkü GAL80 proteinin yavaş ciro embriyo ve erken larva olarak kullanılamaz sağlayabilir.
Genetik etiketleme bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz Drosophila embriyo o nöronun boya enjeksiyonu çok değerli bir yöntemdir kalır ve geniş uygulama hak inanıyorum. Bu hedefi desteklemek için, biz burada yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Gücünü bir illüstrasyon geç Drosophila embriyo 14 abdominal neuromeres içinde internöron komple set morfolojisi bizim son hesabı tarafından sağlanmaktadır. Bireysel nöronal hücre tiplerinin morfolojik değişkenlik ve embriyonun MSS neuromere organizasyon ilkeleri hem ortaya bu çalışma, herhangi bir diğer mevcut etiketleme yöntemi ile mümkün olmazdı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biz bizim laboratuarlarımızda nöronun etiketleme yöntemi, iki biraz farklı varyantları kullandık. Farklılıklar embriyo toplama, dechorionisation, devitellinisation ve embriyo filleting adımları ile ilgilidir. Şekil 1 varyantların ortak ve ayrılan adımlar genel bir bakış sunmaktadır.
1. Boya Enjeksiyon için Embriyo Diseksiyon ve Mikropipetler için Mikro-iğneler hazırlanması
- Embriyo diseksiyon için cam iğneler bir Sutter çektirmesi (Bilim Aletleri) veya karşılaştırılabilir ekipman ile cam kapilerleri (1 mm çapında ve 0,1 mm et kalınlığı) çekilir. Alternatif olarak, bir iğne tutucuya monte edilmiş bir elektrolitik olarak sivriltilmiş 0.15 mm tungsten tel disseksiyonlarında için kullanılır. (Netlik elektrolitik Talimatları 9 verilmiştir).
- Bir Sutter çektirmesi (Bilim ile; Boya Enjeksiyon mikropipetler iç filamentler (GB 100 TF 8P Bilim Ürünler) ile ince cidarlı cam kapilerleri çekilirAraçlar) veya karşılaştırılabilir ekipmanları. Mikropipet ucu embriyonun dokulardan geçişi yardım şaft kademeli, düzgün konik, keskin olması gerekiyor. İstenilen mikropipet olarak Sutter Instrument Pipet Yemek Tarifleri kılavuzu (Son s.20 açıklanan "Yüksek Direnç Mikroelektrod, Sharp ve Uzun" çeşididir http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Enjeksiyonları kendi ipuçları keskin ve temiz kalmasını sağlamak için gerçekleştirilir önce Genellikle mikropipetler kısa çekilir.
2. Koleksiyon, Montaj ve Embryoların Diseksiyon
- Embriyo Koleksiyon. Başarıyla nöron enjeksiyon yöntemi kullanmış 17 3 aşamada 12 embriyolar, burada anlatılan. Embriyolar giderek aşamada 17 sırasında bir manikür geliştirmek ve incelemek için giderek daha zor hale gelir. İki alternatif yaklaşımlar em almak için kullanılabilirBelirli bir gelişimsel aşamada bryos.
- Sinekler maya hamur ile kaplı elma suyu-agar plaklarına gecede yumurtalarını bırakmak için izin ver. Enjeksiyonu planlanan zaman ertesi gün uygun yumurta toplama sıcaklığını ayarlayın. Ertesi gün tüm yumurtaları toplayın ve morfolojik kriterlere 3 kullanarak istenen aşamada embriyo seçin.
- Sinekler yukarıdaki gibi agar plakaları üzerinde yatıyordu, ama 25 de taze bir her 1.5 saat ° C ile agar takas izin ver Embriyoların gelişimsel aşamada gerekli ulaşana kadar, belirli bir süre için her plaka inkübe edin.
