Summary
Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC) de
Abstract
En este artículo se describe cómo etiquetar individualmente las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila melanogaster por inyección juxtacellular del lipofílico fluorescente Dil marcador de membrana. Este método permite la visualización de la morfología de las células neuronales en gran detalle. Es posible marcar cualquier célula en el SNC: cuerpos celulares de las neuronas diana son visualizadas bajo óptica DIC o por expresión de un marcador genético fluorescente tal como GFP. Después del marcaje, el Dil se puede transformar en una permanente mancha marrón por fotoconversión para permitir la visualización de la morfología celular con luz transmitida y la óptica DIC. Alternativamente, las células marcadas con Dil se puede observar directamente con la microscopía confocal, permite genéticamente introducidos proteínas indicadoras fluorescentes que se colocalizaban. La técnica se puede utilizar en cualquier animal, independientemente del genotipo, haciendo posible el análisis de fenotipos mutantes con una resolución de célula individual.
Introduction
El conocimiento de la morfología neuronal a nivel de células individuales es una condición previa esencial para la comprensión de la conectividad neuronal y la función del SNC. Así, desde los primeros días de la neurociencia, los investigadores han tratado de desarrollar técnicas de marcaje de células individuales (véase 7 para un tratamiento histórico de este número). Los métodos clásicos, tales como la tinción de Golgi proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal, pero no son adecuados si se busca una etiqueta en un tipo particular de neurona en forma dirigida, como la tinción se produce de una manera aleatoria. El desarrollo de métodos para la tinción de las células individuales por inyección intracelular o juxtacellular de colorantes de un microelectrodo se dirigió a la exigencia de un etiquetado específico.
La aplicación de una sola neurona de inyección de tinte para Drosophila presentó un desafío importante, debido al tamaño pequeño de tanto el organismo y sus neuronas. Sin embargo, la tinción única neurona de embriones de Drosophila 15. Mientras que el método ha sido eminentemente útil y ha dado algunas ideas clave sobre los mecanismos para el desarrollo neuronal en Drosophila en los últimos 20-30 años (por ejemplo, 2, 10), muchos trabajadores se han negado a ello, en gran parte debido a sus exigencias técnicas.
La disponibilidad en los años más recientes de técnicas genéticas para el etiquetado neuronal en Drosophila también ha contribuido a la impopularidad de la inyección de un solo tinte neurona. GAL4 expresión dirigida de los constructos de GFP específicos de membrana puede proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal 1, 20. Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones: la expresión a menudo inevitable de GFP en las células múltiples puede oscurecer la estructura de las neuronas individuales, y una línea GAL4 conductor puede no estar disponible para conducir la expresión en una neurona particular de interés. El MARCM (Análisis Mosaico con un representantemarcador de células ressible) 8 método puede proporcionar un etiquetado de esencialmente cualquier neurona en el nivel de células individuales, pero no puede ser utilizado con éxito en el embrión y larva temprana debido a la lenta rotación de la proteína GAL80.
Dadas estas limitaciones de etiquetado genética, creemos que la inyección neurona solo tinte en el embrión de Drosophila sigue siendo una técnica valiosa y merece una aplicación más amplia. Para promover este objetivo, ofrecemos aquí una descripción detallada del método. Una ilustración de su potencia es proporcionada por nuestra cuenta reciente de la morfología de la serie completa de interneuronas en neuromeres abdominales de finales de los años 14 embrión de Drosophila. Este estudio, que reveló tanto la variabilidad morfológica de los distintos tipos de células neuronales y los principios de organización neuromere en el SNC del embrión, no habría sido posible con cualquier otro método de etiquetado disponibles en la actualidad.
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Protocol
Hemos usado dos variantes ligeramente diferentes del método de etiquetado sola neurona en nuestros laboratorios. Las diferencias se refieren a la recogida de embriones, dechorionisation, devitellinisation y pasos de embrión de fileteado. Figura 1 ofrece una visión general de los pasos comunes y divergentes de las variantes.
