Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos Published: March 4, 2013 doi: 10.3791/50150
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Institute of Genetics, University of Mainz, 2Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne

Summary

Vi presenterar en teknik för märkning enstaka neuroner i det centrala nervsystemet (CNS) hos

Abstract

I den här artikeln beskriver vi hur individuellt för att märka neuroner i embryonala CNS av Drosophila melanogaster genom juxtacellular injektion av lipofila fluorescerande membran markör Dil. Denna metod medger visualisering av neuronal cellmorfologi i detalj. Det är möjligt att märka någon cell i CNS: cellkroppar mål nervceller visualiseras i DIC optik eller genom uttryck av en fluorescerande genetisk markör som GFP. Efter märkning kan Dil omvandlas till en permanent brun fläck på photoconversion att tillåta visualisering av cellmorfologi med ljus och DIC optik. Alternativt, kan de Dil-märkta cellerna observeras direkt med konfokalmikroskopi, möjliggör genetiskt införts fluorescerande reporter proteiner som skall colocalised. Tekniken kan användas i alla djur, oavsett av genotyp, vilket gör det möjligt att analysera mutanta fenotyper vid enda cell upplösning.

Introduction

Kunskap om neuronal morfologi vid enskilda celler är en viktig förutsättning för att förstå nervkopplingar och CNS-funktion. Således, från de tidigaste dagarna av neurovetenskap, har forskare försökt utveckla enskilda tekniker cell märkning (se 7 för en historisk behandling av denna fråga). Klassiska metoder såsom Golgi färgning ger utmärkt upplösning av neuronal morfologi men är inte lämpliga om man försöker märka en viss typ av neuron i ett riktat sätt, såsom färgning sker på ett slumpmässigt sätt. Utvecklingen av metoder för färgning enstaka celler genom intracellulära eller juxtacellular injektion av färgämnen från en mikroelektrod riktat kravet på särskild märkning.

Tillämpningen av enda neuron färgämne injektion till Drosophila en stor utmaning på grund av den lilla storleken på både organismen och dess nervceller. Trots enda neuron färgning av embryonala Drosophila 15. Medan metoden har i högsta grad användbar och har gett några viktiga insikter mekanismer för neuronal utveckling i Drosophila de senaste 20-30 åren (t.ex. 2, 10), har många arbetare skyggat från det, till stor del på grund av dess tekniska krav.

Tillgången på senare år av genetiska tekniker för neuronal märkning i Drosophila har också bidragit till impopularitet enda neuron färgämne injektion. GAL4-riktad uttryck av membran riktade GFP konstruktioner kan ge utmärkt upplösning av neurala morfologi 1, 20. Emellertid har denna metod vissa begränsningar: det ofta oundviklig uttryck av GFP i flera celler kan skymma struktur i enskilda neuroner och en GAL4 förare linje kanske inte är tillgängliga för att driva expression i en särskild neuron av intresse. Den marcm (Mosaik analys med ett repressible cellmarkör) metod 8 kan ge märkning av väsentligen varje neuron på individuell cellnivå, men kan inte med framgång användas i embryot och tidig larv grund av den långsamma omsättningen av GAL80-proteinet.

Med tanke på dessa begränsningar genetisk märkning, tror vi att enda neuron färgämne injektion i Drosophila embryot fortfarande en värdefull teknik och förtjänar bredare tillämpning. För att främja detta mål, tillhandahåller vi här en detaljerad beskrivning av metoden. En illustration av sin makt ges av vår senaste hänsyn till morfologi fullständig uppsättning interneuronen i buken neuromeres av den sena Drosophila embryot 14. Denna studie, som visade både den morfologiska variationen av individuella neuronala celltyper och principerna för neuromere organisation i CNS hos embryot, skulle inte ha varit möjligt med någon annan tillgänglig märkning metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vi har använt två något olika varianter av enda neuron märkningsmetod i våra laboratorier. Skillnaderna avser embryosamlingen, dechorionisation, devitellinisation och embryo steg filetering. Figur 1 ger en översikt över de vanligaste och divergerande steg varianterna.