- Kimyasal Dechorionation. Agar kapalı embriyoların kazımak ve yaklaşık 10 ml Drosophila Ringer veya Fosfat salin (PBS) çözeltisi tamponlu içeren bir cam kap (örneğin Petri veya boşluğu blok) içine aktarmak için bir metal spatula kullanın. Konsantre çamaşır suyu birkaç damla ekleyin ve bir kaç dakika için kışkırtıcılıkembriyoların kapalı koryon sloughs kadar döner platform. Rezidüel çamaşır suyu kokusu kalmayıncaya kadar Zil / PBS çeşitli değişiklikler embriyolar yıkayın. Bu yıkama sırasında embriyoların sıvı yüzeyi ile temas etmediğinden emin olunuz. Aksi takdirde, şamandıra ve daha sonra manipülasyon için batığın zor olacak. Alternatif olarak, kimyasal dechorionation 4 ile açıklanacaktır sepet tekniği kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Mekanik dechorionation (bkz. Şekil 2, 1-4 adım). Transferi embriyolar agar plağından çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir slayt. Bu teybe bağlılıklarını engel olacak şekilde embriyolar ile agar transfer kaçının. Koryon biraz kırılgan hale gelene kadar embriyonun 5 ila 10 dakika kurumasını bekleyin. (Beklerken, kat tutkal ile sonradan devitellinisation için gerekli lamel - Aşağıdaki Mia vc 2.3 Mia bakınız). Bir iğne ile hafifçe her embriyonun dokunun. Koryon yarıldı ve embriyo ne bağlı kalacakedle. Hemen yukarı bakacak kendi ventral kenarları, arka arkaya 10 tanesi yaklaşık kurumasını önlemek ve hizalamak için bir agar blok transfer embriyolar.
Devitellinisation ve filleting 2.3A ve Mia vc 2.3 Mia anlatılan iki yöntemin biri kullanılarak manuel olarak yapılır.
- Ringer çözeltisi çanak önceden hazırlanmış bir mikroskop lamı üzerine bir silikon baraj Ringer birkaç damla için uygun gelişimsel aşamada tek bir dechorionated embriyo transfer. (Bulaşması bir mikroskop lamı üzerine silikon ince bir tabaka ile 3 cm kare baraj olun, daha sonra baraj merkezine 0.01% poli-L-lisin çözüm bir damla ekleyin. Silikon 24 saat donmaya bırakın.) Embriyo transferi sırasında Zil yüzeyinin altında kalmasını sağlamak, bir cam Pasteur pipeti ile embriyo transfer.
Hafifçe squeez, ince forseps bir çift ile embriyonun posterior ucundan Braceanterior sonundan geri dörtte, ince iridektomi bir makas ile yol embriyo ing. Embriyo sağ aracılığıyla kesmeyin. Amaç embriyoya en az zarar ederken sadece vitellin membran açık çatlamak. Hala pozisyonda forseps ile slayt üzerinde açıldı membran ve pozisyon ventral tarafta embriyo aşağı dışarı kolaylaştırmak için bir tungsten iğne kullanın. Embriyo poli-lisin ceket ayrılmamak gerekir.
Bir bilenmiş tungsten iğne ile Fileto embriyo. Yavaşça delmek, daha sonra dorsal orta hat boyunca uzanan gövde duvarı gözyaşı. Bu slayt yapışıyor böylece iğne kullanarak vücut duvarı üzerinde aşağı doğru itin. Vücut duvarı hasar görmesini önlemek için, ve iğne arasına yerleştirilen gut ile vücut duvarı itin. Sonra onun anterior ve posterior uçta bağırsak yoluyla gözyaşı ve onu kaldırmak için iğne kullanın. İsterseniz, ek embriyolar, aynı slayt transfer devitellinised ve filleted, zaten diğer embriyolar zarar vermemeye özen olabilirslayt. - Coat slayt merkezinde tutkal küçük bir damla koyarak ve çok ince bir film için 18 x 18 mm lamel ile yayarak heptan tutkal (bkz. Tablo 1) ile 24 x 60 mm lamel. Bir mikroskop lamı üzerine lamel yerleştirin ve kenarlarında tek taraflı yapışkan bant bir çerçeve yapmak. 10 embriyoların satır tutan blok aşırı agar kesip, hafifçe lamel heptan tutkal lamel ile embriyolar dokunun. Onlar şimdi aşağı bakacak kendi ventral taraf ile lamel uymalıdır. (Bkz. Şekil 2, 4-6 adım) embriyolar kapsayacak şekilde PBS cömert bir miktar ekleyin.