1. Preparación de micro-agujas de disección de embriones y Micropipetas para Inyección Dye
- Agujas de vidrio para la disección de embriones se extraen de capilares de vidrio (1 mm de diámetro y 0,1 mm de grosor) con un extractor de Sutter (Ciencia Instruments) o un equipo comparable. Alternativamente, un electrolíticamente afilado alambre de tungsteno 0,15 mm montada en un soporte de aguja se utiliza para la disección. (Instrucciones para electrolítico de afilado se dan en 9).
- Micropipetas tinte de inyección se han extraído de paredes finas capilares de vidrio con filamentos interiores (Science Products, 100 GB TF 8P) con un extractor de Sutter (CienciaInstrumentos) o equipo comparable. La punta de la micropipeta necesita ser afilado, con una conicidad gradual y uniforme de la espiga para facilitar el paso a través de los tejidos del embrión. La micropipeta deseado es el "microelectrodo de alta resistencia, Sharp y largo plazo" variedad, como se describe en la página 20 del manual de Sutter Instrument libro de cocina con una pipeta ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). En general, micropipetas se tiran poco antes de las inyecciones se realizan para asegurar las puntas permanecen afiladas y limpias.
2. Recolección, montaje y disección de embriones
- Colección de Embriones. Hemos utilizado con éxito el método de inyección neurona se describe aquí en los embriones de las etapas 12 a 17 marzo. Los embriones desarrollar progresivamente una cutícula durante la etapa 17 y se convierten cada vez más difícil de diseccionar. Dos enfoques alternativos están disponibles para obtener embryos en una etapa particular del desarrollo.
- Permita que las moscas ponen sus huevos durante la noche en agar jugo de manzana, placas revestidas con pasta de levadura. Ajustar la temperatura de la recolección de huevos para adaptarse a la hora prevista de inyección el día siguiente. Recoge todos los huevos al día siguiente y seleccionar embriones en la etapa deseada utilizando criterios morfológicos 3.
- Permitir moscas a poner en placas de agar que el anterior, pero intercambiar la placa de agar con uno nuevo cada 1,5 horas a 25 ° C. Incubar cada placa para un período de tiempo definido, hasta que los embriones han alcanzado la fase de desarrollo que se requiere.
- Química dechorionation. Use una espátula de metal para raspar embriones fuera del agar y transferirlos a un recipiente de vidrio (por ejemplo, placa Petri o bloque de cavidad) que contiene aproximadamente 10 ml Drosophila Ringer o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir unas gotas de lejía concentrada y agitar durante unos minutos en unplataforma giratoria hasta los pantanos corion fuera de los embriones. Lavar los embriones en varios cambios de timbre / PBS hasta que no haya olor a lejía residual. Durante estos lavados, asegurar que los embriones no entran en contacto con la superficie del líquido. De lo contrario, flotarán y se hace difícil sumergir para la manipulación posterior. Alternativamente, dechorionation química se puede llevar a cabo usando la técnica descrita por la cesta 4.
- Dechorionation mecánica (véase la Figura 2, pasos 1-4). Embriones de transferencia de la placa de agar a un portaobjetos cubierto con cinta de doble cara adhesiva. Evitar la transferencia de agar con los embriones ya que interfieren con su adhesión a la cinta. Permita que los embriones que se seque durante 5 a 10 minutos hasta que el corion se vuelve ligeramente quebradiza. (Mientras se espera para recubrir el cubreobjetos necesario para devitellinisation después con pegamento - 2.3B ver más abajo). Toque cada embrión suavemente con una aguja. El corion se dividirá abierto y el embrión se adhiere a la needle. Transferencia de embriones inmediatamente a un bloque de agar para prevenir la resequedad y alinear unos 10 de ellos en fila, con sus lados ventral hacia arriba.
Devitellinisation y fileteado se realiza manualmente mediante uno de los dos métodos descritos en 2.3A y 2.3B.
- Transferir un único embrión dechorionated de la etapa de desarrollo apropiada en el plato de solución de Ringer con varias gotas de Ringer en una presa de silicona sobre un portaobjetos de microscopio pre-preparada. (Hacer un dique de 3 cm cuadrado untando una capa fina de sellador de silicona en un portaobjetos de microscopio, a continuación, añadir una gota de poli-L-lisina 0,01% hasta el centro de la presa. Permitir que la silicona se seque durante 24 h.) transferir el embrión con una pipeta Pasteur de vidrio, asegurándose de que el embrión permanece debajo de la superficie de la Ringer durante la transferencia.