1. Beredning av Micro-nålar för embryon Dissection och Mikropipetter för Dye injektion

  1. Glas nålar för embryo dissektion dras från glaskapillärer (1 mm i diameter och 0,1 mm väggtjocklek) med en Sutter avdragare (Science Instruments) eller jämförbar utrustning. Alternativt används en elektrolytiskt slipad 0,15 mm volframtråd monterad i en nålhållare för dissektioner. (Anvisningar för elektrolytisk slipning ges i 9).
  2. Dye Injection mikropipetter kommer från tunnväggiga glas kapillärer med inre filament (Science Produkter, S 100 TF 8P) med en Sutter avdragare (ScienceInstrument) eller jämförbar utrustning. Mikropipetten spets måste vara skarp, med en gradvis, jämn avsmalning av skaftet för att underlätta passage genom vävnader i embryot. Den önskade mikropipett är "hög resistans mikroelektrod, Sharp och Long" sort, som beskrivs på s.20 i Sutter Instrument Pipettera kokbok handbok ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Generellt är mikropipetter dras strax innan injektioner utförs för att säkerställa sina tips förblir skarpa och rena.

2. Insamling, Montering och Dissektion av embryon

  1. Embryosamlingsgrupp. Vi har framgångsrikt använt neuron injektionen som beskrivs här i embryon från steg från 12 till 17 mars. Embryon utvecklas successivt ett nagelband under steg 17 och blir allt svårare att dissekera. Två alternativa metoder finns tillgängliga för att erhålla dembryos vid en speciell utvecklingsstadium.
    1. Låt flugor att lägga ägg natten på äppeljuice-agarplattor belagda med jäst pasta. Justera temperaturen på insamling av ägg för att passa den planerade tidpunkten för injektion nästa dag. Samla alla ägg nästa dag och välj embryon vid önskad stadium med morfologiska kriterier 3.
    2. Tillåt flugor att lägga på agarplattor som ovan, men byta ut agarplatta med en ny en varje 1,5 timme vid 25 ° C. Inkubera varje platta under en definierad tidsperiod, tills embryon har nått utvecklingsstadiet krävs.
    1. Kemisk Dechorionation. Använd en metallspatel för att skrapa embryon från ägarn och överföra dem i ett glaskärl (t.ex. Petriskål eller hålighet blocket) innehållande ca 10 ml Ringer Drosophila eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt några droppar koncentrerad blekmedel och agitera för några minuter på enroterande plattform tills chorion stöts bort embryona. Tvätta embryon i flera byten av Ringer / PBS tills det inte finns någon lukt av kvarvarande blekmedel. Under dessa tvättar, se till att embryona inte kommer i kontakt med vätskeytan. Annars kommer de flyter och blir svåra att dränka för senare manipulering. Alternativt kan kemisk dechorionation utföras med användning korgen teknik som beskrivits av 4.
    2. Mekanisk dechorionation (se figur 2, steg 1-4). Överför embryon från agarplattan till ett objektglas täckt med dubbelhäftande tejp. Undvika att överföra agar med embryona, eftersom det kommer att störa deras adhesion till bandet. Låt embryon att torka under 5 till 10 min tills chorion blir något spröd. (Medan du väntar, belägga täckglas krävs för senare devitellinisation med lim - se 2.3b nedan). Tryck varje embryo försiktigt med en nål. Chorion kommer uppsprättad och embryot kommer att hålla fast neEdle. Överför embryon omedelbart till en agar blocket för att förhindra uttorkning och anpassa ungefär 10 av dem i rad, med sina ventrala sidor uppåt.

Devitellinisation och filetering sker manuellt med någon av de två metoder som beskrivs i 2.3a och 2.3b.