Onun arka sonuna yakın, her embriyonun sırt tarafında bir cam veya tungsten iğne ile vitellin membran nüfuz. Dorsal orta hat boyunca membran yırtarak açın ve membran embriyo dışarı sürükleyin. Doğu başka heptan tutkal alt tabaka ve bu dolgu 2.3A tarif edilenle aynı yöntemi kullanarak aşağı embriyo ventral taraf) (bkz.Şekil 2) 7-8 adımları yineleyin. Birçok embriyolar aynı slayt üzerinde filleted olacak bu yana, ya kendi yönlendirme ile çok hassas olması veya slayt üzerindeki yönelimi bir çizim yapmak için yardımcı olur.
- Ringer çözeltisi çanak önceden hazırlanmış bir mikroskop lamı üzerine bir silikon baraj Ringer birkaç damla için uygun gelişimsel aşamada tek bir dechorionated embriyo transfer. (Bulaşması bir mikroskop lamı üzerine silikon ince bir tabaka ile 3 cm kare baraj olun, daha sonra baraj merkezine 0.01% poli-L-lisin çözüm bir damla ekleyin. Silikon 24 saat donmaya bırakın.) Embriyo transferi sırasında Zil yüzeyinin altında kalmasını sağlamak, bir cam Pasteur pipeti ile embriyo transfer.
- Filleting sonra, embriyolar hafifçe PBS içinde% 7,4 formaldehit içinde 10-15 dakika süreyle sabit olabilir, PBS içinde 4 yıkar izledi. Aşırı dikkatli yüzey gerilim kuvvetleri yok edecek embriyo gibi, bu işlem sırasında çözeltinin yüzeyi ile temas haline embriyo getirmek için dikkat edilmelidir. Bu ön fiksasyon adım ille de gerekli değildir, ancak geç dönem embriyoların vücut duvarı kaslarının kasılmasını önlemek için ve genç aşamalarında embriyonik dokulara istikrara kavuşturmak için yararlıdır. Fiksasyon DIC gözlem altında embriyonun dokuları daha opak ve böylece biraz taviz görüntü kalitesi yapar unutmayın.
3. Enjeksiyon Mikropipetler doldurulması
Yarım ile bir 0.5 ml Eppendorf mikrofuge'de tüp doldurun% 100 etanol carbocynanine boya Dii (Molecular Probes, Eugene, OR) (DII yağış önlemek için 'kuru' mutlak EtOH kullandığınızdan emin olun) bir% 0.1 çözümü. Tüpün kapak içinde, dar bir delik açın ve kapak delikten mikropipet kör uç yerleştirin. DII en az 5 dakika süreyle filament yukarı çıkmak için izin ver. (Etanol buharlaşmasını önlemek için bir mikropipet doldurmuyor daima kapağı delik kapağı).
Ekipman nöron boya enjeksiyonu (Şekil 3) için gereklidir.
Mikroskop. Sabit bir mikroskobu odaklama sırasında embriyonun dikey hareketi önlemek için nöron boya enjeksiyon için kullanılmalıdır. Bu embriyo ile temas sonra herhangi bir tür hareketi pipet yerinden edecek. Biz Zeiss Axioskop FS ve Olympus AX50/BX50 sabit faz modeller hem de bu amaca uygun olarak bulduk. Mikroskop neur görselleştirme için iletilen ışık DIC optik ile donatılmış olmalıdırboyama öncesi ons. Mikroskobu da oldukça ters bir model daha dik olmalıdır. Bir inverted mikroskop ile iki embriyo ters tarafta iken dik bir mikroskop ile mikropipet ucu, görüntüleme hedefi olarak embriyonun aynı taraftadır. İkinci düzenleme DIC optik kalitesini düşürüyor. Mikroskop DII gözlem için uygun bir filtre seti ile, floresan mikroskobu için ayarlanmış olmalıdır. DII bu aralıkta birçok filtre setleri çalışacak 549 ve 565 nm eksitasyon ve emisyon maxima ile nispeten geniş spektrumlu olduğundan, Alexa 568, Cy3, Rodamin, Teksas Kırmızı veya TRITC için bu örneğin. Bu mikroskop ile el değmeden kapının açılmasını sağlamak için, flüoresan ışık kaynağının yolu elektronik kontrollü obtüratör sığdırmak için uygun olsa da, biz de etkili sadece manuel çekim ile donatılmış bir kurulum üzerinde etiketli. Son olarak, yüksek bir büyütme, yüksek nümerik apertuyeniden suya daldırma objektif enjeksiyon sırasında gözlem için gereklidir. Bu amaç, lamel olmadan kullanım için tasarlanmış olmalıdır. Biz başarıyla Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W ve Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W hedefleri kullandık.
Bir mikromanipülatör nöron boya enjeksiyonu esnasında mikropipet konumlandırmak ve taşımak için gereklidir. Biz Leica mikromanipülatör ve bir sahne monte Narashige 3 eksenli hidrolik mikromanipülatör hem kullandık.
Akım enjeksiyon için tesis ile hücre içi bir DC amplifikatör, mikropipet dan DII arasında iyontoforetik enjeksiyon için gereklidir.
4. Boya Enjeksiyon Prosedürü
- Enjeksiyon mikroskop (Şekil 3) sahne üzerine monte edilen embriyo (ler) ile kayar yerleştirin. Bir embriyo bulmak ve görüş alanının merkezi haline getirmek için 10x objektif kullanın.
- Swgörüntüleme pozisyonuna yüksek güç objektif ing ve odağa embriyo getirmek. DIC optik (veya hedef hücre GFP ifade, floresan kullanılarak) altında faiz hücre bulun ve görüş alanının merkezi haline getirmek. Mikroskop alanında diyafram öteye değil, sadece görüş alanının kenarına açılmış olduğundan emin olun. Dar bir aydınlatma ışını (Adım 4.4) mikropipet konumlandırma yardımcı olacaktır. Yine Ringer / PBS çözeltisi ile temas içinde kalırken, bu embriyo üzerinde mümkün olduğu kadar yüksek olduğu kadar amaç kaldırın.
- Embriyo ve mikropipet yolunu de açık PBS içine DC amplifikatör banyo elektrot yerleştirin.
- 0.1 M LiCl çözümü ile dolu olmuştur onun tutucu, içine enjeksiyon mikropipet yerleştirin. Mikromanipülatör mikropipet tutucu takın. Mikromanipülatör kaba denetimlerini kullanarak, nesnel ve embriyonun ucu arasındaki boşluğa mikropipet getirmek.Iyi embriyo seviyesinden olduğundan emin olun. Çünkü yüksek güç hedefi kısa çalışma mesafesi, mikropipet (bkz. Şekil 3) odak haline getirmek için sığ bir açıyla zorunda kalacaktır. Siz deneme ve ilk etapta hata ile uygun açı kurmak zorunda kalacak. Açısı çok dik ise, odak haline mikropipet ucu almak mümkün olmayacaktır. Çok sığ ise, mikropipet mili yerde banyo çözümü tutan baraj duvarına yıpratır.
- Merkezi görüş alanında mikropipet ucu. Bunu başarmak için, embriyonun seviyesine gözlerini getirmek ve mikroskop sahne Y-ekseninde ileri geri mikropipet hareket ettirin. Ucu ışık yolu geçtiğinde, ondan ışık ışınlarının parlak yansıma görürsünüz. Bu ışık ışını aşma böylece X ekseninde ileri mikropipet uç hareket ettirin. Bu, küçük mikropipet bulmak daha kolay olacaktıronun mili yerine ucu arıyorsanız yüksek güç objektif görüş alanında. Şimdi mikroskop Gözmerceklerinden bakmak ve mikropipet mili odak haline gelene kadar yavaş yavaş yüksek güç hedefi indirin. Yavaş yavaş odak haline geldiği gibi mikromanipülatör kontrolleri ile Y-ekseninde ileri geri mikropipet Hareketli, onu bulmak için yardımcı olur. Ucu görüş alanının merkezinde yer alır kadar şaft odakta olduğu zaman, X ekseninde mikropipet hareket eder. Bu aşamada mikropipet ucu de embriyonun seviyesinin üstünde olmalıdır. Floresan aydınlatma geçin ve Dii kaçak kontrol etmek için ucu inceleyin. Ucunda oluşturan herhangi Dii kristal önlemek için DC akımı ayarlayın.