Sujetar el extremo posterior del embrión con un par de pinzas finas, mientras que suavemente squeezING el embrión con un par de tijeras finas iridectomía, alrededor de un cuarto de vuelta de su extremo anterior. No corte derecho a través del embrión. El objetivo es romper sólo abierta la membrana vitelina mientras que causan daños mínimos para el embrión. Con las pinzas todavía en posición, utilizar una aguja de tungsteno para facilitar el embrión de la membrana se abrió y la posición de lado ventral hacia abajo en la diapositiva. El embrión debe pegarse a la capa de poli-lisina.
Filete del embrión con una aguja de tungsteno afilado. Suavemente perforar, luego romper la pared del cuerpo a lo largo de la línea media dorsal. Usando la aguja, presione hacia abajo en la pared del cuerpo para que se adhiera a la diapositiva. Para evitar daños en la pared del cuerpo, empujar la pared del cuerpo con el intestino interpuesto entre ella y la aguja. A continuación, utilice la aguja para romper a través del intestino en sus extremos anterior y posterior y retírela. Si se desea, los embriones adicionales pueden ser transferidos a la misma diapositiva, devitellinised y fileteado, teniendo cuidado de no dañar otros embriones ya enla diapositiva. - Escudo un 24 x 60 mm cubreobjetos con heptano cola (véase la Tabla 1) mediante la colocación de una pequeña gota de pegamento en el centro de la corredera y extendiéndola con un cubreobjetos de 18 x 18 mm a una película muy fina. Colocar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de microscopio y crea un marco de cinta adhesiva de un solo lado alrededor de sus bordes. Recorte el exceso de agar del bloque de la celebración de la fila de 10 embriones, toque suavemente los embriones con el cubreobjetos heptano pegamento. Ahora deberán cumplir con el cubreobjetos con sus lados ventrales hacia abajo. Añadir una cantidad generosa de PBS para cubrir los embriones (véase la Figura 2, pasos 4-6).
Penetrar en la membrana vitelina con un vidrio o una aguja de tungsteno en el lado dorsal de cada embrión cerca de su extremo posterior. Desgarrar la membrana a lo largo de la línea media dorsal y arrastre el embrión de la membrana. Oriente el lado ventral de embriones en otra parte sobre el substrato y el filete de cola heptano usando el mismo método descrito en 2.3A) (véaseLa figura 2, los pasos 7-8). Desde varios embriones se corta en filetes en el mismo portaobjetos, es útil que ser muy precisa con su orientación o hacer un dibujo de su orientación en la diapositiva.
- Transferir un único embrión dechorionated de la etapa de desarrollo apropiada en el plato de solución de Ringer con varias gotas de Ringer en una presa de silicona sobre un portaobjetos de microscopio pre-preparada. (Hacer un dique de 3 cm cuadrado untando una capa fina de sellador de silicona en un portaobjetos de microscopio, a continuación, añadir una gota de poli-L-lisina 0,01% hasta el centro de la presa. Permitir que la silicona se seque durante 24 h.) transferir el embrión con una pipeta Pasteur de vidrio, asegurándose de que el embrión permanece debajo de la superficie de la Ringer durante la transferencia.
- Tras el fileteado, los embriones pueden ser ligeramente fijado para 10 a 15 min en 7,4% de formaldehído en PBS, seguido de 4 lavados en PBS. Deberá tenerse cuidado de no llevar el embrión en contacto con la superficie de la solución durante este proceso, ya que las fuerzas de tensión superficial va a destruir el embrión. Esta etapa de pre-fijación no es estrictamente necesario, pero es útil para evitar la contracción de los músculos de la pared corporal en los embriones en fase tardía y ayudar a estabilizar los tejidos de embriones en etapas jóvenes. Tenga en cuenta que la fijación es hacer que los tejidos del embrión más opaco y por lo tanto compromete la calidad de imagen en observación DIC.
3. Llenado de inyección Micropipetas
Llene hasta la mitad un tubo Eppendorf de 0,5 ml de microfuga conuna solución al 0,1% de la Dil carbocynanine tinte (Molecular Probes, Eugene, OR) en el 100% de etanol (asegúrese de usar "seco" EtOH absoluto para evitar la precipitación DII). Hacer un agujero estrecho en la tapa del tubo e insertar el extremo romo de la micropipeta a través del agujero en la tapa. Permitir el Dil a ascender hasta el filamento durante al menos 5 min. (Siempre cubra el orificio de la tapa cuando no llenar una micropipeta para evitar la evaporación de etanol).
Equipo necesario para la neurona colorante inyección (Figura 3).
Microscopio. Un microscopio de platina fija debe ser utilizado para neurona inyección de colorante para evitar el movimiento vertical del embrión durante el enfoque. Cualquier movimiento tales desplazaría a la pipeta después de que haya entrado en contacto con el embrión. Hemos encontrado tanto la Zeiss Axioskop FS y la Olympus AX50/BX50 modelos de fases fijas a ser muy adecuado para este propósito. El microscopio debe estar equipado con óptica de luz transmitida por DIC para la visualización de neurons antes de la tinción. El microscopio también debe ser una posición vertical en lugar de un modelo invertido. Con un microscopio vertical, la punta de la micropipeta es en el mismo lado del embrión como objetivo la visualización, mientras que con un microscopio invertido los dos están en lados opuestos del embrión. La última disposición compromete la calidad de la óptica DIC. El microscopio se debe configurar para microscopía de fluorescencia, con un juego de filtros adecuado para la observación Dil. Desde Dil tiene un espectro amplio comparable con máximos de excitación y emisión a 549 y 565 nm muchos conjuntos de filtros de esta gama se trabajan, por ejemplo, aquellos para Alexa 568, Cy3, rodamina, rojo Texas o TRITC. Aunque es conveniente para ajustarse a un obturador controlado electrónicamente en el camino de la fuente de luz de fluorescencia, para permitir el funcionamiento de la obturación sin contacto de la mano con el microscopio, también efectivamente provistos, en una configuración que estaba equipado sólo con un disparador manual. Por último, un gran aumento, alto apertu numéricore objetivo de inmersión en agua es necesaria para la observación durante la inyección. Este objetivo debe ser diseñado para el uso sin cubreobjetos. Hemos utilizado con éxito el Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W y Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 W objetivos.
Un micromanipulador se requiere para colocar y mover el micropipeta durante neurona de inyección de tinte. Hemos utilizado tanto el micromanipulador Leica y una etapa de montaje Narashige 3-ejes micromanipulador hidráulico.
Un amplificador intracelular de DC, con la instalación para la inyección de corriente, se requiere para la inyección de Dil iontoforético de la micropipeta.
4. Procedimiento para la inyección de colorante
- Colocar el portaobjetos con el embrión montado (s) en la platina del microscopio de la inyección (Figura 3). Utilice un objetivo de 10x para localizar un embrión y ponerlo en el centro del campo de vista.
- SOING el objetivo de alta potencia en la posición de visión y llevar el embrión en el foco. Localizar la célula de interés bajo la óptica DIC (o usando fluorescencia si la célula objetivo expresa GFP) y ponerlo en el centro del campo de vista. Asegúrese de que el diafragma de campo del microscopio se abre justo hasta el borde del campo de vista, no más allá. Un haz de iluminación se estrecha ayudar en la colocación de la micropipeta (ver paso 4,4 abajo). Elevar el objetivo hasta que sea tan alta como sea posible por encima del embrión mientras que aún permanecen en contacto con la solución de Ringer / PBS.
- Colocar el electrodo de baño para el amplificador de DC en el bien clara del embrión y el camino de la micropipeta PBS.
