Summary
Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de
Abstract
Neste artigo vamos descrever como individualmente rotular neurônios no sistema nervoso central embrionário de Drosophila melanogaster por injecção juxtacellular do DiI marcador fluorescente membrana lipofílica. Este método permite a visualização da morfologia das células neuronais em grande detalhe. É possível marcar qualquer célula no sistema nervoso central: os corpos celulares dos neurónios-alvo são visualizadas sob óptica DIC ou por expressão de um marcador fluorescente tal como GFP genética. Após a marcação, o DiI pode ser transformado em um castanho mancha permanente por fotoconversão para permitir a visualização da morfologia das células, com luz transmitida e óptica DIC. Alternativamente, as células marcadas com DiI pode ser observada directamente em microscopia confocal, permitindo geneticamente introduzidos proteínas repórter fluorescentes a ser colocalised. A técnica pode ser usada em qualquer animal, independentemente do genótipo, tornando possível a análise fenótipos mutantes a resolução de células simples.
Introduction
O conhecimento da morfologia neuronal ao nível das células individuais é um requisito chave para a compreensão da conectividade neuronal e função do SNC. Assim, desde os primeiros dias da neurociência, os pesquisadores têm procurado desenvolver técnicas única célula de rotulagem (ver 7 para um tratamento histórico da questão). Os métodos clássicos, tais como a coloração de Golgi proporcionar excelente resolução da morfologia neuronal, mas não são adequados, se se procura identificar um tipo específico de neurónios de uma forma dirigida, tal como a coloração ocorre de uma forma aleatória. O desenvolvimento de métodos para a coloração de células isoladas através de injecção intra celular ou juxtacellular de corantes a partir de um microeléctrodo dirigida a exigência de rotulagem específico.
A aplicação de uma única injecção de corante para neurónio Drosophila apresentou um desafio importante, devido ao tamanho pequeno de tanto o organismo e dos seus neurónios. No entanto, a coloração único neurónio de Drosophila embrionárias 15. Enquanto o método tem sido eminentemente útil e forneceu algumas informações importantes sobre mecanismos de desenvolvimento neuronal em Drosophila ao longo dos últimos 20-30 anos (por exemplo, 2, 10), muitos trabalhadores têm se esquivado de que, em grande parte por causa de suas exigências técnicas.
A disponibilidade nos anos mais recentes de técnicas genéticas para a rotulagem de neurônios em Drosophila também tem contribuído para a impopularidade da injeção único neurônio corante. Expressão GAL4-dirigido de construções de membrana-alvo GFP pode fornecer excelente resolução de morfologia neural 1, 20. No entanto, este método tem certas limitações: a expressão muitas vezes inevitável da GFP em células múltiplas podem obscurecer a estrutura de neurónios individuais e um condutor da linha de GAL4 pode não estar disponível para conduzir a expressão de um neurónio particular de interesse. O MarcM (Análise de mosaico com um representantemarcador de células ressible) Método 8 pode fornecer a rotulagem de qualquer neurónio essencialmente ao nível da célula individual, mas não pode ser utilizada com sucesso no embrião e larvas cedo por causa da rotação lenta da proteína GAL80.
Dadas estas limitações de rotulagem genética, acreditamos que a injecção de corante único neurónio no embrião de Drosophila continua a ser uma técnica valiosa e merece uma aplicação mais ampla. Para promover este objectivo, oferecemos aqui uma descrição detalhada do método. Uma ilustração de sua energia é fornecida pela nossa recente de conta a morfologia do conjunto completo de interneurônios neuromeres abdominais do embrião de Drosophila tardio 14. Neste estudo, o que revelou a variabilidade tanto morfológica individuais tipos de células neuronais e os princípios da organização neuromere no SNC do embrião, não teria sido possível com qualquer outro método de marcação disponíveis.
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Protocol
Temos utilizado duas variantes ligeiramente diferentes do método único neurônio rotulagem em nossos laboratórios. As diferenças referem-se à colheita de embriões, dechorionisation, devitellinisation e passos de filetagem de embriões. Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas comuns e divergentes das variantes.
