Summary
ここでは、アポトーシス細胞のクリアランスのダイナミクスを研究するための効果的な方法を説明
Abstract
アポトーシスとその後の食作用を通じて不要なまたは異常な細胞の適切な除去（アポトーシス細胞のクリアランス）は、すべての後生生物の正常な発達のために重要です。アポトーシス細胞のクリアランスは密接に細胞死に関連付けられている非常にダイナミックなプロセスである; unengulfedアポトーシス細胞はほとんど通常の条件下では、生体内で見られる。アポトーシス細胞のクリアランスの異なるステップを理解し、 'プロ'食と比較するためには-にマクロファージや樹状細胞を'非専門家' -組織常駐隣接セルは、プロセスのin vivoライブイメージングでは、非常に貴重なものです。ここでは、ライブショウジョウバエ胚におけるアポトーシス細胞のクリアランスを研究するためのプロトコルを記述します。貪食に異なるステップのダイナミクスに追従するために、我々はアポトーシス細胞と食細胞に対して特異的なマーカーを使用しています。また、並行して2食のシステムを監視することができます： 'プロ'マクロファージおよび 'セミプロフェッショナルエディション現像中枢神経系におけるssional 'グリア（CNS）。ここで説明する方法は、アポトーシス細胞クリアランスのリアルタイムの研究のための優れたモデルとしてショウジョウバエ胚を用いる。
Introduction
アポトーシスとその後の食作用を通じて不要なまたは異常な細胞の適切な除去は、胚発生のためだけでなく、成人で組織の恒常性のために重要です。アポトーシス細胞やアポトーシス細胞の貪食クリアランスは4段階で進行する非常にダイナミックなプロセスである：アポトーシス細胞の貪食細胞の（1） 募集 （ '見つける-私'）、食作用の標的として細胞の（2） 認識 （ ' -私を食べて'）、（3）の貪食 、アポトーシス粒子1-5の（4） ファゴソーム成熟と劣化が続く。 'プロ'マクロファージや未熟樹状細胞、および'非専門家'組織常駐隣接セル、後生動物の開発6,7時のアポトーシス細胞のクリアランスのために重要である：食細胞の2つのタイプがあります。
ショウジョウバエの開発では、アポトーシスを通して余分細胞の除去は、3メートルで発生後期胚の半ばで初めて、その後中旬蛹で、再び初期の成人におけるAINフェーズ、。胚発生の間にアポトーシス粒子は'プロ'食細胞、マクロファージ、および'非専門家'外胚葉およびグリア8,9によって除去される。
我々の以前の研究では、胚発生の間に食細胞にのみ発現している、（シミュレーション）六ミクロンアンダー、貪食受容体を同定した。 シミュレーションのプロモーターを用いて、我々は、ライブ胚8で同時に外胚葉およびグリア、マクロファージを監視することを可能に貪食細胞集団（ シミュレーションcytGFP）に特異的マーカーを生成しました。さらに、アポトーシスの異なる段階においてアポトーシス細胞に特異的なマーカーを用いて、我々は、 生体内のアポトーシス細胞クリアランスのダイナミクスに従うことができる。
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Protocol
食細胞とアポトーシス細胞：細胞の2つの集団が標識されている必要があり、生体内でアポトーシス細胞クリアランスの力学に従ってください。
マクロファージ、グリア及び外胚葉8：貪食細胞集団をマークするために我々は胚で排他的に食細胞を標識シミュレーションcytGFPマーカーを含むショウジョウバエラインを使用。一つは、血球固有Gal4のドライバ（CRQ-Gal4の ）含む行またはグリア固有Gal4のドライバ（ レポGal4の ）とUAS制御（UAS-GFP）の下で遺伝的に符号化された蛍光レポーターを含む食細胞に対して異なるマーカーを使用することができます。
アポトーシス細胞のクリアランスの間にアポトーシス細胞を監視するために我々は異なったアポトーシス/貪食マーカーを使用。アネキシンV（Molecular Probes社）は10アポトーシス細胞の早期マーカーとして機能します。Phiphilux（OncoImmunin）は後でapoptoとして使用されている蛍光カスパーゼ-3基板であるSISマーカー、及びLysoTracker（Molecular Probes社）はファゴソームマーカーとして機能します。我々はマイクロインジェクションシステムPicoPump PV 820を使用して、これらの試薬を注入する。
1。準備中
- ヘプタンのり：