    1. Överför en enda dechorionated embryo lämplig utvecklingsstadium från skålen av Ringer-lösning till flera droppar av Ringer i en silikon dammen på en förpreparerad mikroskopobjektglas. (Gör en 3 cm kvadratisk dammen genom smeta ett tunt skikt av silikontätningsmedel på ett objektglas, och sedan lägga till en droppe av 0,01% poly-L-lysin-lösning till centrum av dammen. Låt silikonet härda under 24 timmar.) överföra embryot med en glas Pasteurpipett, säkerställer att embryot förblir under ytan av Ringer under överföringen.
      Spänna den bakre änden av embryot med ett par fin pincett, medan försiktigt Squeezning embryot med ett par fina iridektomi sax, ungefär en fjärdedel vägen tillbaka från sin främre ände. Klipp inte rakt igenom embryot. Målet är att bara knäcka öppna vitellinmembranet samtidigt som de orsakar minimal skada på embryot. Med tången fortfarande på plats, använd en volfram nål för att underlätta embryot från öppna membranet och placera den ventrala sidan nedåt på bilden. Embryot bör hålla sig till poly-lysin päls.
      Filé embryot med en vass volfram nål. Försiktigt perforera, sedan riva kroppen väggen längs ryggens mittlinje. Med hjälp av nålen, tryck ner på kroppen väggen så att den fastnar på bilden. För att förhindra skador på kroppens vägg, tryck kroppsväggen med tarmen införd mellan den och nålen. Använd sedan nålen att riva genom tarmen vid dess främre och bakre ändar och lyft bort det. Om så önskas kan ytterligare embryon överföras till samma bild, devitellinised och filéad, noga med att inte skada andra embryon redanbilden.
    2. Belägga en 24 x 60 mm täckglas med heptan lim (se tabell 1) genom att placera en liten droppe lim i mitten av bilden och sprida den med en 18 x 18 mm täckglas till en mycket tunn film. Placera täckglas på ett objektglas och göra en ram av ensidig tejp runt dess kanter. Klipp bort överflödigt agar från blocket håller raden av 10 embryon, försiktigt röra embryona med täckglas heptan lim täckglas. De bör nu följa täckglaset med sina ventrala sidor nedåt. Lägg till en generös mängd av PBS för att täcka embryona (se figur 2, steg 4-6).
      Penetrerar vitellinmembranet med ett glas eller volfram nål på den dorsala sidan av varje embryo nära dess bakre ände. Riv membranet längs den dorsala mittlinjen och dra embryot ur membranet. Orientera embryot ventrala nedåt någon annanstans på heptan lim substratet och filé den med samma metod som beskrivs i 2.3a) (seFigur 2, steg 7-8). Eftersom flera embryon kommer att filéad på samma bild, är det bra att antingen vara mycket noggrann med sin läggning eller göra en ritning av deras orientering på bilden.
  2. Efter filetering får embryon lätt fastställas för 10-15 min i 7,4% formaldehyd i PBS, följt av fyra tvättar i PBS. Extrem försiktighet måste iakttas för att inte bringa embryot i kontakt med ytan av lösningen under denna process, eftersom de ytspänningskrafter förstör embryot. Denna före fixering steg är inte absolut nödvändigt, men är användbar för att förhindra sammandragning av musklerna kroppen väggen i sen utvecklingsfas embryon och bidra till att stabilisera embryonala vävnader till unga stadier. Tänk på att fixering gör vävnader i embryot mer ogenomskinligt och så lite kompromisser bildkvalitet i DIC observation.

3. Fyllning av injektion Mikropipetter

Hälften fylla en 0,5 ml Eppendorf-mikrofugrör meden 0,1% lösning av carbocynanine färgämnet Dil (Molecular Probes, Eugene, OR) i 100% etanol (se till att använda "torr" absolut EtOH för att undvika Dil utfällning). Gör en smal hål i locket på röret och sätt den trubbiga änden av mikropipett genom hålet i locket. Låt Dil att stiga upp tråden i minst 5 minuter. (Alltid täcker hålet i locket när inte fylla en mikropipett för att undvika avdunstning av etanol).

Utrustning som behövs för neuron färg injektion (Figur 3).

Mikroskop. En fast fas mikroskop måste användas för neuron färg injektion för att undvika vertikal rörelse av embryot under fokusering. En sådan rörelse skulle förskjuta pipetten efter att den har kommit i kontakt med embryot. Vi har funnit både Zeiss Axioskop FS och Olympus AX50/BX50 fasta modeller skede att vara väl lämpade för detta ändamål. Mikroskopet bör utrustas med ljus DIC optik för visualisering av neurons före färgning. Mikroskopet bör också vara en upprätt snarare än en inverterad modell. Med en upprätt mikroskop, är spetsen på mikropipett på samma sida av embryot som visning målet, medan med ett inverterat mikroskop de två är på motsatta sidor av embryot. Det senare arrangemanget äventyrar kvaliteten på DIC optik. Mikroskopet bör inrättas för fluorescensmikroskopi med ett lämpligt filter set för Dil observation. Eftersom Dil har en förhållandevis brett spektrum med excitations-och emissionsmaxima vid 549 och 565 nm många filter uppsättningar i detta område kommer att fungera, t.ex. de för Alexa 568, Cy3, rodamin, Texas Red eller TRITC. Även om det är lämpligt att montera en elektroniskt styrd slutare i banan av fluorescens ljuskällan, för att möjliggöra manövreringen av slutaren utan handkontakt med mikroskopet, vi också effektivt märkt på en inställning som bara var utrustad med en manuell slutare. Slutligen, en hög förstoring, höga numerisk aperture vatten nedsänkning mål krävs för observation under injektion. Detta mål bör utformas för att användas utan täckglas. Vi har framgångsrikt använt Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W och Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 W mål.

En mikromanipulator krävs för att positionera och flytta mikropipett under neuron färg injektion. Vi har använt både Leica mikromanipulator och en scen monterat Narashige 3-axlig hydraulisk mikromanipulator.

En intracellulär DC-förstärkare, med anläggningen för ströminjektion, krävs för jontoforetisk injektion av Dil från mikropipetten.

4. Förfarande för Dye injektion

  1. Placera objektglaset med den monterade embryot (er) på scenen av injektionsanordningen mikroskop (figur 3). Använd en 10x mål att lokalisera ett embryo och föra det i mitten av synfältet.
  2. Swning av hög effekt målet till visning läget och föra embryot i fokus. Leta reda på cellen av intresse under DIC optik (eller använda fluorescens om målcellen uttrycker GFP) och föra den i mitten av synfältet. Säkerställ att fältbländaren av mikroskopet öppnas bara till kanten av synfältet, inte längre. En smal belysningsstrålen kommer att hjälpa positionering av mikropipett (se steg 4,4 nedan). Höj målet tills den är så hög som möjligt ovanför embryot medan det fortfarande är i kontakt med Ringer / PBS-lösning.
  3. Placera badet elektroden för DC-förstärkaren i PBS väl klart av embryot och sökvägen till mikropipett.
  4. Sätt injektionen mikropipett i hållaren, som har fyllts med en 0,1 M LiCl-lösning. Fäst mikropipett hållaren till mikromanipulator. Använda mikromanipulator grova kontroller föra mikropipett i utrymmet mellan spetsen av målet och embryot.Se till att det är väl ovanför embryot. På grund av den korta arbetsavstånd av den höga effekt mål kommer mikropipett måste hållas i en flack vinkel för att bringa den i fokus (se figur 3). Du måste fastställa lämplig vinkel genom trial and error i första hand. Om vinkeln är för brant, kommer du inte att kunna få mikropipetten spetsen i fokus. Om det är alltför grunt kommer mikropipett axeln fastna mot väggen av dammen håller badlösningen på plats.
  5. Centrera spetsen av mikropipetten i synfältet. För att uppnå detta, sätta ögonen till nivån av embryot och flytta mikropipett och tillbaka i Y-axeln för mikroskopbordet. När dess spets korsar ljusets väg, kommer du att se den ljusa reflektion av ljusstrålarna från den. Flytta spetsen av mikropipetten framåt i X-axeln så att den skjuter över ljusstrålen. Det blir lättare att lokalisera mikropipett i den lillasynfält på hög effekt målet om du letar efter sin axel snarare än dess spets. Titta nu genom mikroskopet okularen och gradvis sänka den höga effekt målet tills skaftet på mikropipett kommer i fokus. Flytta mikropipett och tillbaka i Y-axeln med mikromanipulator kontroller hjälper till att lokalisera det, eftersom det så småningom kommer i fokus. När axeln är i fokus, flyttar mikropipett i X-axeln tills dess spets ligger i centrum av synfältet. I detta skede mikropipetten spetsen bör vara väl ovanför embryot. Växla till fluorescens belysning och undersöka spetsen för att kontrollera läckage av Dil. Justera likströmmen för att förhindra Dil kristall bildas vid spetsen.
  6. Använda mikromanipulator kontroller sänka mikropipett i Z-axeln. Föra den tillbaka i fokus med mikroskopet fokusstyrning. Gradvis sänka mikropipetten nedåt mot embryot på detta sätt. Inledningsvis kan du göra detta med grovaZ-axelkontrollerna av mikromanipulator och mikroskop. Men eftersom embryot kommer i fokus bör du byta till de fina kontrollvred.
  7. När ytan av embryot kommer i fokus, flytta spetsen av mikropipetten mot kanten av synfältet, i riktning mikromanipulator. Fokus på cellen som skall injiceras och kontrollera att den ligger i centrum av synfältet. Inrikta på mikropipett spets och flyttar den i Y-axeln tills den ligger på samma nivå i Y-axeln som cellen. Flytta spetsen av mikropipetten mot cellen i X-axeln som du sänker den i Z-axeln. Om du använder en Leica mikromanipulator, kommer du förmodligen att mikroskopets kontroller ger dig bättre kontroll av rörelse i X-axeln än mikromanipulator kontrollerna, så växla till scenen kontroll som spetsen kommer nära cellen.
  8. Ta mikropipetten spets i kontakt med cellen och göra en fördjupning på dess yta. Passera flera nanoamps av depolarizing ström under några sekunder. Du ska se en liten kristall av Dil bildas på cellen. För att bekräfta att cellen har märkts, kort öppnar luckan för att belysa embryo med fluorescerande ljus och sedan växla tillbaka till DIC. Om kroppen hos cellen av intresse visar tecken på märkning, tillämpa gällande under flera sekunder. Stäng av strömmen och snabbt dra embryot från mikropipetten i X-axeln med hjälp av kontroll mikroskop scenen. Sedan återkalla mikropipett från lösningen. Om ingen Dil märkning är uppenbart, kan mikropipett blockeras och kommer att kräva ersättning med en ny mikropipett. Du kanske upptäcker att spetsen på mikropipett har fastnat andra vävnader väg till cellen av intresse och denna vävnad färgas i stället cellen. I det här fallet kan du prova att dra tillbaka mikropipett något och åter närma cellen. Det kan vara nödvändigt att ersätta mikropipett och försök igen.
  1. Om så önskas, kan flera celler vara individuelltalliera märkt samma embryo.
  2. Avlägsna det mesta av lösningen i insprutningskammaren, därefter fastställa de embryon genom tillsats 7,4% formaldehyd / PBS under 10 min följt av 4 tvättar med PBS. Embryot är därefter stå vid rumstemperatur under minst 4 timmar (eller över natten vid 4 ° C) i en mörk, fuktig kammare (för att undvika blekning eller torr falla) för att tillåta Dil att diffundera genom neuronala processer. Vid detta stadium kan Dil-märkta celler antingen photoconverted eller visas direkt i det konfokala mikroskopet.

5. Photoconversion för undersökning med DIC optik

Principen för photoconversion är (foto-) oxidation av DAB av det fluorescerande ljus som emitteras av den färgade cellen under belysning med den lämpliga våglängden. Detta innebär ljusa celler photoconverted på kortare tid jämfört med svagt färgade celler. Om flera celler märkta i en prov skiljer sig alltför mycket om deras ljusstyrka kan det leda till difficulties i photoconverting alla i samma kvalitet (se figur 4C): i detta fall kan man behöva besluta om en kompromiss mellan att försumma de svagare cellerna (med kort belysning) eller acceptera att de ljusare cellerna börjar svälla (med längre belysning) . Om alla celler har alltför svagt märkta (sålunda behöver mycket lång belysning), kan bakgrund som orsakas av endogena peroxidaser bli ett problem. Eftersom DAB är giftigt bör hanteras med försiktighet. Avfall kan "avaktiveras" med 7% klorblekning.

  1. Photoconversion måste utföras för varje embryo individuellt. I de fall där endast ett embryo injiceras per bild är PBS-lösning som täcker embryot ersättas med en DAB-lösning (3 mg DAB / ml Tris-buffert), bilden placeras på ett fluorescensmikroskop och den fyllda cellen visas med en 100x mål. (Med en upprätt mikroskop de objektiva doppar i DAB-lösning och bör rengöras flera gånger med vatten efter photoconversion pÖRFARANDE är klar, vilket kan undvikas om ett inverterat mikroskop används). En Cy3 filteruppsättning och en 100W Hg-lampa används och cellen exponeras för de röda excitationsvåglängder tills en brun DAB reaktionsprodukt blir uppenbar i det märkta neuronen (kontrollera regelbundet genom att byta till ljusfält belysning). Den tid det tar för optimal DAB färgning varierar, men kräver exponering för exciteringsljuset bortom det stadium där fluorescensen har helt bleknat. Efter photoconversion är klar, tvätta preparatet flera gånger med PBS. Byt ut PBS med en droppe 70% glycerol, skrapa bort silikonet med en skalpell blad, ersätta med en ring av vaselin och lägga ett täckglas.
  2. När flera embryon har fyllts på en bild, överför varje embryo till en liten droppe PBS på en separat 24 x 60 mm täckglas med den ventrala sidan av embryot mot glaset. Placera en ram av tejp runt varje embryo för att skapa en bra och omfatta förberedelse med PBS. Förvara glasen i en fuktig kammare innan photoconversion att hindra dem från uttorkning. Utbyte PBS täcker embryot med DAB-lösning. Placera omedelbart objektglaset på ett inverterat mikroskop utrustat med en 100W Hg-lampa och använda en Cy3-filter satt att excitera Dil, med yxa 50 mål. Efter photoconversion, överföra embryot till en ny bild i en droppe 70% glycerol, lägga ett täckglas och tätning med nagellack.

6. Undersökning av konfokalmikroskopi

  1. Efter steg 4,10, överföra embryon till en liten droppe PBS på en ny 24 x 60 mm täckglas. Vi uppnå optimala optik genom att montera de tillplattade embryon med den dorsala sidan mot täckglaset (vilket endast en liten mängd PBS mellan täckglaset och embryo).
  2. Placera en ram av tejp runt embryot och förstora PBS droppen fylla ramen när täckt med en bild. Placera en bild på det noga och fäst den med nagellack. Fyllda neuroner bör examenINED på en konfokal (eller fluorescens) mikroskop så snart som möjligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 illustrerar typiska resultat av tekniken, beskriver vi här. Figur 4A visar ett exempel på en fylld Dil enda interneuron som rent var photoconverted. Det visar fint hur mycket detaljer dessa preparat erbjuder. När den betraktas under DIC optik den rumsliga ramen för den märkta cellen inuti den icke-märkta omgivande vävnad blir synlig, t.ex. positionen av cellkroppen i cortex och av fibern utskjutande inuti neuropile.

Figur 4B är ett fall där färgen släpp var lite för stor vilket resulterar i flera angränsande celler blir märkta samtidigt. Detta gör det ofta svårt att relatera enskilda prognoser för olika cellkroppar. Det visar också att när direkt ses under fluorescensmikroskop (ingen photoconversion) bakgrund upplösning är mycket lägre.

Provet i figur 4C

Figur 4D visar att observation av konfokal mikroskopi avslöjar morfologin av märkta celler i detalj. Dil märkning utfördes i en stam som bar en konstruktion GFP reporter. Detta kan ge viktig information om den rumsliga sammanhang (och identitet) av den fyllda färgämnescellen inom specifika populationer av neuronala eller GLIAL celltyper (såsom definieras genom genuttryck).