- Insertar la micropipeta inyección en su soporte, que ha sido llenado con una solución 0,1 M LiCl. Coloque el soporte micropipeta para el micromanipulador. Uso de los controles secundarios micromanipulador, traer la micropipeta en el espacio entre la punta del objetivo y el embrión.Asegúrese de que está bien por encima del nivel del embrión. Debido a la corta distancia de trabajo del objetivo de alta potencia, la micropipeta tendrá que realizarse en un ángulo bajo con el fin de ponerla en foco (ver Figura 3). Usted tendrá que establecer el ángulo apropiado por ensayo y error en la primera instancia. Si el ángulo es demasiado alto, usted no será capaz de obtener la punta de la micropipeta en el foco. Si es demasiado bajo, el eje de micropipeta, ensuciará contra la pared del dique que contiene la solución de baño en su lugar.
- Centro de la punta de la micropipeta en el campo de visión. Para lograr esto, forma sus ojos al nivel del embrión y mover la micropipeta atrás y hacia adelante en el eje Y de la platina del microscopio. Cuando la punta atraviesa la trayectoria de la luz, podrás ver el brillante reflejo de los rayos de luz de la misma. Mover la punta de la micropipeta hacia adelante en el eje X de modo que rebasa el haz de luz. Será más fácil de localizar la micropipeta en la pequeñacampo de visión del objetivo de alta potencia si usted está en busca de su eje en lugar de la punta. Ahora mira a través de los oculares del microscopio y reducir gradualmente el objetivo de alta potencia hasta que el eje de la micropipeta entra en el foco. Traslado de la micropipeta atrás y hacia adelante en el eje Y con los controles micromanipulador ayuda a localizar, ya que poco a poco entra en el foco. Cuando el eje está en foco, mover la micropipeta en el eje X hasta que su extremo se encuentra en el centro del campo de visión. En esta etapa, la punta de la micropipeta debe estar bien por encima del nivel del embrión. Cambie a la iluminación de fluorescencia y examinar la punta para comprobar que no haya fugas de Dil. Ajustar la corriente continua para evitar que cualquier cristal de Dil forma en la punta.
- Uso de los controles micromanipulador, bajar la micropipeta en el eje-Z. Traerlo de vuelta en el foco con el control de enfoque del microscopio. Progresivamente más baja de la micropipeta abajo hacia el embrión de esta manera. Inicialmente, usted puede hacer esto con el gruesoEje Z controles del micromanipulador y el microscopio. Sin embargo, como el embrión entra en el foco debe cambiar a los mandos de control de calidad.
- Cuando la superficie del embrión entra en el foco, mover la punta de la micropipeta hacia el borde del campo de vista, en la dirección de la micromanipulador. Centrarse en la célula para ser inyectado y comprobar que se encuentra en el centro del campo de vista. Centrarse de nuevo en la punta de la micropipeta y lo mueve en el eje Y hasta que quede al mismo nivel que en el eje Y como la célula. Mover la punta de la micropipeta hacia la célula en el eje X como lo bajas en el eje-Z. Si se utiliza un micromanipulador Leica, usted probablemente encontrará que la platina del microscopio controla darle un mayor control de movimiento en el eje X de los controles micromanipulador, por lo que cambiar a la etapa de control como la punta se acerca a la celda.
- Llevar la punta de la micropipeta en contacto con la célula y crea una depresión en su superficie. Pase nanoamps varios de depolarizing actual durante unos segundos. Usted debe ver a un pequeño cristal de Dil se forma en la célula. Para confirmar que la célula ha sido etiquetado, brevemente abrir el obturador para iluminar el embrión con luz fluorescente, a continuación, vuelva a DIC. Si el cuerpo de la célula de interés muestra signos de etiquetado, aplicar corriente durante varios segundos más. Apagar la corriente y rápidamente tirar del embrión lejos de la micropipeta en el eje X mediante el control de platina del microscopio. A continuación, retirar la micropipeta de la solución. Si no etiquetado Dii es evidente, la micropipeta puede ser bloqueado y será necesario reemplazarlas con una micropipeta fresca. Es posible que la punta de la micropipeta ha enganchado otros tejidos en el camino a la célula de interés y este tejido se tiñe en lugar de la célula. En este caso, intente retirar la micropipeta ligeramente, y re-acercarse a la célula. Puede ser necesario reemplazar la micropipeta y vuelve a intentarlo.
- Si se desea, varias celdas pueden ser individualmentealiarse marcado en el mismo embrión.
- Eliminar la mayor parte de la solución en la cámara de inyección, a continuación, fijar los embriones mediante la adición de 7,4% de formaldehído / PBS durante 10 min seguido de 4 lavados con PBS. El embrión se dejó a temperatura ambiente durante al menos 4 h (o toda la noche a 4 ° C) en una cámara oscura, húmeda (para evitar la decoloración o la caída en seco) para permitir que el DII para difundirse a través de los procesos neuronales. En esta etapa, las células Dil-etiquetados se pueden ya sea photoconverted o ver directamente en el microscopio confocal.
5. Fotoconversión para su examen a la óptica DIC
El principio de fotoconversión es la oxidación (foto-) de DAB por la luz fluorescente emitida por la célula teñida durante la iluminación con la longitud de onda apropiada. Esto significa que las células brillantes se photoconverted en un tiempo más corto en comparación con las células débilmente teñidas. Si varias celdas marcadas en una muestra difieren demasiado en cuanto a su brillo esto puede llevar a difficulties en photoconverting todos ellos en la misma calidad (ver Figura 4): en este caso se puede tomar una decisión sobre una transacción entre descuidar las células más débiles (con iluminación corta) o aceptar que las células comienzan a hincharse más brillantes (con más iluminación) . Si todas las células son demasiado débilmente marcado (por lo que requieren iluminación muy largo), de fondo causado por peroxidasas endógenas puede convertirse en un problema. Desde DAB es tóxico se debe manipular con cuidado. Los residuos pueden ser "desactivada" con un 7% de cloro blanqueador.
- Fotoconversión debe llevarse a cabo para cada embrión individual. En los casos en que se inyecta un solo embrión por diapositiva, la solución de PBS que cubre el embrión se sustituye con una solución de DAB (3 mg DAB / ml de tampón Tris), el portaobjetos colocado en un microscopio de fluorescencia y la celda llena vieron con un objetivo de 100x. (El uso de un microscopio vertical los huecos de objetivos en la solución de DAB y se debe limpiar varias veces con agua después de la fotoconversión procedimiento está terminado; esto puede evitarse si un microscopio invertido se utiliza). Un conjunto Cy3 filtro y una lámpara de Hg de 100 W se utilizan y la célula expuesta a las longitudes de onda de excitación rojo hasta un producto de reacción marrón de DAB se hace evidente en la neurona marcada (comprobar periódicamente por el cambio a iluminación de campo brillante). El tiempo necesario para la tinción DAB óptima es variable, pero requiere la exposición a la luz de excitación más allá de la fase en que la fluorescencia se ha desvanecido por completo. Después de fotoconversión es completa, se lava la preparación varias veces con PBS. Vuelva a colocar la PBS con una caída de 70% de glicerol, raspar la silicona con una hoja de bisturí, reemplace con un anillo de vaselina y poner un cubreobjetos.
- Cuando los embriones múltiples se han llenado en la diapositiva uno, transferir cada embrión a una pequeña gota de PBS en un cubreobjetos separada 24 mm x 60 con el lado ventral del embrión hacia el cristal. Coloque un marco de cinta adhesiva alrededor de cada embrión para crear una bien y cubra la preparación con PBS. Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda antes fotoconversión para evitar que se reseque. Cambio de la PBS que cubre el embrión con una solución de DAB. Inmediatamente colocar el portaobjetos en un microscopio invertido equipado con una lámpara de Hg de 100 W y utilizar un filtro de Cy3 configurado para excitar el DiI, usando hacha 50 objetivo. Después de fotoconversión, transferir el embrión a una diapositiva fresco en una gota de 70% de glicerol, añadir un cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas.
6. El examen por microscopía confocal
- Después del paso 4,10, embriones de transferencia a una pequeña gota de PBS en un cubreobjetos fresco 24 mm x 60. Logramos óptica óptimos mediante el montaje de los embriones aplanadas con el lado dorsal hacia el cubreobjetos (dejando sólo una pequeña cantidad de PBS entre el cubreobjetos y el embrión).
- Coloque un marco de cinta adhesiva alrededor del embrión y ampliar la gota PBS para llenar el marco cuando se cubre con una diapositiva. Coloque una diapositiva en él con cuidado y fijarla con esmalte de uñas. Neuronas deben ser llenadas examenINED en un confocal (o de fluorescencia) microscopio tan pronto como sea posible.