両面テープをアンロールし、シンチレーションバイアル中で、24時間のためにパラフィルムでバイアル、およびロックを封印、ヘプタンで埋めることができる限り置く。接着剤は厚すぎるヘプタン追加。 - 我々は2時間ペースト+酵母ハエは予め温めグレープジュース寒天プレート上に置くことができ、その後°C 10-12時（所望の段階に依存します）のための事前のマイクロインジェクションと時間経過の録音を25にプレートを転送注入された胚の。そこで我々は、ステージ15や開発の16から胚を提供し、25℃に維持寒天プレートから胚を集める。
- 針の調製：
注射用の針を準備するには、我々は 'サター楽器'ニードルプラーと薄肉ガラスフィラメント（FHCキャピラリーチューブ）を使用します。プールされたキャピラリーの先端を破っている0.5ミクロンの直径からn。 - 接着剤でカバースリップ：
ピペットチップを使用すると、カバースリップの途中で一行でヘプタン接着剤のドロップを分散。数秒のためにそれが乾燥してみましょう。これらのカバースリップのいくつかを準備します。
2。胚の準備
- 寒天プレートから胚を集め、きれいなペイントブラシと流水を使ってセルストレーナー（SPLライフサイエンス）に転送します。ストレーナーは、廃水を収集するようにビーカーの上に保持されている。
- すべての酵母ペーストが除去されるまで水を使用してセルストレーナーで胚を洗浄します。
- キムワイプを用いたストレーナの外側を拭いて余分な水分を乾かします。
- きれいなペトリ皿内のセルストレーナーを置き、セルストレーナーで胚をカバーするのに十分な50％の漂白剤を追加します。時折2分（2-3回）、それらを攪拌するための胚をDechorionate。
- 胚漂白剤の臭い緩いまで広範囲に水で洗い流してください。
- きれいにセルストレーナーを置きペトリ皿に、最大乾燥を防ぐために水で胚をカバーしています。
- 胚の設定を開始する前に、2本の針（時々針が目詰まりすることができます）に必要な試薬1μlのをロードします。これは、針の先端に到達するための液体のため、約5分かかります。
- グレープジュース寒天の長方形の部分を切り取り、顕微鏡スライド上に置きます。ペトリ皿からきれいなペイントブラシを使って寒天ピースにdechorionated胚を転送します。
- 蛍光解剖顕微鏡下で適切に選択し、ウェットペイントブラシを使用したGFPマーカーを発現胚を上演し、近くに別の（ 図1A）の後行1で寒天片の端に各胚を配置。胚は、中枢神経系（CNS）におけるグリアによるイメージング食作用のための彼らの腹側にまで配置する必要があります。
- 1行目には約10胚を設定します。
- ヘプタン接着剤のストリップ（ 図1B、Cで途中で被覆されたカバースリップに胚を取り付け
- 約5分（これは部屋の湿度と注入される量に依存します）のために脱水チャンバー内にカバースリップを置きます。
- さらに脱水症状を避けるためにハロカーボン油700（Sigma）で胚をカバーするまで乾燥した後。
- 上向きに胚と顕微鏡スライド上にカバースリップを置きます。あなたは、カバースリップの移動を防止するために、スライド上に水滴を置いてもよい。胚は今注射のための準備が整いました。噴射位置は、胚の途中で側方に典型的である。
3。胚インジェクション
- マイクロマニピュレータに針を取り付けます。
- 針先を破るためには視野内にカバースリップの端を入れて、同じ焦点面に針を調整します。それは針の先端に当たって、それを壊すまで、非常に慎重にカバースリップを移動します。
- 胚に着目し、油に針を配置し、針から液滴を得ることを確認してください。これは、針の先端がされていることを意味しよく壊れた。
- ニードルホルダーに触れることなく針に胚を移動し、胚にドロップを注入。離れて胚を移動し、すべての胚が注入されるまで、次のいずれかに進みます。
4。イメージング
40Xまたは100Xを目的とした倒立共焦点顕微鏡で我々は画像胚を。我々は強力なGFPの発現と注射後アポトーシス細胞の良いラベルを示し途中でCNSとうまく配置胚、探します。
ライブ胚の時間経過の録音のために我々は通常、5〜6共焦点スライス（厚さ2μmのそれぞれ）を選択します。その後、我々は全体の細胞を観察するために3スライス（6ミクロン厚）の投影を行う。
我々は安定しており、簡単に漂白しないアポトーシス細胞のマーカーを使用しています。我々は60秒の間隔で録音を行う漂白GFPを避けるために。
場合によっては、胚は圧延開始することができる録画の時間の間。したがって、我々は、停止し、必要に応じて、最初からやり直すために、記録でたまに見てみましょう。
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Representative Results
アポトーシス細胞は、アネキシンVで標識されており、グリア、外胚葉およびマクロファージをシミュレーションcytGFPで標識された映画からの代表フレームが図2に示されている。各フレームは3スライス2μmとそれぞれの投影である。