Som ett paradigm för att utvärdera morfologiska variationer av en identifierad neuron har vi valt en av de Apterous positiva neuroner 14. Denna neuron ligger i en rygg och medial läge nära neuropile (DAP, figur 5A, Lundgren et al., 1995) separat från de andra Apterous positiva neuroner och är därför lätta att identifiera apGal4-UASGFP djur. Figur 5B visar en DAP-cell som var fylld med Dil och photoconverted. Cellkroppen ligger i nivå med den främre kommissuren och visar ett axon som först växer mot mittlinjen och vänder därefter främre i en medial sammanbindande område. Det har tillväxten konen som svullnader vid spetsen och vändpunkten. 19 etiketter av denna cell dragen som högsta prognoser från bildstaplar, sammanfattas i figur 5C. Cellmorfologi blir synlig för stor detalj. Endast ett fåtal celler visar tillväxt konen som strukturer, sex av de 19 cellerna också skicka en gren bakre som alltid kortare än den främre grenen och kan mycket väl vara en övergående funktion. I figur 5D alla 19 Dap märkta celler är staplade med varje cell har endast en opacitet av 12%. Detta resulterar i områden är mörkare ju fler celler delar dem. Medan cellkroppen varierar mer än ett celldiameter runt mittläget varierar mediolateral position axonet i neuropile mycket mindre - när neuropile bredden är uppdelad i nio delar den finns alltid i en av de mediala två lägen.

Figur 1
Figur 1. Schematisk översikt av stegen neuron märkningsmetod och dess två varianter.

"FO: content-width =" 4I "FO: src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50150/50150fig2.jpg "/>
Figur 2. Diagram som visar de olika stegen i förberedelserna Drosophila embryon för neuron färg injektion enligt variant B. Klicka här för att se större bild .

Figur 3
Figur 3. . Schematisk representation av inställningarna för färg injektion Den övre högra insatsen är en förstorad vy av arrangemanget av provet, injektion mikropipett och bad elektroden A:. Mikromanipulator, B: Fast fas mikroskop. Den mikromanipulator är inställd på en flack vinkel - cirka 10 & de. g, C: Mikropipett hållare med mikropipett, D: Specimen på bild, E: Bath elektrod fast med modellera, F: Anslutning till DC-förstärkare.

Figur 4
Figur 4. Exempel på Dil-märkta interneuronen i den ventrala nerv ur fas 17 embryon. Dorsal vyer är främre till vänster. Mittlinjen: prickade linjer.

  1. Ett exempel på en perfekt photoconverted enda cell, som visar en framstående kontralateral axonal projektion och ipsilaterala fibrer dendritiska (pilspets). DIC optik.
  2. visar ett preparat där mer än en cell märkt - detta kan skymma en tydlig tilldelning av en enda cell kropp till dess projektion.
  3. 8-celler har märkts i 3 på varandra följande segment. Dessutom, i denna beredning av photoconversion följdes av ett standardprotokoll antikroppsfärgning mot Fas2 som ett landmärke.
  4. visar en Dil-fyllda neuron dokumenteras med konfokalmikroskopi i en fluga stam som bär en GFP reporter konstruktion.

Figur 5
Figur 5. Riktad Dil märkning (markerad med GFP uttryck) visar olika morfologiska variationer en identifierad neuron 14. Klicka här för att se större bild .

  1. DAP-cell (artificiellt färgad blå) kan entydigt erkänd inom den apterous Gal4-UASGFP mönster i buken (DAP, figur 5A, Lundgren et all.. 1995). GFP-uttryckande celler har färgats med en anti-GFP-antikropp. Mittlinjen markeras med streckade linjer. AC = främre kommissur, PC = bakre kommissuren.
  2. visar ett exempel på en photoconverted Dil-fyllda dAP cellen. Cellen identifierades före färga fylla i en apterous Gal4-UASGFP embryo genom dess uttryck av GFP.
  3. Ett galleri av 19 fyller i denna cell, dras som högsta prognoser från bildstaplar. Rygg vyer. Anterior är uppe. Det neuropile är ljusgrå, är cortex området mörkare grått.
  4. De 19 Dap cellerna staplas med varje cell har en opacitet på 12%. Området som upptas av de flesta av cellerna har den mörkaste gråtonen. Den neuropile alla prover (blå) skalades till en liknande bredd och de främre kommissurerna bredvid cell linje så att de överlappar varandra. Medan cellkroppen varierar mer än en celldiameter runt den centrala positionen, visar mediolateral position axonet i neuropilemindre variation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En stor fördel med Drosophila som ett modell-system är att det tillåter analys av utveckling och funktion på nivån av enskilda celler. Detta är särskilt användbart när det gäller nervsystemet, där mångfalden av celltyper är exceptionellt hög och funktion och morfologi av angränsande celler kan vara helt annorlunda.

Den metod som vi presenterar här tillåter märkning av enskilda neuroner med ett färgämne som antingen kan omvandlas till en permanent fläck eller undersökas direkt genom fluorescensmikroskopi. Det visar morfologi av neurala processer i detalj (Figur 4). En av de stora fördelarna med metoden är att den möjliggör morfologi nästan alla typer av neuron i CNS som skall undersökas (för den embryonala ventrala nerv sladd, se Rickert m.fl., 2011,. På embryonala hjärnan, se Kunz et al., 2012). Dessutom behöver den inte komplicerade kombinationer avgenetiska element att vara närvarande i embryot, eftersom flera av de genetiska märkningstekniker gör. Dye injektioner kan utföras i celler av djur som bär reporterkonstruktioner, varigenom individuell cell morfologier för att visualiseras i samband med särskilda genexpressionsmönster (figurerna 4D och 5) i antingen vildtyp eller mutanta bakgrunder. Vi har också använt tekniken för att övervaka dynamiken i axonet utväxt i levande embryo nervceller 11, 12.

Metoden kan lätt anpassas för att märka enskilda nervceller i embryon från andra organismer, under förutsättning embryot är transparent nog att prövas enligt DIC belysning. Vi har använt det att visualisera neurala morfologi i ett brett utbud av artropoda embryon, inklusive gräshoppor 18, tusenfotingar 17, kräftdjur 19 och Silverfisken 16.

Den största nackdelen med den tekniskaque ligger i dess tekniska svårigheter. Vi litar på att nuvarande detaljerad redogörelse av metoden kommer att hjälpa intresserade forskare att bemästra den.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från DFG till GMT

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DAB Sigma-Aldrich D-5905 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI Invitrogen/Molecular Probes D-282 1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde Merck Millipore 7,4 % in PBS
Glycerol Roth 3783 70% in PBS
Heptane Glue Beiersdorf AG Cello 31-39-30 * dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS 1x
TRIS Roth 4855
Vectashield Vector Laboratories H1000
EQUIPMENT
Confocal Microscope Leica TCS SP2 to view and document labelings in fluorescence
DC - amplifier Dragan Corporation Cornerstone ION-100 to perform the labelings
Coverslips Menzel BB018018A1 18 x 18 mm
Coverslips Menzel BB024060A1 24 x 60 mm
Dissecting Microscope Leica MZ8 to prepare and disect embryos
Flat Capillaries Hilgenberg outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries Science Products GB 100 TF 8P
Micromanipulator R Leica to perform the labelings
Model P-97 Sutter Instruments to pull capillaries
Object Slides Marienfeld Superior 1000000
Scientific Microscope Zeiss Axioskop 2 mot to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope Olympus BX50 to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera Sony/AVT Horn Sony MC3255 to record labelings after photoconversion

Table 1.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
  3. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
  4. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
  5. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
  6. Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
  7. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  8. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  9. Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
  10. Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
  11. Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
  12. Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
  13. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  14. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
  15. Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
  16. Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
  17. Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
  18. Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).
  19. Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
  20. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Tags

Utvecklingsbiologi neurovetenskap Neurobiologi genetik Cellulär biologi molekylärbiologi anatomi Drosophila bananflugan neurovetenskap neuroanatomi Biovetenskap embryonal nervsystemet centrala nervsystemet neuronal morfologi enda cell märkning embryo mikroskopi djurmodell
Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K.… More

Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (73), e50150, doi:10.3791/50150 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter