Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

نقدم تقنية الخلايا العصبية لوصفها واحد في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من

Abstract

في هذه المادة ونحن تصف كيفية تسمية فردي الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الجنينية من ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا عن طريق الحقن juxtacellular من محبة للدهون الفلورسنت الغشاء علامة مبادرة ديزرتك الصناعية. هذا الأسلوب يسمح للتصور شكل الخلية العصبية بقدر كبير من التفصيل. فمن الممكن لتسمية أي خلية في الجهاز العصبي المركزي: أجسام الخلايا من الخلايا العصبية المستهدفة هي تصور البصريات تحت DIC أو عن طريق التعبير عن علامة وراثية الفلورسنت مثل GFP. بعد وضع العلامات، يمكن أن تتحول إلى مبادرة ديزرتك الصناعية إلى البني وصمة عار دائمة من قبل photoconversion للسماح التصور من شكل الخلية مع الضوء والبصريات المنقولة DIC. وبدلا من ذلك، يمكن ملاحظة الخلايا مبادرة ديزرتك الصناعية التي تحمل علامات مباشرة مع المجهري متحد البؤر، مما يمكن من عرض وراثيا colocalised البروتينات الفلورية مراسل. ويمكن استخدام هذه التقنية في أي حيوان، بغض النظر عن التركيب الوراثي، مما يجعل من الممكن لتحليل الظواهر متحولة في قرار خلية واحدة.

Introduction

مورفولوجيا الخلايا العصبية المعرفة على مستوى الخلايا الفردية شرطا مسبقا أساسيا لفهم وظيفة الخلايا العصبية والاتصال CNS. وهكذا، منذ الأيام الأولى لعلم الأعصاب، وسعى الباحثون لتطوير أساليب التصنيف واحد الخلية (انظر 7 لعلاج التاريخية لهذه المسألة). الطرق التقليدية مثل تلطيخ جولجي تقديم قرار ممتاز من مورفولوجيا الخلايا العصبية ولكن ليست مناسبة إذا كان أحد يسعى لتسمية نوع معين من الخلايا العصبية بطريقة موجهة، وتلطيخ يحدث بطريقة عشوائية. تناولت تطوير أساليب لتلطيخ الخلايا واحدة عن طريق الحقن داخل الخلايا أو juxtacellular من الأصباغ من مسرى مكروي شرط وضع العلامات المحددة.

تقديم الطلب من واحد حقن صبغة الخلايا العصبية لذبابة الفاكهة تحديا كبيرا، نظرا لصغر حجم الكائن الحي على حد سواء والخلايا العصبية لها. ومع ذلك، وتلطيخ الخلايا العصبية الجنينية واحدة من ذبابة الفاكهة 15. في حين أن طريقة كانت مفيدة بارز وقدم بعض الأفكار الرئيسية في آليات للتنمية الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة على مدى 20-30 سنة الماضية (على سبيل المثال 2، 10)، وقد أحجم العديد من العمال بعيدا عن ذلك، إلى حد كبير بسبب مطالبها الفنية.

وقد ساهم توفر في السنوات الأخيرة من التقنيات الوراثية لوضع العلامات العصبية في ذبابة الفاكهة أيضا إلى عدم شعبية واحدة حقن الخلايا العصبية صباغة. يمكن التعبير GAL4 الموجهة من يبني GFP غشاء المستهدفة توفير تحليل ممتاز من التشكل العصبية 1، 20. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له بعض القيود: التعبير غالبا ما لا مفر منه من GFP في خلايا متعددة يمكن أن يحجب هيكل الخلايا العصبية الفردية وخط سائق GAL4 قد لا تكون متاحة لدفع التعبير في الخلايا العصبية خاصة في المصالح. وMARCM (تحليل الفسيفساء مع معدل تقييميمكن ressible ماركر الخليوي) الطريقة 8 من الخلايا العصبية وصفها توفير أي أساسا على مستوى خلية واحدة، ولكن لا يمكن استخدامها بنجاح في وقت مبكر الجنين واليرقة بسبب بطء دوران من البروتين GAL80.

ونظرا لهذه القيود لوضع العلامات الوراثية، ونحن نعتقد أن الخلايا العصبية صبغة واحدة حقن الجنين في ذبابة الفاكهة لا تزال تقنية قيمة وتستحق أوسع التطبيق. لتعزيز هذا الهدف، ونحن نقدم هنا وصفا مفصلا للأسلوب. وتقدم مثالا للقوة من قبل حسابنا الأخير للمورفولوجية مجموعة كاملة من interneurons في neuromeres البطن من الجنين ذبابة الفاكهة أواخر 14. وهذه الدراسة التي كشفت كل من تقلب المورفولوجية من أنواع الخلايا العصبية الفردية ومبادئ منظمة قسيم عصبي في الجهاز العصبي المركزي للجنين، لم يكن ممكنا مع أي وسيلة أخرى وضع العلامات المتاحة حاليا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد استخدمنا الخيارين مختلف قليلا من أسلوب الخلايا العصبية وسم واحد في مختبراتنا. الاختلافات تتعلق جمع الجنين، dechorionisation، devitellinisation والخطوات ولبة الجنين. الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات المشتركة والمتباينة من المتغيرات.