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Representative Results
La Figura 4 ilustra los resultados típicos de la técnica, como se describe aquí. Figura 4A muestra un ejemplo de un Dil llena interneuron único que se photoconverted limpiamente. Es muy bien demuestra la cantidad de detalle que ofrecen estas preparaciones. Cuando se observa bajo la óptica DIC el contexto espacial de la celda marcada dentro del tejido circundante no marcado se hace visible, por ejemplo, la posición del cuerpo de la celda dentro de la corteza y de la proyección de la fibra dentro de la neuropile.
La Figura 4B es un caso donde la caída de tinte era un poco demasiado grande resulta en varias células vecinas convirtiendo con etiqueta. A menudo, esto hace que sea difícil de relacionar las proyecciones individuales a los cuerpos celulares distintos. También muestra que cuando directamente se observa bajo el microscopio de fluorescencia (no fotoconversión) resolución de fondo es mucho menor.
La muestra en la Figura 4C
La Figura 4D muestra que la observación por microscopía confocal revela la morfología de las células marcadas en detalle. Dil etiquetado se llevó a cabo en una cepa que lleva un constructo reportero GFP. Esto puede proporcionar información importante sobre el contexto espacial (y la identidad) de la célula tinte lleno dentro de poblaciones específicas de neuronas o glial tipos celulares (según la definición de la expresión génica).
Como paradigma para evaluar la variabilidad morfológica de una neurona identificado hemos elegido una de las neuronas ápteros positivos 14. Esta neurona está en una posición de cierre dorsal y medial a la neuropile (DAP, la Figura 5A, Lundgren et al., 1995) separada de las otras neuronas positivas ápteros y por lo tanto es fácilmente identificable en apGal4-UASGFP animales. Figura 5B muestra una célula dAP que se llenó con Dil y photoconverted. El cuerpo de la célula se encuentra en el nivel de la comisura anterior y muestra un axón que primero crece hacia la línea media y luego se convierte en una región anterior conectivo medial. Cuenta con cono de crecimiento, como protuberancias en la punta y en el punto de inflexión. 19 etiquetas de esta célula, dibujado como proyecciones máximas de las pilas de imágenes, se resumen en la Figura 5C. La morfología celular se hace visible a gran detalle. Sólo unas pocas células muestran cono de crecimiento como estructuras, seis de los 19 células también enviar un posterior rama que es siempre más corta que la rama anterior y así puede ser una característica transitoria. En la Figura 5D todas 19 las células marcadas DAP se apilan con cada célula que tiene sólo una opacidad del 12%. Esto da lugar a áreas que son más oscuras que las células más compartirlos. Mientras que el cuerpo de la célula varía más de un diámetro celular alrededor de la posición central, la posición mediolateral del axón en el neuropile varía mucho menos - cuando el ancho neuropile se divide en nueve partes de las que reside siempre en una de las dos posiciones mediales.
Figura 1. Visión esquemática de los pasos del método de etiquetado neurona y sus dos variantes.
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Figura 2. Diagrama que ilustra los diversos pasos en la preparación de embriones de Drosophila para neurona inyección de tinte, según la variante B. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. . Representación esquemática de la configuración de inyección de tinte El inserto superior derecha es una vista ampliada de la disposición de la muestra, la micropipeta de inyección y el electrodo de baño de A:. Micromanipulador, B: microscopio de fase fija. El micromanipulador se fija en un ángulo pequeño - aproximadamente el 10 & de. g; C: titular Micropipetas con micropipeta, D: Muestra de la diapositiva, E: Electrodo de baño fijado con plastilina, F: Conexión al amplificador de CC.
Figura 4. Ejemplos de interneuronas Dil-marcadas en el cordón nervioso ventral de embriones de etapa 17. Dorsal puntos de vista, es anterior a la izquierda. La línea media: líneas de puntos.
- Un ejemplo de una sola célula perfectamente photoconverted, que muestra una prominente proyección contralateral axonal y fibras ipsilaterales dendríticas (punta de flecha). Óptica DIC.