1. Preparação de micro-agulhas de dissecção Embrião e Micropipetas para injeção Dye
- Agulhas de vidro para a dissecação de embriões são retirados a partir de capilares de vidro (1 mm de diâmetro e 0,1 mm Espessura da parede) com um extractor Sutter (Science Instruments) ou equipamento comparável. Alternativamente, um electroliticamente afiada 0,15 milímetros fio de tungsténio montado em um suporte de agulha é utilizado para dissecção. (Instruções para afiar eletrolítico são dadas em 9).
- Micropipetas de injeção de corantes são retirados de paredes finas, capilares de vidro com filamentos internos (Produtos de ciência; 100 GB TF 8P) com um puxador de Sutter (CiênciaInstrumentos ou equipamentos) comparáveis. A ponta de micropipeta precisa ser afiada, com uma conicidade gradual e uniforme da haste, para auxiliar a passagem através dos tecidos do embrião. A micropipeta desejado é o "microeletrodo de alta resistência, Sharp e Long" variedade, como descrito na página 20 do manual do Cookbook Sutter Instrument Pipeta ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Geralmente, micropipetas são puxados pouco antes injeções são realizadas para garantir suas pontas permanecem afiadas e limpas.
2. Coleta, Montagem e Dissecção de Embriões
- Coleta de embriões. Temos utilizado com sucesso o método de injeção neurônio descrito aqui em embriões de estágios março 12-17. Embriões desenvolver progressivamente uma cutícula durante o estágio 17 e tornar-se cada vez mais difícil para dissecar. Duas abordagens alternativas estão disponíveis para se obter inbryos em um determinado estágio de desenvolvimento.
- Permitir moscas para pôr ovos durante a noite em suco de maçã-ágar placas revestidas com pasta de levedura. Ajustar a temperatura da recolha de ovos de acordo com a hora prevista da injecção no dia seguinte. Coletar todos os ovos no dia seguinte e selecionar embriões no estágio desejado usando critérios morfológicos 3.
- Permitir que as moscas para colocar em placas de agar como descrito acima, mas trocar a placa de agar com uma nova cada 1,5 horas a 25 ° C. Incubar cada placa por um período de tempo definido, até que os embriões tenham atingido o estágio de desenvolvimento necessário.
- Dechorionation química. Usar uma espátula de metal para raspar os embriões fora do agar e transferi-los para um recipiente de vidro (por exemplo, placa de Petri ou bloco da cavidade), contendo cerca de 10 ml de Drosophila Ringer ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicione algumas gotas de lixívia concentrada e agitar por alguns minutos em umplataforma giratória até que os sloughs chorion fora os embriões. Lavar os embriões em várias mudas de Ringer / PBS até não haver cheiro de lixívia residual. Durante estas lavagens, assegurar que os embriões não entram em contacto com a superfície do líquido. Caso contrário, eles vão flutuar e tornar-se difícil para submergir para a manipulação posterior. Alternativamente, dechorionation química pode ser realizada utilizando a técnica descrita por cesto 4.
- Dechorionation mecânico (ver Figura 2, os passos 1-4). Embriões de transferência a partir da placa de agar para uma lâmina coberta com fita de dupla face adesiva. Evitar a transferência de agar com os embriões que pode interferir com a sua adesão à fita. Permitir que os embriões se secar durante 5 a 10 min até que o cório fica um pouco frágil. (Enquanto espera, revestir a lamela necessário para devitellinisation depois com cola - cf. 2.3 abaixo). Toque cada embrião delicadamente com uma agulha. O córion irá dividir aberto eo embrião vai ficar com a needle. Embriões de transferência imediatamente para um bloco de agar para evitar ressecamento e alinhar cerca de 10 deles em uma linha, com os seus lados ventral voltada para cima.
Devitellinisation filetagem e são feitas manualmente, utilizando qualquer um dos dois métodos descritos no 2.3A e 2.3b.