1. إعداد الصغرى، الإبر لتشريح الأجنة وMicropipettes لحقن صبغ

  1. يتم رسمها الإبر الزجاج لتشريح الجنين من الشعيرات الدموية الزجاج (1 مم و 0.1 مم سمك الجدار) مع مجتذب سوتر (العلوم الصكوك) أو معدات قابلة للمقارنة. بدلا من ذلك، يتم استخدام شحذ الكهربائي التنغستن مم 0،15 الأسلاك التي شنت في حامل إبرة تشريح ل. (وأعطيت تعليمات لشحذ كهربائيا في 9).
  2. يتم رسمها micropipettes حقن الصبغة من الشعيرات الدموية رقيقة الجدران الزجاجية مع خيوط الداخلية (العلوم المنتجات؛ GB 100 TF 8P) مع مجتذب سوتر (العلومصكوك) أو معدات قابلة للمقارنة. غيض micropipette يجب أن يكون حادا، مع تفتق وتدريجية الموحد للعرقوب لمساعدة المرور عبر أنسجة الجنين. وmicropipette المطلوب هو "مسرى مكروي مقاومة عالية، وشارب طويل و" متنوعة، كما هو موضح في دليل p.20 من الصك سوتر الماصة كتاب الطبخ ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). عموما، يتم سحبها micropipettes قبل فترة وجيزة يتم تنفيذ الحقن لضمان البقاء على نصائح حادة ونظيفة.

2. جمع وتركيب وتشريح الجنين

  1. وصف مجموعة الجنين. لقد استخدمت بنجاح في طريقة الحقن الخلايا العصبية في الأجنة من هنا مراحل 12 حتي 17 مارس. الأجنة التطوير التدريجي لبشرة خلال مرحلة 17 و يصبح من الصعب على نحو متزايد لتشريح. نهجين البديلة المتاحة للحصول على مbryos في مرحلة تنموية معينة.
    1. السماح الذباب لتضع بيضها بين عشية وضحاها على لوحات أجار عصير التفاح المغلفة مع معجون الخميرة. ضبط درجة حرارة جمع البيض لتتناسب مع الوقت المقرر للحقن في اليوم التالي. جمع كل البيض في اليوم التالي وحدد الأجنة في مرحلة المطلوب باستخدام معايير مورفولوجية 3.
    2. السماح الذباب لتضع على لوحات أجار على النحو الوارد أعلاه، ولكن مبادلة خارج لوحة أجار مع واحد جديد كل ساعة 1،5 في 25 ° C. احتضان كل لوحة لفترة زمنية محددة، حتى الأجنة قد وصلت إلى مرحلة التطوير المطلوبة.
    1. Dechorionation الكيميائية. استخدام ملعقة معدنية لكشط قبالة أجار الأجنة ونقلها إلى سفينة الزجاج (على سبيل المثال طبق بتري أو تجويف كتلة) التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل أو ذبابة الفاكهة قارع الأجراس الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل. إضافة بضع قطرات من التبييض المركزة وتستنهض الهمم لبضع دقائق علىدوارة منصة حتى قشور المشيماء من الأجنة. غسل الأجنة في العديد من التغييرات من قارع الأجراس / PBS حتى لا تكون رائحة التبييض المتبقية. خلال هذه يغسل، تأكد من أن الأجنة لا تتلامس مع سطح السائل. خلاف ذلك، فإنها تطفو ويصبح من الصعب يغرق للتلاعب في وقت لاحق. بدلا من ذلك، أن يتم الكيميائية dechorionation من باستخدام تقنية سلة صفها 4.
    2. dechorionation الميكانيكية (انظر الشكل 2، الخطوات 1-4). الأجنة نقل من لوحة أجار إلى شريحة مغطاة على الوجهين شريط لاصق. تجنب نقل الأجنة أجار مع لأنها سوف تتداخل مع التصاق على الشريط. السماح لتجف الأجنة لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يحصل المشيماء هشة قليلا. (وفي انتظار، معطف ساترة اللازمة لdevitellinisation وقت لاحق مع الغراء - أنظر أدناه 2.3B). لمس كل الجنين بلطف مع إبرة. فإن المشيماء تقسيم مفتوحة والجنين سوف تلتزم شمال شرقedle. نقل الأجنة مباشرة إلى كتلة أجار لمنع جفاف ومحاذاة نحو 10 منهم في صف واحد، مع الجانبين بطني مواجهة.

تتم Devitellinisation والتعصيب يدويا باستخدام أي من الطريقتين الموضحة في 2.3A 2.3B و.