- Mikromanipülatör denetimlerini kullanarak, Z-ekseninde mikropipet indirin. Mikroskop odak kontrolü ile odak haline geri getirin. Giderek bu şekilde embriyo doğru mikropipet aşağı düşürmek. Başlangıçta, kaba ile yapabilirsinizMikromanipülatör mikroskop ve Z ekseni denetimleri. Embriyo odak haline geldiği gibi Ancak, ince ayar düğmeleri geçmelisiniz.
- Embriyonun yüzey odağa söz konusu olduğunda, mikromanipülatör yönünde, görüş alanını kenarına doğru mikropipet uç hareket eder. Enjekte edilecek hücre odaklanma ve görüş alanının merkezinde yer alır kontrol edin. Mikropipet ucu üzerinde odaklanılması ve hücre olarak Y-ekseninde aynı seviyede yer alır kadar Y-ekseninde hareket ettirin. Eğer Z-ekseni de o kadar düşük X ekseninde hücreye doğru mikropipet uç hareket ettirin. Leica mikromanipülatör kullanıyorsanız, muhtemelen mikroskop sahne ucu hücre yakın alır gibi yani sahne kontrole geçmek, sen mikromanipülatör kontrollere göre X ekseninde hareket hassas kontrol sağlamak kontrol bulacaksınız.
- Hücre ile temas haline getirmek ve mikropipet uç yüzeyi üzerinde bir depresyon yapmak. Depolarizi birkaç nanoamps pasBirkaç saniye için ng mevcut. Siz hücreyi oluşturan Dii küçük bir kristal görmelisiniz. Hücre etiketli edildiğini onaylamak için, kısaca floresan ışığı ile embriyo aydınlatmak için deklanşör açın, sonra DIC geri dönün. İlgi hücre gövdesi etiketleme belirtileri gösteren, birkaç saniye daha akım uygulanır. Geçerli kapatın ve hızlı mikroskop sahne kontrol kullanarak X ekseninde mikropipet uzak embriyo çekin. Sonra, çözelti dan mikropipet çıkarın. Hiçbir DII etiketleme belirgin ise, mikropipet bloke edilebilir ve taze bir mikropipet ile değiştirilmesi gerekir. Sen mikropipet ucu ilgi hücreye giderken diğer dokuların budaklı ve bu doku yerine hücre daha lekeli olduğunu görebilirsiniz. Bu durumda, biraz mikropipet çekilmesi deneyin ve hücre yeniden yaklaşmak. Bu mikropipet değiştirin ve tekrar deneyin gerekli olabilir.
- Eğer istenirse, birden çok hücre individu olabilir,Aynı embriyo etiketli müttefiki.
- Enjeksiyon bölme içinde çözelti çoğu çıkarın, daha sonra, PBS ile 4 yıkamadan ve ardından 10 dakika boyunca% 7.4 formaldehit / PBS eklenerek embriyolar düzeltmek. Embriyo sonra uçucu, nöronal süreçleri boyunca yayılması için (kuru ya da ağartma düşmesini önlemek için) bir koyu, nemli oda içinde en az 4 saat (ya da gece boyunca 4 ° C de), oda sıcaklığında bırakılır. Bu aşamada, DII-etiketli hücreler ya photoconverted olabilir veya eş odaklı mikroskop direkt olarak izlendi.
5. DIC Optik kullanma Sınav için Photoconversion
Photoconversion ilkesi uygun dalga boyu ile aydınlatma sırasında boyanan hücre tarafından yayılan floresan ışık ile DAB (fotoğraf) oksidasyon olduğunu. Bu aydınlık hücreleri zayıf boyanan hücreler ile karşılaştırıldığında daha kısa sürede photoconverted demektir. Bir örnek olarak etiketli birden çok hücre kendi parlaklığı ile ilgili çok farklı ise bu difficu neden olabilirAynı kalitede hepsi photoconverting içinde lties (Şekil 4C bakın): Bu durumda bir zayıf hücreleri (kısa aydınlatma kullanılarak) ihmal veya parlak hücreleri (uzun aydınlatma kullanılarak) şişmeye başlayabilir olduğunu kabul arasında bir uzlaşma olabilir . Tüm hücreleri çok zayıf (dolayısıyla çok uzun aydınlatma ihtiyacı) etiketli ise, endojen peroksidaz neden arka plan bir sorun haline gelebilir. DAB zehirli olduğundan, dikkatle ele alınmalıdır. Atık beyazlatma% 7 klor ile 'devre dışı' olabilir.
- Photoconversion her bir embriyo için gerçekleştirilmelidir. Sadece tek bir embriyo slayt başına enjekte edilir durumlarda, embriyo kapsayan bir PBS çözeltisi DAB çözeltisi (3 DAB mg / ml Tris tamponu), flöresanlı bir mikroskop ve bir 100x amacı ile izlendi doldurulmuş hücre yerleştirilen slaydı ile değiştirilir. (DAB çözelti içine dik bir mikroskop kullanarak hedef eğimler ve photoconversion p sonra su ile birkaç kez temizlenmesi gerekirrocedure tamamlandığında, bir ters mikroskop kullanılıyorsa, bu) önlenebilir. Bir Cy3 filtre seti ve 100W Hg lambası kullanılır ve kahverengi bir DAB reaksiyon ürünü kadar kırmızı uyarma dalgaboyu maruz hücre (aydınlık alan aydınlatması geçerek periyodik kontrol) etiketli nöron belirgin hale gelir. Optimal DAB boyaması için alınan zaman değişkendir, ancak floresans tamamen soluk aşamasının ötesine uyarma ışığa maruz gerektirir. Photoconversion tamamlandıktan sonra, PBS ile hazırlama birkaç kez yıkayın. % 70 gliserol bir damla ile PBS değiştirin, Bistüri ile silikon kazıyınız Vazelin bir halka ile değiştirin ve bir lamel ekleyin.
- Çoklu embriyo tek bir slayt üzerinde dolu olan zaman, cam bakan embriyonun ventral tarafta ayrı bir 24 x 60 mm lamel PBS küçük bir damla, her embriyo transferi. Iyi oluşturmak ve P ile hazırlık karşılamak için her embriyonun etrafında yapışkan bant bir çerçeve yerleştirinBS. Kurumasını önlemek için photoconversion önce nemli odasında slaytlar tutun. Değişim PBS DAB çözeltisi ile embriyo kapsayan. Derhal bir 100W Hg lambası ile donatılmış bir inverted mikroskop üzerine slayt yerleştirin ve balta 50 objektif kullanarak, Dii heyecanlandırmak için ayarlanmış bir Cy3 filtre kullanın. Photoconversion sonra,% 70 gliserol bir damla taze bir slayt embriyo transferi oje ile lamel ve mühür ekleyin.
6. Konfokal Mikroskop ile İncelenmesi
- Taze bir 24 x 60 mm lamel PBS küçük bir damla adım 4.10 sonra transferi embriyo. Bu lamel doğru sırt tarafında (lamel ve embriyo arasında PBS sadece küçük bir miktar bırakarak) ile düzleştirilmiş embriyolar montaj göre en uygun optik elde etmek.
- Embriyo etrafında yapışkan bant bir çerçeve yerleştirin ve bir slayt ile kaplı olduğunda çerçeveyi doldurmak için PBS damla büyütmek. Dikkatli bir slayt yerleştirin ve oje ile sabitleyin. Dolgulu nöronlar sınav olmalıdırBir konfokal (veya floresan) mikroskop kısa sürede üzerine ined.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4, bu teknik tipik sonuçları göstermektedir, burada açıklandığı. Şekil 4A temiz bir şekilde photoconverted bir uçucu, dolu tek interneuron bir örneğini göstermektedir. Bu güzel ayrıntı miktarını bu hazırlıkların teklif göstermektedir. Non-etiketli çevreleyen doku içinde etiketli hücre mekansal bağlamda görünür hale DIC optik altında bakıldığında, korteksinde ve neuropile içinde lif projeksiyon hücre gövdesinin konumunu, örn.
Şekil 4B boya damla eşzamanlı etiketli olma birkaç komşu hücreler neden biraz çok büyük bir durumdur. Bu genellikle zor farklı hücre gövdeleri bireysel projeksiyonları ilgili kolaylaştırır. Ayrıca, doğrudan floresan mikroskop altında bakıldığında (hayır photoconversion) arka çözünürlüğü çok daha düşük olduğunu göstermektedir.
Şekil 4C örneği
Şekil 4D konfokal mikroskobu ile gözlem ayrıntılı olarak etiketli hücre morfolojisi içerdiğini göstermektedir. DII etiketleme bir GFP raportör yapı taşınan bir suşu içinde yapıldı. Bu belirli nüfus içindeki boya dolu hücre mekansal bağlamı hakkında önemli bilgiler (ve kimlik) sağlayabilir nöronal veya glial hücre tipleri (gibi gen ifade tarafından tanımlandığı şekilde).
Tanımlanmış bir nöronun morfolojik değişkenliği değerlendirmek için bir paradigma olarak biz uzantısız pozitif nöron 14 birini seçtiniz. Bu nöron diğer uzantısız pozitif nöron ayrı neuropile bir dorsal ve medial konumda yakın (dAP, Şekil 5A, Lundgren ve ark., 1995) yatıyor ve bu nedenle apGal4-UASGFP hayvanlarda kolayca tanımlanabilir. Şekil 5B dAP hücreyi gösterir O DII ve photoconverted ile doluydu. Hücre gövdesi ön komissür seviyesinde yer alır ve birinci orta hatta doğru büyür ve daha sonra bir orta bağlayıcı bölge içinde ön döner bir akson göstermektedir. Bu ucunda şişlikler ve dönüm noktası benzeri büyüme konisi vardır. Görüntü yığınlarını maksimum projeksiyonlar olarak çizilen bu hücre, 19 etiketleri Şekil 5C özetlenmiştir. Hücre morfolojisi büyük ayrıntı görünür hale gelir. Sadece birkaç hücre benzeri büyüme konisi göster yapıları; altı 19 hücrelerinin de anterior dalı her zaman daha kısa ve iyi bir geçici özellik olabilir bir şube posterior gönderebilirsiniz. Şekil 5D etiketlenmiş tüm 19 dAP hücrelerinin her hücre% 12 sadece bir donukluk olması ile dizilir. Daha fazla hücre koyu olmak alanlarda Bu sonuçlar paylaşabilirsiniz. Hücre gövdesi merkezi konumu etrafında birden fazla hücre çapı değişmekle birlikte, neuropile içinde akson mediolateral konumunu çok daha az değişir - neuropile genişliği medial iki konumdan birinde zaman bulunduğu dokuz bölüme ayrılmıştır zaman.
Şekil 1. Nöron etiketleme yöntemi adımları ve iki varyantı şematik bakış.
"Fo: content-width =" 4in "fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/ files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg>
Şekil 2. Varyant B. göre, nöron boya enjeksiyon için Drosophila embriyolar hazırlanmasında çeşitli adımlar gösteren Diyagram büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. . Boya enjeksiyon için ayar şematik üst sağ uç numune, enjeksiyon mikropipet ve banyo elektrot düzenlemesi bir büyütülmüş görünüşüdür A:. Mikromanipülatör, B: sabit faz mikroskobu. Mikromanipülatör sığ bir açıyla ayarlayın - yaklaşık 10 & de. g; C: mikropipet, D Mikropipet tutucu: plasticine, F ile sabit Hamamı elektrot: slayt, E Numune DC amplifikatör bağlantısı.
Şekil 4. Aşamada 17 embriyolar ventral sinir kablosunu Dii-etiketli internöron örnekleri. Izleme Dorsal, sol ön etmektir. Midline: noktalı çizgiler.
- Önemli bir kontralateral aksonal projeksiyon ve ipsilateral dendritik lifler (ok başı) gösteren bir mükemmel photoconverted tek bir hücre, bir örnek. DIC optik.
- birden fazla hücre etiketli olduğu bir hazırlık gösterir - bu da projeksiyon için, tek bir hücre gövdesi açık atama belirsiz olabilir.
- 8 hücre arka arkaya 3 segmentlerinde etiketlendi. Buna ek olarak, bu hazırlık photoconversion bir işareti olarak Fas2 karşı standart bir protokol antikor boyama izlemiştir.
- Bir GFP muhabiri inşa taşıyan bir sinek zorlanma konfokal mikroskopi ile belgelenmiş tek Dii dolu nöron gösterir.
Şekil 5,. Hedefli DII Etiketleme (GFP ile işaretlenmiş) Tanımlanmış bir nöronun 14 morfolojik değişkenlik aralığı ortaya koymaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
- DAP hücre (suni olarak renklendirilmiş mavi) açık bir şekilde karın uzantısız gal4-UASGFP desen (dAP, Şekil 5A, Lundgren ve ark içinde kabul edilebilirl. 1995). GFP ifade eden hücrelerin bir anti-GFP antikoru ile lekelenmiş edilmiştir. Orta hat noktalı çizgiler ile işaretlenmiştir. ac = ön komissür, pc = arka komissür.
- bir photoconverted DII doldurulmuş dAP hücre bir örneğini göstermektedir. Hücre GFP kendi ifadesi ile bir uzantısız gal4-UASGFP embriyo doldurma boya öncesinde tespit edilmiştir.
- 19 bir galeri görüntü yığınlarını maksimum projeksiyonlar olarak çizilen bu hücrenin doldurur. Dorsal manzarası. Anterior kadardır. Neuropile açık gri olup, korteks alanında koyu gri olduğunu.
- 19 dAP hücrelerin% 12 oranında bir donukluk olan her hücre ile dizilir. Hücrelerinin çoğu tarafından işgal bölgesi gri karanlık gölge vardır. Tüm numunelerin neuropile (mavi) benzer bir genişliğe ölçeklendirilir ve onlar çakışmış böylece hücrenin yanındaki anterior komissür hale getirilmiştir. Hücre gövdesi merkezi konumu etrafında birden fazla hücre çapı değişmekle birlikte, neuropile içinde akson mediyolateral konumunu gösterirdaha az varyasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir model sistem olarak Drosophila'da bir büyük avantajı, tek hücreler seviyesinde gelişme ve işlev analizi olanak sağlamasıdır. Bu hücre türleri çeşitliliği son derece yüksek olduğunu ve komşu hücrelerin fonksiyon ve morfolojisi tamamen farklı olabilir sinir sistemi, ilgili özellikle yararlıdır.
Burada mevcut yöntem ya da kalıcı bir leke veya floresan mikroskobu ile doğrudan muayene dönüştürülmüştür edilebilir bir boya ile bireysel nöronların etiketleme sağlar. Bu çok detaylı nöral süreçleri (Şekil 4) morfolojisini ortaya koymaktadır. . Embriyonik beyin için, Kunz et görmek; yöntemin önemli avantajlarından biri (embriyonik ventral sinir kablosu için, Rickert ve ark, 2011 da incelenmesi gereken MSS nöron neredeyse her tür morfolojisi olanak tanımasıdır ark., 2012). Buna ek olarak, kompleks kombinasyonlarını gerektirmezgenetik elementlerin mutlaka genetik etiketleme teknikleri çeşitli olarak, embriyo bulunması. Boya enjeksiyonlar ve böylece tek bir hücre morfolojisi vahşi tip ya da mutant arka ya da belirli bir gen ekspresyonu (Şekil 4D ve 5) kapsamında görüntülenmiştir olmasını sağlayan, haberci yapıları taşıyan hayvan hücrelerine uygulanabilir. Biz de embriyonik nöronlar 11, 12 canlı akson akıbet dinamiklerini izlemek için tekniği kullanmış.
Yöntem kolayca embriyo sağlanan diğer organizmaların embriyolar bireysel nöronlar, etiketlemek için adapte edilebilir DIC aydınlatma altında incelenebilir kadar şeffaftır. Biz çekirgeler 18, kırkayak 17, kabuklular 19 ve silverfish 16 dahil eklembacaklı embriyo, çeşitli sinirsel morfolojisi görselleştirmek için kullandık.
Teknik en önemli dezavantajıque teknik zorluk yatıyor. Biz yöntemin güncel ayrıntılı hesap mastering ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma DFG gelen GMT hibe tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