- Transferir um único embrião dechorionated da fase adequada de desenvolvimento a partir do prato de solução de Ringer com várias gotas de Ringer em um dique de silicone sobre uma lâmina de microscópio de pré-preparada. (Faça a barragem 3 centímetros quadrados por manchas de uma camada fina de vedante de silicone sobre uma lâmina de microscópio, em seguida, adicionar uma gota de solução a 0,01% de poli-L-lisina para o centro da represa. Permitir que o silicone de cura por 24 hr.) transferência do embrião com uma pipeta de Pasteur de vidro, assegurando que o embrião permanece abaixo da superfície da campainha durante a transferência.
Bloquear a extremidade posterior do embrião com um par de fórceps finos, enquanto suavemente Squeezção do embrião com um par de tesouras Iridectomia finas, cerca de um quarto a caminho de volta de sua extremidade anterior. Não corte para a direita através do embrião. O objectivo é o de apenas se abrir a membrana vitelina enquanto causando danos mínimos para o embrião. Com a pinça ainda em posição, utilizar uma agulha de tungsténio para facilitar o embrião para fora da membrana aberta e posicioná-la de lado ventral para baixo sobre a lâmina. O embrião deve ficar com o casaco de poli-lisina.
Embrião do filé com uma agulha de tungstênio afiadas. Perfurar suavemente, em seguida, rasgar a parede do corpo ao longo da linha média dorsal. Usando a agulha, empurre a parede do corpo para que ele adere ao slide. Para evitar danos na parede do corpo, empurrar a parede do corpo com o intestino interposto entre ele e a agulha. Em seguida, use a agulha para rasgar o intestino em suas extremidades anterior e posterior e levante-a. Se desejado, os embriões adicionais podem ser transferidos para a mesma lâmina, devitellinised e filetes, tomando cuidado para não danificar os embriões em outros jáo slide. - Revestir uma lamela de 24 x 60 mm, com cola de heptano (ver Tabela 1), colocando uma pequena gota de cola no centro da lâmina e espalhando-a com uma lamela de 18 mm x 18 a um filme muito fino. Coloque a lamela numa lâmina de microscópio e fazer uma estrutura de um lado da fita adesiva ao redor de suas bordas. Corte o excesso de agar do bloco segurando a fila de 10 embriões, tocar suavemente os embriões com a lamínula lamínula cola heptano. Eles devem agora aderir à lamela com seus lados ventral voltados para baixo. Adicionar uma quantidade generosa de PBS para cobrir os embriões (ver Figura 2, os passos 4-6).
Penetrar a membrana vitelina, com uma agulha de vidro ou de tungsténio, no lado dorsal de cada embrião perto da sua extremidade posterior. Rasgar a membrana ao longo da linha média dorsal e arraste o embrião para fora da membrana. Orientar o lado ventral do embrião para baixo em qualquer outra parte do substrato cola heptano e filetes utilizando o mesmo método descrito no 2.3A) (verA Figura 2, os passos 7-8). Uma vez que vários embriões serão filetes na mesma lâmina, é útil para qualquer ser muito preciso com a sua orientação ou fazer um desenho da sua orientação no slide.
- Transferir um único embrião dechorionated da fase adequada de desenvolvimento a partir do prato de solução de Ringer com várias gotas de Ringer em um dique de silicone sobre uma lâmina de microscópio de pré-preparada. (Faça a barragem 3 centímetros quadrados por manchas de uma camada fina de vedante de silicone sobre uma lâmina de microscópio, em seguida, adicionar uma gota de solução a 0,01% de poli-L-lisina para o centro da represa. Permitir que o silicone de cura por 24 hr.) transferência do embrião com uma pipeta de Pasteur de vidro, assegurando que o embrião permanece abaixo da superfície da campainha durante a transferência.
- Depois de filetagem, os embriões podem ser levemente fixado por 10-15 min em formaldeído a 7,4% em PBS, seguido de 4 lavagens com PBS. Extremo cuidado deve ser tomado para não trazer o embrião em contacto com a superfície da solução durante o processo, como as forças de tensão superficial irá destruir o embrião. Este passo de pré-fixação não é estritamente necessária, mas é útil para impedir a contracção dos músculos da parede do corpo em embriões de fase tardia e para ajudar a estabilizar os tecidos embrionários em estágios jovens. Ter em mente que a fixação faz os tecidos do embrião mais opaco e assim a qualidade da imagem um pouco compromissos sob observação DIC.
3. Enchimento de Micropipetas Injeção
Metade encher um Eppendorf de 0,5 ml com tubo de microcentrífugauma solução a 0,1% do corante carbocynanine DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) em etanol a 100% (não deixe de utilizar EtOH "seca" de modo a evitar a precipitação DiI). Fazer um furo estreito na tampa do tubo e insira a ponta romba da micropipeta através do orifício na tampa. Permitir que o DiI ascender até o filamento durante pelo menos 5 min. (Sempre cobrir o furo na tampa quando não preenchendo uma micropipeta para evitar a evaporação do etanol).
O equipamento necessário para a injecção do corante neurónios (Figura 3).
Microscópio. Um microscópio de fase fixa deve ser utilizada para a injecção de corante neurónio, para evitar o movimento vertical do embrião durante a focagem. Qualquer movimento tal iria deslocar a pipeta depois de ter entrado em contacto com o embrião. Encontraram-se tanto a Zeiss Axioskop FS e os modelos de estágios Olympus AX50/BX50 fixas para ser bem adequado para esta finalidade. O microscópio deve ser equipado com luz transmitida DIC óptica para a visualização de neurons antes da coloração. O microscópio deve ser também uma posição vertical, em vez de um modelo invertido. Com um microscópio vertical, a ponta da micropipeta está no mesmo lado do embrião como o objectivo de visualização, enquanto que com um microscópio invertido os dois estão em lados opostos do embrião. O último arranjo compromete a qualidade da óptica DIC. O microscópio deve ser criado para microscopia de fluorescência, com um conjunto de filtros apropriados para a observação Dil. Desde DiI tem um espectro amplo comparativamente com excitação e pico máximo em 549 e 565 nm muitos conjuntos de filtros nesta faixa vai funcionar, por exemplo, os de Alexa 568, Cy3, rodamina, Red Texas ou TRITC. Embora seja conveniente para ajustar um obturador controlado electronicamente no caminho da fonte de luz de fluorescência, para permitir a operação do obturador, sem contacto das mãos com o microscópio, também eficazmente rotulada em uma configuração que só foi equipado com um disparador manual. Finalmente, uma ampliação elevada, alta numérica aperture objectiva de imersão em água é necessária para a observação durante a injecção. Este objectivo deve ser projetado para uso sem uma lamela. Temos utilizado com sucesso o Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W e Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 objetivos W.
Um micromanipulador é necessário para posicionar e mover a micropipeta durante neurónio injecção de corante. Nós temos utilizado tanto o micromanipulador Leica e um palco montado Narashige micromanipulador hidráulico de 3 eixos.
Um amplificador DC intracelular, com a facilidade de injecção de corrente, é necessário para a injecção de DiI iontoforética da micropipeta.
4. Procedimento para a injeção de contraste
- Colocar a lâmina com o embrião montado (s) na fase de microscópio de injecção (Figura 3). Utilize uma objectiva de 10x de localizar um embrião e trazê-la para o centro do campo de visão.
- Swção o objetivo de alta potência para a posição de visualização e trazer o embrião em foco. Localizar a célula de interesse, sob óptica de DIC (ou utilizando fluorescência, se a célula alvo expressa GFP) e trazê-la para o centro do campo de visão. Certifique-se de que o diafragma de campo do microscópio é aberto apenas para a borda do campo de visão, não para além dela. Um feixe de iluminação estreita vai auxiliar na colocação da micropipeta (ver passo 4.4 abaixo). Elevar o objetivo até que seja tão alto quanto possível acima do embrião, enquanto ainda permanecem em contacto com a solução de Ringer / PBS.
- Coloque o eléctrodo do banho para o amplificador DC para o PBS bem clara do embrião e do caminho da micropipeta.
- Inserir a micropipeta de injecção no respectivo suporte, que foi cheio com uma solução 0,1 M de LiCl. Instale o suporte micropipeta para o micromanipulador. Utilizando os controlos de micromaniplador grosseiras, trazer a micropipeta para o espaço entre a ponta do objectivo e do embrião.Assegure-se que está bem acima do nível do embrião. Devido à curta distância de trabalho do objectivo de alta potência, a micropipeta terá que ser mantida a um ângulo raso de forma a trazê-la para o foco (veja a Figura 3). Você vai ter que estabelecer o ângulo adequado por tentativa e erro, em primeira instância. Se o ângulo é muito íngreme, você não será capaz de obter a ponta micropipeta em foco. Se ele for muito raso, o eixo de micropipeta irá sujar contra a parede da barragem que contém a solução de banho no lugar.
- Centro da ponta da micropipeta no campo de visão. Para alcançar este objectivo, os seus olhos para trazer o nível do embrião e mover a micropipeta para trás e para a frente no eixo Y da platina do microscópio. Quando a ponta cruza o caminho da luz, você vai ver o reflexo brilhante dos raios de luz a partir dele. Mover a ponta da micropipeta para a frente, no eixo X, de modo que ultrapassa o feixe de luz. Será mais fácil localizar a micropipeta no pequenocampo de visão do objectivo de alta potência, se você está à procura de seu eixo, em vez de sua ponta. Agora olhe através da ocular do microscópio e baixar gradualmente o objectivo de alta potência até que a haste da micropipeta entra em foco. Movendo a micropipeta e volta no eixo Y com os controles micromaniplador ajuda para localizá-lo, como ele gradualmente entra em foco. Quando o veio está em foco, mova a micropipeta no eixo X até que a sua ponta encontra-se no centro do campo de visão. Nesta fase, a ponta de micropipeta deve ser bem acima do nível do embrião. Mudar para iluminação fluorescente e examinar a ponta para verificar vazamento de DII. Ajustar a corrente contínua para evitar a formação de cristais DiI na ponta.
- Utilizando os controlos de micromaniplador, abaixar a micropipeta no eixo Z. Trazê-lo de volta ao foco com o controle de foco do microscópio. Progressivamente reduzir a micropipeta para baixo em direcção ao embrião desta maneira. Inicialmente, você pode fazer isso com o grossoEixo Z controles do micromanipulador e microscópio. No entanto, como o embrião entra em foco deve mudar para os botões de controle finas.
- Quando a superfície do embrião entra em foco, move a ponta da micropipeta para a borda do campo de vista, na direcção do micromanipulador. Concentre-se na célula a ser injectado e verificar se se encontra no centro do campo de visão. Recentrar na ponta micropipeta e movê-lo no eixo Y, até que fique ao mesmo nível no eixo Y como a célula. Mover a ponta da micropipeta para a célula no eixo X ao abaixar em que o eixo Z. Se estiver usando um micromanipulador Leica, você provavelmente vai achar que o estágio do microscópio controla dar-lhe um melhor controle de movimento no eixo X do que os controles micromaniplador, para mudar para o controle de fase como a ponta se aproxima da célula.
- Traga a ponta micropipeta em contacto com a célula e fazer uma depressão na sua superfície. Passar nanoamps vários depolariziatual ng por alguns segundos. Você deverá ver um pequeno cristal de Dil formando no celular. Para confirmar que a célula tem sido rotulado, brevemente abrir o obturador para iluminar o embrião com luz fluorescente, em seguida, voltar para o DIC. Se o corpo da célula de interesse mostra sinais de marcação, aplica corrente para vários segundos. Desligam a corrente e retirar rapidamente o embrião para longe da micropipeta no eixo X com o controle do estágio de microscópio. Em seguida, retirar a micropipeta a partir da solução. Se nenhuma rotulagem DiI é evidente, a micropipeta pode ser bloqueado e necessitará de substituição com uma micropipeta fresco. Poderá verificar que a ponta da micropipeta ter roubado outros tecidos em rota para a célula de interesse e este tecido é corado em vez da célula. Neste caso, tente retirar a micropipeta ligeiramente, e re-aproximar a célula. Pode ser necessário substituir a micropipeta e tentar de novo.
- Se desejado, as células podem ser múltiplos indivíduosaliar rotulado no mesmo embrião.
- Remover a maior parte da solução na câmara de injecção e, em seguida fixar os embriões através da adição de formaldeído de 7,4% / PBS durante 10 minutos seguido de 4 lavagens com PBS. O embrião é então deixada à temperatura ambiente durante pelo menos 4 horas (ou durante a noite a 4 ° C) numa câmara escura húmida (para evitar a descoloração ou queda seco) para permitir que o DiI para difundir processos neuronais. Nesta fase, as células marcadas com DII pode ser quer photoconverted ou visualizadas directamente por microscopia confocal.
5. Fotoconversão para Exame usando óptica DIC
O princípio da fotoconversão é a oxidação (foto-) de DAB pela luz fluorescente emitida pelas células coradas durante a iluminação com o comprimento de onda apropriado. Isto significa que as células vivas são photoconverted em tempo mais curto em comparação com as células fracamente coradas. Se várias células marcadas numa amostra difere muito quanto ao seu brilho isto pode levar a difficulties photoconverting em todos eles de qualidade mesma (ver Figura 4C): neste caso, pode-se decidir sobre um compromisso entre negligenciando as células mais fracas (com uma iluminação de curta) ou aceitar que as células vivas começam a inchar (usando mais iluminação) . Se todas as células são muito fracamente marcado (exigindo, portanto, a iluminação muito longa), de fundo causado por peroxidases endógenas podem tornar-se um problema. Desde DAB é tóxico que deve ser manuseado com cuidado. Os resíduos podem ser "desligado", com 7% de cloro de branqueamento.
- Fotoconversão deve ser efectuada para cada embrião individualmente. Nos casos em que apenas um embrião é injectado, por lâmina, a solução de PBS que cobre o embrião é substituído com uma solução de DAB (3 mg de DAB / ml de tampão Tris), a lâmina colocada num microscópio de fluorescência e a célula cheia visualizado com uma objectiva 100x. (Utilizando um microscópio vertical os mergulhos objectivas para a solução DAB e devem ser limpos várias vezes com água após a fotoconversão pROCEDIMENTO está terminado, o que pode ser evitado se um microscópio invertido é usado). Um conjunto de filtro de Cy3 e uma lâmpada de Hg de 100 W são utilizados e da célula exposta aos comprimentos de onda de excitação vermelhos até um produto castanho DAB reacção torna-se evidente no neurónio rotulada (verificar periodicamente por comutação para a iluminação de campo brilhante). O tempo necessário para a coloração óptima DAB é variável, mas exige a exposição a luz de excitação para além do estádio em que a fluorescência desapareceu completamente. Após fotoconversão está completa, lava-se a preparação de várias vezes com PBS. Substitua o PBS com uma gota de glicerol a 70%, raspe o silicone com uma lâmina de bisturi, substitua com um anel de vaselina e adicionar uma lamela.
- Quando múltiplos embriões foram preenchidos no slide um, transferir cada embrião de uma pequena gota de PBS numa lamela de 24 x 60 mm em separado, com o lado ventral do embrião de frente para o vidro. Colocar uma estrutura de fita adesiva ao redor de cada embrião para criar um poço e cobrir a preparação com PBS. Mantenha as lâminas em câmara úmida antes fotoconversão para evitar que sequem. Troca do PBS cobrindo o embrião com solução DAB. Colocar imediatamente o deslize sobre um microscópio invertido equipado com uma lâmpada de Hg de 100 W e usar um filtro Cy3 definido para excitar o DiI, utilizando ax objectiva 50. Após fotoconversão, transferir o embrião para um slide fresco em uma gota de glicerol a 70%, adicione uma lamela e selo com unhas polonês.
6. Exame por microscopia confocal
- Após o passo 4,10, transferência de embriões para uma pequena gota de PBS em um 24 x 60 mm fresco lamela. Atingimos óptica óptimas montando os embriões achatadas com o lado dorsal para a lamela (deixando apenas uma pequena quantidade de PBS entre a lamela e embrião).
- Colocar uma estrutura de fita adesiva em volta do embrião e aumentar a queda de PBS para preencher o quadro quando coberta com uma lâmina. Coloque um slide sobre isso com cuidado e corrigi-lo com unhas polonês. Neurônios cheias devem estar exameINED em um microscópio (ou de fluorescência) confocal o mais rapidamente possível.
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Representative Results
A Figura 4 ilustra os resultados típicos da técnica, é descrita aqui. Figura 4A mostra um exemplo de um interneurônio DiI cheio único que foi limpa photoconverted. Ele demonstra muito bem a quantidade de detalhes estas oferecem preparações. Quando visto sob óptica DIC contexto espacial da célula marcada no interior do tecido não-rotulada envolvente se torna visível, por exemplo, a posição do corpo da célula dentro do córtex e da projecção de fibras dentro do neurópilo.
A Figura 4B é um caso em que a gota de corante foi um pouco grande demais, resultando em várias células vizinhas tornando em simultâneo. Isso muitas vezes faz com que seja difícil relacionar projeções individuais de corpos celulares distintas. Ela também mostra que, quando visto directamente sob o microscópio de fluorescência (sem fotoconversão) resolução do fundo é muito mais baixa.
O espécime na Figura 4C
A Figura 4D mostra que a observação por microscopia confocal revela a morfologia de células marcadas em detalhe. DiI marcação foi realizada numa estirpe que transportava um constructo repórter GFP. Isso pode fornecer informações importantes sobre o contexto espacial (e identidade) da célula corante cheia dentro de populações específicas de neurônios ou glial tipos de células (tal como definido pela expressão do gene).
Como um paradigma para avaliar a variabilidade morfológica de um neurônio identificado nós escolhemos um dos neurônios ápteras positivas 14. Isto encontra-se em um neurónio estreita posição dorsal e medial ao neurópilo (dAP, Figura 5A, Lundgren et al., 1995) separado dos outros ápteras neurónios positivos e é, portanto, facilmente identificável em apGal4-UASGFP animais. Figura 5B mostra uma célula dAP que foi preenchido com DII e photoconverted. O corpo da célula encontra-se ao nível da comissura anterior e mostra um axónio que cresce no sentido da primeira linha média e, em seguida, se transforma em uma região anterior medial conjuntivo. Possui cone de crescimento como inchaços na ponta e no ponto de viragem. 19 etiquetas desta célula, desenhada como projecções a partir de pilhas de imagens máximas, estão resumidos na Figura 5C. Morfologia da célula torna-se visível a grande detalhe. Apenas poucas células mostram cone de crescimento como estruturas, seis dos 19 células também enviar uma posterior ramo que é sempre menor do que o ramo anterior e pode muito bem ser uma característica transitória. Na Figura 5D todas as 19 células marcadas Dap são empilhados com cada célula tendo apenas uma opacidade de 12%. Isso resulta em áreas que são mais escuras que as células mais compartilhá-los. Enquanto o corpo de célula varia mais do que um diâmetro de célula de cerca de a posição do centro, a posição mediolateral do axónio no neurópilo varia muito menos - quando a largura neurópilo é dividido em nove partes que reside sempre em uma das duas posições medial.
Figura 1. Resumo esquemático das etapas do método de marcação neuronal e as suas duas variantes.
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Figura 2. Diagrama ilustrando as várias etapas na preparação de embriões de Drosophila para neurônio injeção de contraste, de acordo com a variante B. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. . Representação esquemática da instalação para a injecção de corante A inserção superior direito é uma vista ampliada da disposição da amostra, a micropipeta de injecção e do eléctrodo de banho A:. Micromanipulador, B: microscópio fase fixa. O micromanipulador é definido em um ângulo raso - cerca de 10 e de. g; C: Micropipeta titular com micropipeta, D: Espécime em slide, E: eletrodo Banho fixado com plasticina, F: Conexão ao amplificador DC.
Figura 4. Exemplos de interneurônios Dil-rotulado no cordão nervoso ventral do estágio 17 embriões. Dorsal visões, anterior é para a esquerda. Linha média: linhas pontilhadas.
- Um exemplo de uma célula perfeitamente photoconverted única, que mostra uma projecção contralateral proeminente axonal e fibras dendríticas ipsilaterais (ponta de seta). Óptica DIC.
- mostra uma preparação em que mais do que uma célula foi rotulado - isto pode obscurecer a clara atribuição de uma única célula do corpo com a sua projecção.
- 8 células foram marcadas em três segmentos consecutivos. Além disso, na preparação do presente fotoconversão foi seguido por um protocolo padrão de coloração do anticorpo contra Fas2 como um ponto de referência.
- mostra um neurônio DiI cheia único documentado com microscopia confocal em uma cepa de voar carregando um repórter GFP construir.
Figura 5. Voltado DiI rotulagem (marcado pela expressão GFP) revela o intervalo de variabilidade morfológica de um neurônio identificado 14. Clique aqui para ver maior figura .
- A célula dAP (azul coloridos artificialmente) pode ser inequivocamente reconhecido dentro do padrão Gal4-UASGFP áptera no abdômen (DAP, 5A, Lundgren et uml. 1995). As células que expressam GFP foram coradas com um anticorpo anti-GFP. A linha média é marcada com linhas pontilhadas. ac = anterior comissura, pc = comissura posterior.
- mostra um exemplo de uma célula dAP photoconverted DiI-cheia. A célula foi identificado antes de tingir o preenchimento de um embrião Gal4-UASGFP áptera pela sua expressão de GFP.
- Uma galeria de 19 enche dessa célula, desenhada como projeções de máximo de pilhas de imagens. Vistas dorsal. Anterior é para cima. O neurópilo é em cinza claro, a região do córtex é em cinza mais escuro.
- As 19 células de DAP são empilhados com cada célula com uma opacidade de 12%. A região ocupada pela maioria das células tem a tonalidade mais escura de cinzento. O neurópilo de todas as amostras (azul) foi dimensionado para uma largura semelhante e as comissuras anterior ao lado da célula foram alinhadas de modo a que se sobrepunham. Enquanto o corpo de célula varia mais do que um diâmetro da célula em torno da posição central, a posição mediolateral do axónio no neurópilo mostramenor variação.
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Discussion
Uma grande vantagem da Drosophila como sistema modelo é que ele permite a análise do desenvolvimento e função do nível de células únicas. Isto é especialmente útil em relação ao sistema nervoso, onde a diversidade de tipos de células é excepcionalmente elevada e a função e morfologia de células vizinhas pode ser totalmente diferente.
O método que apresentamos aqui permite a marcação de neurónios individuais, com um corante que pode ser transformada em uma mancha permanente ou examinados directamente por microscopia de fluorescência. Ela revela a morfologia dos processos neurais em grande detalhe (Figura 4). Uma das principais vantagens do método é que ele permite que a morfologia de virtualmente qualquer tipo de neurónio no SNC a ser examinado (por o cordão nervoso embrionário ventral, ver Rickert et al, 2011;. Para o cérebro embrionário, ver Kunz et ai., 2012). Além disso, não exige combinações complexas deelementos genéticos para estar presente no embrião, como várias das técnicas de marcação genética fazer. Injecções de corante podem ser realizados em células de animais que transportam construções repórter, permitindo assim que as morfologias das células individuais para ser visualizada no contexto de padrões de expressão de genes específicos (Figuras 4D e 5) em qualquer um dos tipos selvagens ou mutantes de fundos. Também usou a técnica para monitorar a dinâmica de crescimento axonal em neurônios vivos embrionário 11, 12.
O método pode ser facilmente adaptado para rotular os neurónios individuais em embriões de outros organismos, desde que o embrião é suficientemente transparente para ser examinada sob iluminação DIC. Nós temos utilizado para visualizar a morfologia neural em uma ampla variedade de embriões de artrópodes, incluindo gafanhotos, centopéias 18 17, 19 e crustáceos silverfish 16.
A principal desvantagem da técQue reside na sua dificuldade técnica. Nós confio que a conta corrente detalhada do método irá auxiliar os pesquisadores interessados em dominar-lo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do DFG GMT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
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