    1. نقل الجنين واحدة من dechorionated المرحلة التنموية المناسبة من طبق من حل قارع الأجراس لعدة قطرات من قارع الأجراس في سد سيليكون على شريحة المجهر معدة سلفا. (جعل السد 3 سم مربع من تلطيخ طبقة رقيقة من السيليكون تسرب على شريحة المجهر، ثم تضاف قطرة من حل بولي يسين-L-0.01٪ لوسط السد. السماح للسيليكون لعلاج لمدة 24 ساعة.) نقل الجنين مع ماصة باستور الزجاج، وضمان أن يبقى الجنين تحت سطح قارع الأجراس أثناء النقل.
      يستعدوا نهاية الخلفي من الجنين مع زوج من ملقط غرامة، في حين بلطف squeezجي الجنين مع زوج من مقص قطع القزحية الجميلة، نحو ربع في طريق العودة من نهايتها الأمامية. لا قطع الحق من خلال الجنين. والهدف من ذلك هو للقضاء فقط مفتوحة الغشاء المحي بينما تسبب أضرار قليلة في منطقة جنين. مع ملقط لا يزال في الموقف، استخدام إبرة التنغستن لتخفيف الجنين من الغشاء فتح وضعه أسفل الجانب البطنية على الشريحة. يجب أن الجنين التمسك معطف بولي يسين.
      فيليه الجنين مع إبرة التنغستن شحذ. خرم بلطف، ثم تمزق جدار الجسم على طول خط الوسط الظهرية. باستخدام إبرة، ودفع إلى أسفل على جدار الجسم بحيث تلتزم الشريحة. لمنع تلف جدار الجسم، ودفع جدار الجسم مع القناة الهضمية موسط بينه وبين الإبرة و. ثم استخدم إبرة المسيل للدموع من خلال القناة الهضمية في أهدافها الأمامي والخلفي ورفعه بعيدا. إذا رغبت، يمكن أن تنتقل الأجنة إضافية إلى الشريحة نفسها، وشرائح devitellinised، مع الحرص على عدم الاضرار الأجنة الأخرى بالفعل علىالشريحة.
    2. معطف 24 × 60 ملم مع ساترة الغراء هيبتان (انظر الجدول 1) عن طريق وضع قطرة صغيرة من الغراء في وسط الشريحة ونشرها مع ساترة × 18 مم 18 إلى طبقة رقيقة جدا. وضع ساترة على شريحة المجهر وجعل إطار من شريط لاصق من جانب واحد في جميع أنحاء أطرافها. قطع بعيدا أجار كتلة الزائدة من عقد من 10 صف الأجنة، المس بلطف الأجنة مع ساترة ساترة الغراء هيبتان. ينبغي أن تلتزم الآن إلى ساترة مع الجانبين أسفل بطني. إضافة كمية سخية من PBS لتغطية الأجنة (انظر الشكل 2، الخطوات 4-6).
      اختراق الغشاء المحي مع كوب أو إبرة التنغستن على الجانب الظهري من كل جنين قرب نهايته الخلفية. فتح الغشاء تمزق على طول خط الوسط الظهرية واسحب الجنين من الغشاء. توجيه الجانب الجنين إلى أسفل بطني في مكان آخر على الركيزة الغراء هيبتان وشرائح باستخدام نفس الأسلوب وصفها في 2.3A) (انظرالرقم 2، الخطوات 7-8). منذ سيتم شرائح عدة أجنة على الشريحة نفسها، فإنه من المفيد أن تكون دقيقة للغاية مع إما ميولهم أو إجراء رسم ميولهم على الشريحة.
  2. ثم بعد التقطيع إلى شرائح، قد تكون الأجنة ثابتة طفيفة لمدة 10-15 دقيقة في الفورمالديهايد 7.4٪ في برنامج تلفزيوني، بنسبة 4 في PBS يغسل. يجب توخي الحذر الشديد بعدم توجيه الجنين في اتصال مع السطح من الحل خلال هذه العملية، حيث أن القوات التوتر السطحي سوف يدمر الجنين. هذه الخطوة ما قبل التثبيت ليست ضرورية تماما، ولكن من المفيد لمنع تقلص العضلات في جدار الجسم الأجنة ومرحلة متأخرة للمساعدة في استقرار الأنسجة الجنينية في مراحل الشباب. نضع في اعتبارنا أن التثبيت لا تجعل أنسجة الجنين أكثر غموضا نوعا ما وذلك تنازلات جودة الصورة تحت الملاحظة DIC.

3. حقن ملء Micropipettes

ملء نصف أنبوب 0.5 مل إيبندورف مع microfugeحل 0.1٪ من صلاح الغيدان صبغ carbocynanine (مجسات الجزيئية، يوجين، OR) في الإيثانول بنسبة 100٪ (تأكد من استخدام 'الجافة' EtOH المطلقة لتجنب الأمطار صلاح الغيدان). جعل ثقب ضيق في غطاء للأنبوب وضعه نهاية حادة من micropipette من خلال ثقب في الغطاء. السماح للمبادرة ديزرتك الصناعية لتصعد فوق خيوط مدة لا تقل عن 5 دقائق. (أصلي دائما ثقب في الغطاء عندما لا يشغل micropipette لتجنب التبخر من الايثانول).

المعدات اللازمة لحقن الصبغة الخلايا العصبية (الشكل 3).

المجهر. يجب استخدام المجهر المرحلة الثابتة للحقن صبغة الخلايا العصبية لتجنب الحركة الرأسية من خلال التركيز على الجنين. فإن أي حركة من هذا القبيل تهجير ماصة بعد أن تتلامس مع الجنين. لقد تم العثور على كل من Axioskop زايس FS AX50/BX50 والنماذج أوليمبوس مرحلة ثابتة لتكون مناسبة تماما لهذا الغرض. يجب أن تكون مجهزة مع عدسات المجهر المنقولة DIC ضوء لرؤية رجل أعمالإضافات قبل تلطيخ. يجب أن تكون المجهر تستقيم أيضا بدلا من نموذج مقلوب. مع المجهر تستقيم، غيض من micropipette هو على نفس الجانب من الجنين كهدف مشاهدة، بينما مع مجهر مقلوب وهما على طرفي نقيض من الجنين. الترتيب الأخير ينال من نوعية البصريات DIC. يجب تعيين ما يصل المجهر للفحص المجهري مضان، مع مجموعة مرشح مناسب لمراقبة مبادرة ديزرتك الصناعية. منذ مبادرة ديزرتك الصناعية لديها مجموعة واسعة نسبيا مع الإثارة وماكسيما في الانبعاثات و 549 565 نيوتن متر مجموعات تصفية كثيرة في هذا النطاق سوف تعمل، على سبيل المثال تلك المتعلقة اليكسا 568، Cy3، رودامين، تكساس الأحمر أو TRITC. على الرغم من أنها مريحة لتناسب مصراع التحكم الإلكتروني في مسار مصدر الضوء مضان، للسماح تشغيل الغالق دون اتصال جنب مع المجهر، ونحن أيضا وصفت على نحو فعال على الإعداد الذي تم تجهيزه فقط مع مصراع دليل. وأخيرا، تضخم عالية، وارتفاع العددية apertuمطلوب إعادة الغمر بالماء الهدف للمراقبة أثناء الحقن. وينبغي تصميم هذا الهدف للاستخدام دون ساترة. وقد استخدمنا بنجاح Achroplan زايس 100x/1.0W، أوليمبوس LUMPlan 100x/1.0W FL، FL LUMPlan وأوليمبوس / IR 60x/0.9 أهداف W.

مطلوب مياداة مجهرية لوضع ونقل micropipette خلال حقن صبغة الخلايا العصبية. وقد استخدمنا كل من مياداة مجهرية لايكا ومرحلة محمولة على محور Narashige 3-مياداة مجهرية الهيدروليكية.

مطلوب مكبر للصوت داخل الخلايا DC، مع مرفق لحقن الحالي، للحقن iontophoretic من مبادرة ديزرتك الصناعية من micropipette.

4. إجراءات حقن صبغ

  1. ضع الشريحة مع الجنين شنت (ق) على مسرح المجهر حقن (الشكل 3). استخدام الهدف 10X لتحديد موقع الجنين وجعله مركز مجال الرؤية.
  2. SWجي الهدف السلطة العليا في موقف عرض وتقديم الجنين في التركيز. تحديد موقع الخلية الفائدة في ظل البصريات DIC (أو باستخدام مضان إذا كانت الخلية المستهدفة عن GFP) وجعله مركز مجال الرؤية. ضمان أن يتم فتح الحجاب الحاجز مجال المجهر فقط إلى حافة مجال الرؤية، وليس خارجها. وهناك شعاع الإضاءة الضيقة مساعدة المواقع من micropipette (راجع الخطوة 4.4 أدناه). رفع الهدف حتى يتم على أعلى مستوى ممكن فوق الجنين في حين ما زالت على اتصال مع الحل رينغر / PBS.
  3. وضع القطب الكهربائي حمام للمكبر للصوت في العاصمة PBS اضحة جيدا للجنين ومسار micropipette.
  4. إدراج micropipette الحقن في حامله، والتي تم شغلها مع حل 0،1 LiCl M. إرفاق حامل micropipette إلى مياداة مجهرية. باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية الخشنة، ليصبح micropipette في الفضاء بين غيض من موضوعية والجنين.ضمان أن تكون أعلى بكثير من مستوى الجنين. بسبب بعد مسافة قصيرة من العمل والهدف السلطة العليا، فإن micropipette أن تعقد في زاوية الضحلة من أجل جعله التركيز (انظر الشكل 3). سيكون لديك لإنشاء زاوية مناسبة عن طريق التجربة والخطأ في المقام الأول. إذا كانت الزاوية شديد الانحدار، فلن تكون قادرة على الحصول على معلومات سرية micropipette في التركيز. إذا كان ضحلة جدا، فإن رمح micropipette كريهة ضد جدار السد عقد الحل الاستحمام في المكان.
  5. مركز غيض من micropipette في مجال الرؤية. لتحقيق هذا، وجلب عينيك إلى مستوى الجنين ونقل micropipette ذهابا وإيابا في المحور Y للمرحلة المجهر. عندما طرفها يعبر مسار الضوء، سوف ترى انعكاس مشرق للأشعة الضوء من ذلك. نقل غيض من micropipette قدما في المحور X بحيث انحرفت شعاع ضوء. سيكون من الأسهل لتحديد موقع micropipette في الصغيرةمجال الرؤية للهدف السلطة العليا إذا كنت تبحث عن رمح، أكثر مما طرفها. ننظر الآن من خلال العدسات المجهر وخفض تدريجيا والهدف السلطة العليا حتى رمح من micropipette يأتي في التركيز. نقل micropipette ذهابا وإيابا في المحور Y مع الضوابط مياداة مجهرية يساعد على تحديد موقعه، لانها تأتي تدريجيا إلى التركيز. عندما رمح هو في التركيز، نقل micropipette في المحور X حتى طرفها تقع في وسط مجال الرؤية. في هذه المرحلة يجب أن يكون تلميح micropipette فوق مستوى الجنين. التحول إلى الإضاءة الفلورية ودراسة تلميح للتحقق من تسرب مبادرة ديزرتك الصناعية. ضبط DC الحالي لمنع أي مبادرة ديزرتك الصناعية من تشكيل الكريستال على الحافة.
  6. باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية، وانخفاض في micropipette Z-المحور. إعادته إلى التركيز مع تركيز الرقابة المجهر. خفض تدريجيا إلى أسفل نحو micropipette الجنين بهذه الطريقة. في البداية، يمكنك أن تفعل ذلك مع الخشنةZ-المحور ضوابط للمياداة مجهرية والمجهر. لكن، وكما يأتي الجنين في التركيز ينبغي أن تقوم بالتبديل إلى السيطرة على المقابض بشكل جيد.
  7. عندما سطح الجنين يأتي في التركيز، نقل غيض من micropipette نحو حافة مجال الرؤية، في اتجاه مياداة مجهرية. التركيز على الخلية ليتم حقنه وتأكد من انها تقع في مركز مجال الرؤية. تركيز على الطرف micropipette وتحريكه في المحور Y حتى انها تقع في نفس المستوى في المحور Y والخلية. نقل غيض من micropipette نحو الخلية في المحور X وأنتم خفضه في Z-المحور. إذا باستخدام مياداة مجهرية لايكا، وسوف تجد على الأرجح أن المرحلة المجهر تسيطر تعطيك أدق السيطرة على الحركة في محور-X من الضوابط مياداة مجهرية، بدل ذلك إلى مرحلة السيطرة كتلميح يقترب من الخلية.
  8. جعل تلميح micropipette في اتصال مع الخلية وإجراء الاكتئاب على سطحه. تمر العديد من nanoamps depolariziنانوغرام الحالي لبضع ثوان. يجب أن نرى بلورة صغيرة من مبادرة ديزرتك الصناعية على تشكيل الخلية. للتأكد من أن تم وضع الخلية، لفترة وجيزة فتح مصراع لإلقاء الضوء على الجنين مع ضوء الفلورسنت، ثم التبديل مرة أخرى إلى مدينة دبي للإنترنت. إذا كان الجسم للخلية ذات الاهتمام يظهر علامات الوسم، وتطبيق الحالي لعدة ثواني. إيقاف وسحب الحالي الجنين بسرعة بعيدا عن micropipette في المحور X باستخدام عنصر التحكم مرحلة المجهر. ثم سحب micropipette من الحل. إذا لم الوسم مبادرة ديزرتك الصناعية هو واضح، قد يتم حظر micropipette وسيتطلب استبدال مع micropipette الطازجة. قد تجد أن غيض من micropipette ومتمزق الأنسجة الأخرى في طريقها إلى الخلية من الاهتمام واتسخت هذه الأنسجة بدلا من الخلية. في هذه الحالة، حاول سحب micropipette قليلا، وإعادة الاقتراب من الخلية. قد يكون من الضروري لتحل محل micropipette وحاول مرة أخرى.
  1. إذا رغبت، يمكن أن تكون خلايا متعددة األفرادالتحالف المسمى في الجنين نفسه.
  2. إزالة معظم من الحل في غرفة الحقن، ثم إصلاح الأجنة عن طريق إضافة 7.4٪ الفورمالديهايد / PBS لمدة 10 دقيقة ثم يغسل بنسبة 4 مع PBS. ويترك الجنين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 ساعة (أو بين عشية وضحاها في C ° 4) في غرفة مظلمة ورطبة (لتجنب الوقوع أو تبيض الجاف) للسماح للمبادرة ديزرتك الصناعية في جميع أنحاء لنشر العمليات العصبية. في هذه المرحلة، قد تكون الخلايا التي تحمل علامات photoconverted مبادرة ديزرتك الصناعية أو ينظر مباشرة في المجهر متحد البؤر.