ステージ15の胚を適切によくラベルグリア（g）のと途中で胚性CNSを示す配置されている。 CNS外にほとんどであるマクロファージ（m）は、強力な細胞質GFPの発現を示す。外胚葉細胞はまた、細胞質GFP（電子）で標識される。多くのアネキシンV陽性細胞は、CNSの内側と外側に見られている。貪食イベントをフォローするには容易ではありません。私たちは、グリア細胞がアポトーシス粒子を巻き込むている白い長方形で一つのイベントを強調した。グリア細胞のプロービング動作に注意してください：それを巻き込むことなく、数回アポトーシス粒子に触れた後、アネキシンV標識したアポトーシス細胞（ 図2の貪食で終わる
別のアポトーシスステージ用の追加のマーカーは、同様の手順で使用することができる。
図1。マイクロインジェクションのための胚の準備の概略図。 A.胚dechorionation後に転写された寒天の一部を含む顕微鏡スライド。約20胚はイメージングCNSのために、アップする彼らの腹側で、近くに寒天片のエッジに、ラインに配置されます。B.は、途中でヘプタン接着剤のストリップを含むカバースリップ。C.は、胚とBからカバースリップヘプタン接着剤ストリップに接続されている。
図2。アポトーシス細胞のクリアランスの動的解析。タイムラプス記録ステージ15胚におけるアポトーシス細胞のクリアランスS。グリア（g）を、マクロファージ（m）および外胚葉は（e）のシミュレーションcytGFP（緑色）で標識される。アポトーシス細胞を蛍光アネキシンV（赤）が付いています代表的な映画のA.選択したフレームが表示されます。アポトーシス細胞を巻き込むグリア細胞は長方形で描かれている。B.は著しい長方形の景色をクローズアップ。
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Discussion
アポトーシス細胞のクリアランスは非常に動的であるアポトーシスの重要な最後の段階である。したがって、プロセスの実時間研究は極めて重要である。ここでは、開発してショウジョウバエの胚を生体内アポトーシス細胞のクリアランスの監視を可能にするプロトコルを記述します。アポトーシス細胞と食細胞：この手順では、細胞の2つの集団は、特異的なマーカーを使用してマークする必要があります。 シミュレーションcytGFPレポーターが同じ胚で同時に貪食マクロファージ、グリア及び外胚葉を監視するのに適している、wを HICHにより、同時に異なる食細胞集団をたどることができる。これは、速度、特異性および分解能力などのプロセスの特定の側面を比較し、同時に 'プロ'と '非専門'クリアランスを研究するための大きな利点です。この方法の欠点は、 シミュレーションcytGFPマーカーがマクロファージに非常に強く発現し、はるかに弱いされることである同じ映画の中で調整するのが難しいかもしれませんグリア、。しかし、一つは、特定のGal4s（マクロファージおよびグリアのためレポGal4のためのCRQ-Gal4の ）でGFPの発現を駆動することにより、中枢神経系では、このプロセスとは別にマクロファージによる画像アポトーシス細胞のクリアランスは、することができます。
特定の分子と形態学的変化を反映したアポトーシス細胞ごとに異なるマーカーはアポトーシスと細胞の隙間のダイナミクスと可逆性を理解するための大きな価値である。また、これらのマーカーを使用して、アポトーシス細胞クリアランスのリアルタイムレコーディングは、固定胚従来の免疫組織化学法を使用することによって達成することができなかった変異体の表現型に関する追加情報を追加する。
記述されたプロトコルの中で最も困難なステップ、イメージング開発CNSは、注入前の胚の極めて正確な位置決めです。準備の取り付け中にカバースリップのわずかな動き接着剤に胚はイメージングCNSには適切でないであろうそれらの位置を変更することができます。ステップを取り付ける胚は、最大の注意を払って行う必要があります。
アポトーシスと貪食における特定の段階のための追加マーカーの開発が細かい解剖とアポトーシス細胞のクリアランスの可能な操作のために非常に望ましいであろう。ここで紹介するプロトコルは、将来の発展のために良好な基礎となる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、マリーキュリー社会復帰グラント（IRG249084）によってサポートされていました。私たちは、Kurant研究所のすべてのメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush | |||
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