- muestra una preparación en la que se marcó más de una celda - esto puede oscurecer la clara asignación de un cuerpo de célula única para su proyección.
- 8 células han sido etiquetados en 3 segmentos consecutivos. Además, en esta preparación la fotoconversión fue seguido por un protocolo de tinción estándar de anticuerpos contra FAS2 como un punto de referencia.
- muestra un solo Dil lleno de neurona documentado con microscopía confocal en una cepa de mosca que lleva un reportero GFP construir.
Figura 5. Dirigido Dil etiquetado (marcado por la expresión GFP) revela el rango de variabilidad morfológica de una neurona identificado 14. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
- La célula DAP (artificialmente de color azul) pueden ser inequívocamente reconocido dentro de la apterous Gal4-UASGFP patrón en el abdomen (DAP, la Figura 5A, Lundgren et unal. 1995). Las células que expresan GFP han sido teñidos con un anticuerpo anti-GFP. La línea media está marcado con líneas de puntos. ac = comisura anterior, pc = comisura posterior.
- muestra un ejemplo de una célula dAP photoconverted Dil-llenado. La célula fue identificado antes de teñir de llenado en un apterous Gal4-UASGFP embrión por su expresión de GFP.
- Una galería de 19 llena de esta célula, elaborado como proyecciones máximas de pilas de imágenes. Puntos de vista dorsal. Anterior es hacia arriba. El neuropile es de color gris claro, el área de la corteza se encuentra en un gris más oscuro.
- Las 19 células de DAP se apilan con cada célula que tiene una opacidad de 12%. La región ocupada por la mayoría de las células tiene el tono más oscuro del gris. El neuropile de todas las muestras (azul) se redujo a una anchura similar y las comisuras anterior próximo a la célula fueron alineados para que se solapaban. Mientras que el cuerpo de la célula varía más de un diámetro celular alrededor de la posición central, la posición mediolateral del axón dentro de la muestra neuropilemenor variación.
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Discussion
Una ventaja importante de Drosophila como sistema modelo es que permite el análisis del desarrollo y la función en el nivel de células individuales. Esto es especialmente útil en relación con el sistema nervioso, donde la diversidad de tipos de células es excepcionalmente alta y la función y la morfología de las células vecinas pueden ser totalmente diferentes.
El método que aquí presentamos permite el etiquetado de las neuronas individuales con un colorante que puede ser transformado en una mancha permanente o examinados directamente por microscopía de fluorescencia. Se revela la morfología de los procesos neuronales con gran detalle (Figura 4). Una de las principales ventajas del método es que permite la morfología de prácticamente cualquier tipo de neurona en el sistema nervioso central a ser examinada (para el cordón nervioso ventral embrionario, ver Rickert et al, 2011;. Para el cerebro embrionario, ver Kunz et al., 2012). Además, no requiere complejas combinaciones deelementos genéticos para estar presente en el embrión, como varias de las técnicas de etiquetado genéticos hacer. Inyecciones de medio de contraste puede llevarse a cabo en células de animales que portan construcciones reporteras, permitiendo así morfologías celulares individuales para ser visualizados en el contexto de determinados patrones de expresión génica (Figuras 4D y 5) en tipo salvaje o mutantes antecedentes. También hemos utilizado la técnica para supervisar la dinámica de axón en neuronas embrionarias vivir 11, 12.
El método se puede adaptar fácilmente para etiquetar las neuronas individuales en embriones de otros organismos, a condición de que el embrión es lo suficientemente transparente como para ser examinada bajo iluminación DIC. Lo hemos utilizado para visualizar la morfología neuronal en una amplia variedad de embriones de artrópodos, incluyendo saltamontes 18, ciempiés, crustáceos 17 19 y pececillos de plata 16.
La principal desventaja de la técnicaQue reside en su dificultad técnica. Confiamos en que la cuenta corriente detallada del método ayudará a los investigadores interesados en el dominio de la misma.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de la DFG en GMT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB |  Sigma-Aldrich |
D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes |
D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth |
3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth |
4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories |
H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC - amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel |
BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel |
BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg |
outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior |
1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1. |
|||
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