5. Photoconversion لفحص باستخدام نظارات DIC

مبدأ photoconversion هو الأكسدة (الصورة) من DAB من ضوء الفلورسنت المنبعثة من الخلية خلال الإضاءة الملون مع الطول الموجي المناسب. ويعني photoconverted الخلايا مشرق في أقصر وقت مقارنة مع الخلايا ملطخة ضعيفة. إذا وصفت عدة خلايا في واحدة العينة تختلف كثيرا فيما يتعلق معانها وهذا يمكن أن يؤدي إلى difficulties في photoconverting كل منهم في نفس النوعية (انظر الشكل 4C): في هذه الحالة يجوز لأحد أن يكون لاتخاذ قرار بشأن حل وسط بين إهمال الأضعف الخلايا (باستخدام الإضاءة قصيرة) أو قبول أن أكثر إشراقا تبدأ الخلايا في تضخم (باستخدام الإضاءة أطول) . إذا ضعيفة جدا صفت جميع الخلايا (التي تحتاج إلى إضاءة بالتالي طويلة جدا)، يمكن أن الخلفية التي تسببها الإنزيمية الذاتية تصبح مشكلة. ينبغي منذ DAB سامة يمكن التعامل معها بعناية. يمكن النفايات "إلغاء تنشيط" مع الكلور تبيض 7٪.

  1. يجب أن يتم Photoconversion لكل من الجنين بشكل فردي. في الحالات التي يتم حقن الجنين واحد فقط لكل شريحة، يتم استبدال الحل PBS تغطي الجنين مع حل DAB (3 ملغ DAB / مل العازلة تريس)، وتوضع على شريحة المجهر مضان والخلية مليئة عرضها مع هدف 100X. (باستخدام المجهر تستقيم الانخفاضات موضوعي في حل DAB ويجب تنظيف عدة مرات بالماء بعد photoconversion عانتهاء rocedure، ويمكن تجنب ذلك إذا تم استخدام المجهر المقلوب). وتستخدم مجموعة Cy3 تصفية ومصباح الزئبق و100W الخلية عرضة لموجات الإثارة الأحمر حتى منتج بني رد الفعل DAB يصبح واضحا في الخلايا العصبية المسماة (فحص دوري عن طريق التحول إلى الإضاءة الساطعة مجال). الوقت الذي يستغرقه لتلطيخ DAB الأمثل هو متغير، ولكنها تتطلب التعرض للضوء الإثارة إلى ما بعد مرحلة حيث مضان قد تلاشى تماما. بعد اكتمال photoconversion، وغسل إعداد عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. استبدال PBS مع قطرة من الجلسرين 70٪، كشط بعيدا سيليكون بشفرة المشرط، استبدال مع عصابة من الفازلين وإضافة ساترة.
  2. عندما يتم شغل أجنة متعددة على شريحة واحدة، ونقل كل جنين إلى انخفاض صغير من PBS منفصلة على ساترة × 24 مم 60 مع الجانب البطني للجنين التي تواجه الزجاج. وضع إطار حول كل شريط لاصق الأجنة لإنشاء جيدا وتغطية إعداد مع PBS. الحفاظ على الشرائح في غرفة رطبة قبل photoconversion لمنعهم من الجفاف. صرف PBS تغطي الجنين مع حل DAB. ضع الشريحة على الفور مجهر مقلوب مجهزة مصباح الزئبق 100W واستخدام عامل تصفية Cy3 تعيين لإثارة مبادرة ديزرتك الصناعية، وذلك باستخدام الفأس 50 هدف. بعد photoconversion، ونقل الجنين إلى شريحة جديدة في قطرة من الجلسرين 70٪، إضافة ساترة وختم بطلاء الأظافر.

6. الفحص بواسطة متحد البؤر المجهري

  1. بعد الخطوة 4،10 الأجنة نقل، إلى انخفاض صغير من PBS جديدة على ساترة × 24 مم 60. نحقق البصريات الأمثل من تصاعد الأجنة بالارض مع الجانب الظهري نحو ساترة (ولم يتبق سوى كمية صغيرة من PBS بين ساترة والجنين).
  2. وضع إطار من شريط لاصق حول الجنين وتوسيع انخفاض PBS لملء هذا الإطار عند تغطيتها مع شريحة. وضع شريحة على ذلك بعناية واصلاحها مع طلاء الأظافر. يجب أن تكون الخلايا العصبية ملء الامتحانINED على المجهر (أو مضان) مبائر في أقرب وقت ممكن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 4 يوضح نتائج نموذجية للتقنية، ونحن هنا تصف الشكل 4A يبين مثالا لعصبون واحد مبادرة ديزرتك الصناعية التي تم شغلها photoconverted نظيفة. فإنه يوضح لطيف كمية من التفاصيل هذه الاستعدادات العرض. عندما ينظر تحت البصريات DIC السياق المكاني للخلية وصفت داخل الأنسجة المحيطة غير المسمى تصبح مرئية، مثل الموقف من جسم الخلية داخل القشرة والإسقاط من الألياف داخل neuropile.

الرقم 4B هو الحالة التي يكون فيها قطرة صبغ كان قليلا كبيرة جدا مما أدى إلى العديد من الخلايا المجاورة يصبح المسمى في وقت واحد. وهذا يجعل من الصعب في كثير من الأحيان لربط التوقعات الفردية إلى هيئات خلية متميزة. لكنه يظهر أيضا أنه عندما ينظر مباشرة تحت المجهر الفلورسنت (لا photoconversion) قرار الخلفية هو أقل بكثير.

العينة في الشكل 4C

الرقم يدل على ان 4D المجهري متحد البؤر المراقبة التي يقوم بها يكشف عن مورفولوجيا الخلايا المسمى بالتفصيل. تم تنفيذ مبادرة ديزرتك الصناعية في وضع العلامات على السلالة التي حملت بناء مراسل GFP. وهذا قد يوفر معلومات مهمة عن السياق المكاني (والهوية) للخلية الصبغة تملأ داخل فئات معينة من السكان من الخلايا العصبية أو GLأنواع الخلايا الاتحاد العالمي للتعليم (كما هو محدد من قبل التعبير الجيني).

كنموذج لتقييم التنوع الصرفي لتحديد الخلايا العصبية اخترنا واحدة من الخلايا العصبية الإيجابية عديم الجناح 14. هذه الخلايا العصبية تقع في نهايته موقف الظهرية وسطي إلى neuropile (مديرية إدارة السجون، 5A الشكل، لوندغرين وآخرون، 1995) منفصلة عن الخلايا العصبية الأخرى إيجابية، وبالتالي عديم الجناح يسهل التعرف عليها في apGal4-UASGFP الحيوانات. يوضح الشكل 5B خلية حزب العمل الديمقراطى وقد شغل هذا مع صلاح الغيدان وphotoconverted. جسم الخلية يكمن في مستوى الصوار الأمامي ومحور عصبي يظهر أن ينمو الأولى نحو خط الوسط ومن ثم يتحول الأمامية في منطقة الضام وسطي. فقد مخروط النمو مثل تورمات في الطرف ونقطة تحول. وتتلخص 19 التسميات لهذه الخلية، والمستمدة كما الإسقاطات القصوى من مداخن صورة، في الشكل 5C. مورفولوجيا الخلايا لتصبح مرئية بقدر كبير من التفصيل. خلايا قليلة فقط تظهر مخروط النمو مثل الهياكل، وستة من الخلايا 19 ارسال أيضا فرع الخلفي الذي هو أقصر من فرع دائما الأمامي، وربما يكون ميزة عابرة. في الشكل 5D مكدسة جميع الخلايا DAP 19 المسمى مع كل خلية لها سوى غموض 12٪. هذه النتائج في المناطق الداكنة في كونها أكثر من الخلايا مشاركتها. في حين أن جسم الخلية يختلف قطرها أكثر من خلية حول موقف المركز، وموقف الناصف الوحشي من محور عصبي داخل neuropile يختلف أقل بكثير - عندما ينقسم العرض إلى تسعة أجزاء neuropile أنه يتواجد دائما في واحدة من الموقفين وسطي.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي محة عامة عن الخطوات للأسلوب وضع العلامات العصبية ومشتقاته اثنين.

"FO: المحتوى العرض =" 4in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
الشكل 2. بياني يوضح الخطوات المختلفة في إعداد الأجنة للحقن صبغة الدروسوفيلا الخلايا العصبية، وفقا لمتغير B. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. . التمثيل التخطيطي للإعداد للحقن صبغة وإدراج العلوي الأيمن هو موسع للرأي للترتيب للعينة، وmicropipette الحقن والقطب حمام A:. مياداة مجهرية، B: المرحلة المجهر الثابتة. تم تعيين مياداة مجهرية بزاوية ضحلة - 10 تقريبا وديز؛ C: Micropipette حامل مع micropipette، D: نموذج على، الشريحة E: القطب ثابتة مع حمام البلاستيسين، F: اتصال إلى مكبر للصوت DC.

الشكل 4
الشكل 4. مثال على مبادرة ديزرتك الصناعية التي تحمل علامات interneurons في الحبل البطني العصب من مرحلة الأجنة 17. الظهرية وجهات النظر، هو الأمامي إلى اليسار. خط الوسط: الخطوط المنقطة.

  1. مثال على خلية واحدة photoconverted تماما، مما يدل على الإسقاط بارزة محور عصبي والألياف المقابل المماثل شجيري (رأس السهم). DIC البصريات.
  2. يظهر إعداد وصفت فيها أكثر من خلية واحدة - وهذا يمكن أن تحجب تحديد واضح للهيئة خلية واحدة لتوقعاته.
  3. وقد وصفت 8 خلايا في 3 قطاعات على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا الإعداد أعقب photoconversion من قبل تلطيخ بروتوكول الأجسام المضادة ضد القياسية Fas2 كمعلم.
  4. يظهر واحد صلاح الغيدان مليئة الخلايا العصبية موثقة مع المجهري متحد البؤر في سلالة ذبابة تحمل مراسل GFP بناء.

الشكل 5
الشكل 5. استهدفت مبادرة ديزرتك الصناعية وضع العلامات (GFP التعبير تميزت) يكشف عن مجموعة من التقلبات المورفولوجية لتحديد 14 الخلايا العصبية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

  1. ويمكن للخلية حزب العمل الديمقراطى (أزرق اللون بشكل مصطنع) المعترف بها بشكل لا لبس فيه في نمط Gal4-UASGFP عديم الجناح في البطن (مديرية إدارة السجون، 5A الشكل، وآخرون لوندغرينلتر. 1995). وقد تم التعبير عن GFP ملطخة الخلايا مع أجسام مضادة لمكافحة GFP. تم وضع علامة خط الوسط مع الخطوط المنقطة. AC = الصوار الأمامي، وأجهزة الكمبيوتر الصوار الخلفي =.
  2. يظهر مثال عن خلية حزب العمل الديمقراطى مبادرة ديزرتك الصناعية photoconverted شغلها. وقد تم تحديد الخلية قبل صبغ ملء الجنين Gal4-UASGFP عديم الجناح من التعبير عن GFP.
  3. A معرض من 19 فلس من هذه الخلية، والمستمدة كما الإسقاطات القصوى من مداخن الصورة. الظهرية وجهات النظر. يعود الأمامي. وneuropile في الرمادي الفاتح، ومنطقة القشرة الداكنة في الرمادي.
  4. مكدسة الخلايا DAP 19 مع وجود كل خلية من التعتيم 12٪. المنطقة التي تحتلها معظم الخلايا وأحلك الظل الرمادي. وneuropile من جميع العينات (الأزرق) تم تحجيمها إلى عرض مماثل وتم تنسيق commissures الأمامي بجانب الخلية بحيث تتداخل. في حين أن جسم الخلية يختلف قطرها أكثر من خلية حول المركز الأساسي، والموقف من الناصف الوحشي محور عصبي يظهر في neuropileأقل الاختلاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

واحد الميزة الرئيسية لذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه يتيح تحليل التنمية وظيفة على مستوى الخلايا واحدة. هذا مفيد خصوصا فيما يتعلق الجهاز العصبي، حيث تنوع أنواع الخلايا عالية بشكل استثنائي وظيفة ومورفولوجيا الخلايا المجاورة يمكن أن تكون مختلفة تماما.

الأسلوب نقدم هنا يسمح بوضع العلامات على الخلايا العصبية الفردية مع صبغة التي يمكن إما أن تتحول إلى وصمة عار دائمة أو فحص المجهري مضان مباشرة. فإنه يكشف عن مورفولوجية العمليات العصبية بقدر كبير من التفصيل (الشكل 4). واحدة من أهم مزايا هذه الطريقة أنها تمكن مورفولوجية لاي نوع من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي للفحص (لسلك العصبية الجنينية البطنية، انظر Rickert وآخرون، 2011؛. للدماغ الجنين، انظر كونز وآخرون آل.، 2012). وبالإضافة إلى ذلك، أنها لا تتطلب تركيبات معقدة منالعناصر الجينية أن تكون موجودة في الجنين، والعديد من التقنيات الوراثية العلامات القيام به. قد يتم تنفيذ حقن صبغة في خلايا الحيوانات التي تحمل يبني مراسل، مما يسمح الأشكال التضاريسية لخلية فردية يمكن تصور في سياق معين أنماط التعبير الجيني (أرقام 4D و 5) في أي نوع البرية أو الخلفيات متحولة. وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا لرصد ديناميات ثمرة محور عصبي في الخلايا العصبية الجنينية يعيش 11 و 12.

يمكن تكييفها بسهولة الأسلوب لتسمية الخلايا العصبية في الأجنة الفردية من الكائنات الحية الأخرى، شريطة أن الجنين يكون شفافا بما يكفي لفحصها تحت الإضاءة DIC. وقد استخدمنا ذلك لتصور مورفولوجيا العصبية في طائفة واسعة من الأجنة المفصلية، بما في ذلك الجنادب 18، مئويات 17، 19 و القشريات الفضية 16.

أما العيب الرئيسي لTECHNIQUE تكمن في صعوبة التقنية. ونحن على ثقة من أن الحساب الجاري مفصل لطريقة تساعد الباحثين المهتمين اتقان ذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة من DFG لGMT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
  3. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  4. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
  5. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
  6. Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
  7. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  8. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  9. Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
  10. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
  11. Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
  12. Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
  13. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  14. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
  15. Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
  16. Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
  17. Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
  18. Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
  19. Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
  20. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 73، علم الأعصاب، علم الأعصاب، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، علم التشريح، ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، علوم الأعصاب، التشريح المتعلق بالأعصاب، وعلوم الحياة، والجهاز العصبي الجنيني، الجهاز العصبي المركزي، مورفولوجيا الخلايا العصبية، واحدة وضع العلامات الخلية، الجنين، المجهري والحيوان نموذج
وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K.… More

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter