Summary
原代小鼠心肌细胞培养物的肌原纤维组织和功能的研究的关键工具之一。以下协议描述了从新生小鼠心脏原发性心肌细胞的分离和培养。所得到的心肌细胞培养物随后可用于各种生物力学，生物化学和细胞生物学测定。
Abstract
培养的乳鼠心肌细胞长期被用来研究肌丝和肌原纤维的功能。培养的心肌细胞可以很容易调查的生化途径和操作，以及它们对自发跳动的心肌细胞的生物力学特性的影响。
下面2日协议描述的新生小鼠心肌细胞的分离和培养。我们将展示如何轻松地从新生儿心脏解剖，游离心脏组织，并从心脏细胞群丰富的心肌细胞。我们讨论了不同酶混合的用法细胞解离，及其对细胞活力的影响。分离的心肌细胞随后可以用于各种形态，电生理，生化，细胞生物或生物力学分析。我们优化了协议鲁棒性和再现性，通过仅使用市售溶液和酶混合了的shOW小批与批之间变化。我们还应对与心肌细胞的分离和培养相关的常见问题，并提供了多种用于分离和培养条件的优化选项。
Introduction
对啮齿动物的心脏细胞的成功分离并培养了最早报道可以追溯到1960年的1,2。即使这样，Harary和法利注意到，培养的心肌细胞“可提供的周期性收缩的要求，研究一个独特的系统[，并可能]提供确定的[跳动]过程中的各种代谢途径的贡献的一种手段”。虽然Harary和法利从幼鼠，和原来的协议分离培养的心肌细胞已被改编，被许多科学家修改多年来，一般隔离和培养过程并没有很大的变化。然而，更好的酶3，标准化解决方案4,5和加法可逆信道和肌球蛋白ATP酶抑制剂BDM分离过程6-9期间保护细胞的有显著改善细胞产量和活力。
成人与新生大鼠心肌核细胞
心肌细胞的分离，培养新生小鼠或大鼠有超过成人的心肌细胞培养几个优点。最重要的，在分离过程中对新生小鼠或大鼠心脏更容易且成本更低，相对于从成年小鼠或大鼠心肌细胞10的隔离。新生心肌远远不敏感，再引入含钙介质离解后，极大地提高细胞产量。另一大优势是，新生小鼠心肌细胞进行更快速的分化 - 再分化周期，通常会产生电镀后自发跳动的细胞20小时，而成人的心肌细胞通常需要起搏诱导收缩。乳鼠心肌细胞也更容易转染的脂质体转染方法，而成人的心肌细胞需要病毒载体成功传递转基因DNA的。相反，新生心肌细胞秒，成年啮齿动物心肌11-13文化允许的肌原纤维的降解和收缩设备的最终重建的调查。在成人的心肌细胞，这些特征的形态学变化发生在1-2周时间。去分化-再分化周期是伴随胎儿基因程序的再表达，从而模拟在人心肌病14观察到的病理变化。成年大鼠心肌细胞在新生大鼠心肌文化的另一个优点是能够培养这些细胞很长一段时间。
大鼠与小鼠的心肌细胞
新生大鼠心肌细胞的分离和培养有一定的好处超过了小鼠乳鼠心肌细胞，包括活细胞的产量更高，增加了转染率。然而，转基因小鼠模型心脏疾病的广泛使用（ 如</ em>的肌肉LIM蛋白基因敲除小鼠为模型，扩张型心肌病15），导致了分离过程的适应从新生小鼠的心肌。虽然用于分离新生大鼠和小鼠心肌的协议几乎是相同的，更大的关怀必须采取适当的酶混合物，后者的选择。事实上，新生小鼠心肌细胞一般都比较容易过量，造成降低的细胞产量和活力。此外，铺板密度应调整，因为相比于从新生大鼠心脏的细胞从新生小鼠衍生的心肌细胞是要小一些。
与许多用途的形态，电生理，生物化学，细胞生物学和生物力学参数以及为肌丝的过程进行调查，培养的乳鼠心肌细胞已成为最通用的系统的研究之一心肌细胞功能的体外 。第一步，一个成功的实验然而，依赖于一个简单而可靠的方法来隔离乳鼠心肌细胞。我们的协议借鉴其方法有很多，是为再现性和鲁棒性优化。我们讨论了影响心肌的产量和活力的因素，以及对分离和培养条件的优化提供了多种选择。
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Protocol
下面的过程描述了为期两天的协议16,17对新生小鼠心肌细胞的分离和培养。所有溶液是无菌的或无菌过滤。所有的工具都通过表面杀菌消毒用75％的乙醇。除了最初的组织提取，所有步骤都在无菌层流细胞培养罩进行。此协议的目的是为新生小鼠心脏从一个个垃圾（次）的隔离 - 约5-14幼崽，但可以适用于较大的窝产仔数和新生大鼠心肌细胞。规模媒体/酶用量（如适用）。
对于新生儿啮齿动物的工作，是指规定由立法机关和/或动物护理方案您当地的大学指引和规则，并坚持你的制度上批准的动物协议。在本协议中所述的所有方法已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（IACUC），并坚持FEDE拉尔和国家有关规定。
每日1次。
1。从新生小鼠心肌组织中分离
- 制备50毫升的1X PBS（无Ca 2 +的，Mg 2 +的），补充有20mM BDM 6-8，并分散到置于冰上2无菌细菌菜肴。
- 准备10毫升分离培养基的50ml的无菌锥形Falcon管中。置于冰上的所有解决方案。消毒剪刀（一个弯，一条直线），和钳（弯，杜蒙第7号）。
- 1-3日龄新生小鼠在表面杀菌75％的乙醇溶液快速冲洗。幼仔用无菌剪刀（直）断头，胸部沿着胸骨打开，以允许访问胸腔和心脏（ 图1A中 ， 追加电影S1）。
技术评论：年长超过3天新生小鼠可以使用，但导致更少的活细胞2。 - 心是摘录自主体具有弯曲剪刀和用20mM BDM立即转移到细菌培养皿含有1x PBS（不含Ca 2 +，Mg 2 +的），在冰上。所有以下步骤在无菌的细胞培养罩进行。
- 去除肺组织，较大的血管（和心房，如果需要的话）。洗心在1X PBS液（不含Ca 2 +，Mg 2 +的）与20毫米BDM（冰），以清除血液。转让洗涤从第一盘心进入第二细菌培养皿含有1x PBS（不含Ca 2 +，Mg 2 +的）与使用镊子的20mM BDM（在冰上）或穿孔的勺子（ 图1B）。
- 转让清洗/清洗的心，一滴分离培养基（约250微升; 图1C）在第三细菌培养皿（冰），并使用剪刀弯剁碎的心切成小块（约0.5-1毫米3，或更小; 图1D，1E）。
- 转心剁碎成圆锥形含有10毫升分离培养基（在冰上）的管中，并轻轻摇动孵育在4℃下过夜。
第2天。
2。酶消化组织细胞及电镀
- 称重在15毫克胶原酶/分散酶混合物（罗氏公司），并溶解酶混合物在10ml L15-5介质补充有20mM的BDM（消化培养基）。无菌过滤的消化培养基在细胞培养罩到一个新的无菌50毫升Falcon管中。
- 准备30毫升的L-15培养基中添加20mM的BDM和镀敷介质。
- 外套细胞培养板的胶原蛋白溶液（Sigma C-8919）最少1小时的。除去胶原溶液（可重复使用）和干胶原包被细胞培养皿中无菌层流细胞培养罩。
- 取出锥形管含有从4℃的简化的心组织碎片应合并计算（ 图1G）。让组织碎片沉入在管的底部，去除上清（确保不丢失任何组织片段;通常，约1ml所隔离介质的可保留在管）。加入5 ml消化介质和5毫升的L-15的补充有20mM的BDM到组织片段，并使用氧气或空气为1分钟含氧化合物的悬浮液。
- 密封锥形管中含有消化培养基的心脏组织片段转移到37℃水浴中约2分钟，以调节消化溶液的温度。
- 孵育心肌组织片段在37℃下缓慢搅拌20-30分钟（ 例如摇动器在37℃下，设定为不超过60转以上）。消化时间可能大大依赖于酶的混合物，并批号注意：较长的潜伏期或更高的酶浓度可能会降低细胞活力。
技术注释：我们建议胶原酶/分散酶混合物的使用量从罗氏（编号：10269638001），有非常少很多到很多变化。经典的酶的小鼠心肌细胞的分离的胰蛋白酶和/或胶原酶II型3,16-20可从Worthington（目录号CLS-2）。然而，胶原酶Ⅱ的性能可能从很多到很多差别很大。沃辛顿通常允许几个胶原酶大量的测试，优化消化时间和酶用量。另外，沃辛顿生产销售心肌细胞分离试剂盒与预测试的酶混合物，包括可适应对小鼠心肌细胞17（目录号：NCIS）的隔离。
- 将无菌细胞过滤器（40-100微米尼龙网）的新鲜无菌的50ml锥形猎鹰管。预湿的细胞过滤，用5ml的L-15补充有20mM的BDM。使用预润湿10毫升细胞培养移液器约10-20倍轻轻磨碎的组织碎片。组织碎片应该在这个步骤大多分散，释放出细胞进入悬索桥N（ 图1H）。
- 让更大的组织碎片沉淀和含悬浮细胞到新鲜的锥形管通过细胞过滤器（ 图1I）转移上清。
- 重悬未消化的组织碎片在5ml消化培养基孵育额外的5-10分钟，在37℃下缓慢搅拌。
- 其余的组织碎片继续消化后，轻轻磨碎组织的10-20倍，并加入到锥形管含有细胞从第一通过消化细胞过滤。漂洗细胞器 - 网式过滤，用5ml的L-15添加20mM BDM允许所有消化细胞的通道。
- 离心锥形管含有悬浮的心肌细胞在300转5分钟（约50-100 XG）。除去上清液（主要含有成纤维细胞和内皮细胞）和在10ml平板培养基重悬细胞沉淀。
- 板细胞进入10厘米细胞培养皿（ 图2A）并孵育1-3小时在细胞培养孵化器。此预镀步骤除去成纤维细胞和内皮细胞（ 图2B），这将附着在未涂覆的细胞培养皿中（ 图2C）。
- 温育后，（通过反复吹打在盘镀介质重新悬浮细胞）洗涤非贴壁心肌将从10cm培养皿中，并传输重悬细胞于无菌锥形猎鹰离心管（15毫升或50毫升）中。
可选：重复镀前一步，从细胞悬液中删除额外的成纤维细胞。如果需要的话，粘合成纤维细胞和内皮细胞可进一步培养。 - 细胞计数（ 如使用的Neubauer血细胞计数，台盼蓝拒染21）。
- 板的细胞在胶原包被细胞培养皿以每厘米2（ 图2D约1.5×10 5个细胞的密度，也可参见评论于表1上镀和涂层）。
将餐具放入细胞培养孵化器，离开静置12-18小时，以便坚持和心肌细胞的扩散。
第3天 - 乳鼠心肌细胞的培养
- 准备维修中，prewarm在37℃水浴。参照表1的除了增殖抑制剂或变时性剂，或程序的新生小鼠的心肌细胞的脂质体转染。
- 有一天电镀后，心肌细胞应该坚持的细胞培养皿，最佳开始自发地收缩（ 图2E，2F，补充电影S2，参考表2为隔离/养殖过程中常见的问题）。更换电镀液与维持液和培养更多的1-5天。改变介质是必要的。
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Representative Results
使用此协议，我们分离的心从8一日龄新生小鼠（ 图1A，1B，追加电影S1）。洗涤和切碎的心，用剪刀（ 图1C-1F）后，组织碎片在预消化分离培养基过夜，4℃，轻轻摇动。以下简化（ 图1G），我们将其组织碎片进入新鲜的消化培养基，并温育的组织碎片20分钟，在37℃下缓慢搅拌。将所得细胞悬浮液（ 图1H），是通过细胞过滤网（ 图1G）过滤。离心后，将沉淀的细胞重新悬浮于8ml电镀液和预镀成10cm的细胞培养皿（ 图2A），和2小时培养，以允许附件心脏成纤维细胞和内皮细胞（ 图2B，2C）的。细胞并没有快速连接被重新悬浮在电镀介质。 10ul含有心肌细胞的细胞悬浮液pipetteted到eppendorf管中并用比例为1:1一台盼蓝溶液。细胞，用自动细胞计数器计数，产生约5.1×10 5个活细胞/毫升镀介质。计数后，将细胞接种到430毫米胶原包被细胞培养皿（每皿2毫升）溶液，从而导致每皿（1.4×10 5个细胞/ cm 2， 图2D）约1×10 6接种细胞。 18小时后镀，心肌细胞附着到胶原包被细胞培养皿（具有约70％汇合），并开始收缩自发地（ 图2E，追加电影S2）。接着，是用以对心肌细胞脂质体转染（ 见表1）或细胞直接从电镀转移到维持培养基中（ 图2F）和另一培养3天。以下培养，心肌细胞短暂地洗涤在1x PBS中固定5分钟，在4％PFA / PBS中，并在我们的最近的出版物22中任意一项所述处理用于免疫荧光。 ，代表性的结果描绘免疫染色的未转染和转染心肌细胞培养物示于图2G和2H分别。在培养的新生心肌细胞显示预期的细胞结构，由肌原纤维的可视化作为明显的（ 图2G红色信号）和闰盘样结构（ 图2G绿色信号）。它们也适合于瞬时转染，如在图2H看出（绿色信号是被转染的蛋白质;使用的α-横纹肌辅肌动蛋白抗体的肌原纤维的红色信号复染）。
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图1：从分离新生小鼠心脏组织中A）的心脏从胸腔用弯钳小心地除去（另见补充电影S1），B）心从8例新生儿中分离洗涤在1x PBS（不含Ca 2 +，用弯剪碎心脏组织。F）的传输使用的是预湿吸管新生儿心中的Mg 2 +的），含20 mM的BDM冰上。 三）心被转移到一滴分离培养基。DE）切碎。G）过夜孵育在4℃ 高）的心肌细胞在悬浮液中消化并研磨20分钟后，经过简化的心脏组织。未消化的心脏组织积聚在管上。 我的底部）孤立C的悬浮液ardiomyocytes通过细胞过滤网过滤。
分离的细胞在预镀覆工序。 乙）心脏成纤维细胞和内皮细胞开始1-3小时后粘附到未涂覆细胞培养皿的开始的新生小鼠心肌细胞和有代表性的免疫荧光图像如图2所示。文化A）电镀在预镀覆工序。℃）的非贴壁的心肌细胞悬浮培养后的，其余的心脏成纤维细胞和内皮细胞可进一步培养，如果需要的话。的分离和纯化的新生小鼠的心肌细胞中的胶原蛋白包被的细胞培养盘D）的电镀E）18小时后，在文化，心肌坚持涂ðishes，最优开始自发收缩（也参见参考电影S2）。F）用维持培养基更换镀介质去除死细胞从培养。新生小鼠心肌细胞，染色，抗myomesin A）-F），比例尺为0.2mm。G）代表免疫荧光图像（发展研究杂交瘤细胞银行，爱荷华州，MMAC myomesin B4，红色）和β-连环蛋白（Sigma公司，目录号，无：C2206，绿色）。转染的新生小鼠的心肌细胞，在绿色的表达GFP标记的蛋白（GFP-连接素-N2B片段）和α-辅肌动蛋白（Sigma公司，目录号-A幢-7811）中红色的比例尺为10μm。 竖）代表免疫荧光图像。比例尺为20μm。一种用于转染和在2G用于免疫染色）和2H）方法可以在表1中找到，并总结在我们的最近的出版物22中的一个。
补充电影S1。 补充电影S2。 点击这里查看补充电影 。 表1。优化的电镀和培养条件下，脂质体转染。 表2。故障排除。许多因素会影响原代细胞的成功分离和培养秒。请参考手册，如“动物细胞培养的”伊恩Freshney 21，作为一般性的介绍为基本细胞培养技术。可能的原因中，我们遇到的新生小鼠cardiomocytes分离培养procedur问题通常都列在此表中。 预镀 预镀分离后的细胞大大删除从全细胞混合物心脏成纤维细胞和内皮细胞。一个单一的预镀步骤从细胞群中删除的非心肌细胞的约50-80％。不推荐使用预镀的两倍以上，以及预镀的时间超过3小时长的重复，由于心肌细胞的额外损耗。预镀与置换的Percoll梯度23,24可以改善心肌细胞群的纯度。 涂层和细胞培养基材 的细胞培养皿与前涂细胞外基质（ECM）组分如胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，细胞外基质复合物的混合物（ 即基质胶25,26）或人工基质（ 即硅氧烷聚合物27，有机硅烷28）正面影响心肌细胞粘附，细胞存活和细胞过程中的初始电镀步骤扩频和用于随后的培养时期。尤其是在玻璃基板上的心肌细胞的培养需要的表面与ECM成分的涂层来实现心肌细胞的适当的粘合性。
我们测试过的细胞培养物处理过的塑料和玻璃基板与多种细胞外基质成分，包括0.1％的胶原蛋白溶液（Sigma C-8919），3毫克/毫升的胶原1型溶液（高级生物基质，PureCol），1％明胶溶液（涂料西格玛G9391;溶于H 2 O，高压灭菌），层粘连蛋白溶液（Sigma公司L4544），或者从猪心29或心脏成纤维细胞30派生的复杂细胞外基质混合物。细胞丘尔重培养皿中的细胞培养孵化器孵育最少1小时的ECM解决方案来过夜，并除去细胞外基质中的层流细胞培养通风橱中干燥后。 ECM解决方案可多次重复使用（10-20倍），如果长期存放不育和ECM蛋白的完整性得以维持（ 如储存在4℃或冷冻）。小心，由于一些用于溶解ECM蛋白的缓冲液的酸性性质，可能需要的培养皿与涂布后的1×PBS洗涤细胞电镀之前。 电镀技术和密度 取决于随后的试验中，最佳的细胞浓度为电镀应该导致近汇合心肌细胞单层。心肌细胞在高浓度电镀导致多层心肌细胞聚集和低同质性，而低浓度的降低细胞活力，并导致单一的，孤立的心肌细胞缺乏专门的细胞间联系TS（嵌入圆盘状结构）。当在脑海电镀熊的心肌细胞的体积和重量较大，而且往往集中在猎鹰管的底部吹打细胞。细胞在电镀步骤之间的悬浮确保即使在整个美食分布的细胞。当电镀细胞移动的菜肴在一个图形的形状“8”，以避免细胞培养皿的中心集中。新生儿心肌指定脂质体转染的最佳融合应该是70-80％左右电镀后的第二天。 血清 细胞培养物的使用测试胎儿（或新生儿）在镀介质牛血清和马血清是必要在电镀步骤的细胞活力和心肌细胞的粘附。所用血清的质量可能是电镀/文化过程中的关键步骤之一。在维持培养基中含有少量血清的补充是可选的，但是可能大大IMPRO已经培养时间长短。
注意：在添加血清的可能显著改变在培养的心肌细胞的生物化学信号传导途径，并且可以相对于实验参数，假设和结果的后续解释来判断。心肌细胞的无血清培养物已被描述10,31，并且可以防止效果的倾斜是由于血清中存在的未知生长因子。 增殖抑制剂 终末分化的心肌细胞通常不经历细胞分裂。然而，除了增殖抑制剂，如10μM阿糖胞苷（胞嘧啶-BD-阿拉伯 - 呋喃盐酸盐;西格玛C6645），以维持培养基中，强烈推荐，以防止心脏成纤维细胞和内皮细胞的增殖。即使加入的预镀步骤，以减少心脏成纤维细胞和内皮细胞群，剩余的成纤维细胞会进行细胞proliferation和显著改变培养的细胞群体随着时间的推移。
注意：这取决于遗传因素和隔离时间点，胚胎和新生小鼠心肌细胞可能仍然有扩散的潜力23,32,33。阿糖胞苷的使用应根据实验参数，假设和结果的解释来判断 。 除了变时代理 或异丙肾上腺素（1微米，优先为新生小鼠心肌细胞;西格玛I6501）;维持培养基与34剂，如苯肾上腺素（Sigma公司P6126 0.1毫米，优先用于乳鼠心肌细胞）的补充大大增加sarcomerogenesis，心肌细胞上的传播板以及细胞自发性跳动。然而，除了这些药物应相对于所要测定的参数（ 例如除了可能会扭曲收缩行为和生化参数）称重。 转染 的DNA / RNA的脂质体转染到新生小鼠的心肌细胞是极大地依赖于转染时间点，转染试剂，培养密度，DNA / RNA的浓度和所用的DNA构建体。我们测试了各种脂质体转染试剂，发现ESCORT III（Sigma）和脂质体2000（Invitrogen公司）适用的。通过用抗生素免维护介质置换镀介质2小时转染前电镀后转染细胞24小时。新生儿心肌细胞转染30 mm培养皿中培养，混合1-2微克DNA用200μlDMEM培养基在无菌Eppendorf管中，并加入4微升护航三来稀释DNA混合物。轻轻混合并孵育至少5分钟在无菌罩，以允许DNA /脂质体复合物的形成。用800微升新鲜抗生素无维持培养基更换抗生素无维持培养基和添加的DNA /脂质体混合物加入到细胞中。孵育细胞在细胞立方米24小时后，用新鲜的标准维持液lture孵化器和更换。代表结果成功转染乳鼠心肌如图2H。利用DNA的钙沉淀转染也是可能的。相比，新生大鼠心肌细胞的新生小鼠的心肌细胞的转染是比较困难的，典型的转染效率范围从1-20％。病毒载体必须达到更高的效率35-37（ 如 ：腺病毒，腺相关病毒，慢病毒）。乳鼠心肌细胞的电穿孔是在我们手中不适合的DNA / RNA的交付，但一些报告显示了使用胚胎和新生儿心肌38,39电成功。在最近的第38条，竹文峥等人总结了几个转染的方法，成功率以及它们的优点和缺点。 传代冷冻/申通愤怒 心肌细胞的传代，不推荐1。隔离乳鼠心肌细胞长时间存放冷冻是非常困难的，我们不推荐的，由于低效率和低回收率。几家公司为人类心肌细胞原代培养物（ 例如 celprogen，目录号M36044-15FM）也可以是适合于新生小鼠的心肌细胞的冷冻保存提供专门的冷冻介质，但是条件可能需要进行优化。心房心肌细胞的成功的传代和冻存已经在转基因小鼠模型32进行了描述。 没有可行或贴壁细胞电镀后1天 - 降低酶浓度和/或消化时间
- 改变酶的混合物
- 茶用于电镀液NGE血清
- 变化的ECM /涂层介质和/或细胞培养皿类型
- 增加20毫米BDM隔离/消化媒体
- 检查电池的污染低细胞产量 - 增加消化时间和/或酶浓度
- 在分离过程中增加离心时间/速度
- 增加研磨期细胞培养汇合过低/高;电镀不均 - 在分离过程中细胞计数和电镀过程中调节细胞/皿号
- 调整浓度电镀
- 离心后小心地重悬细胞沉淀，并通过反复吹打（2日第13步）电镀之前，请确保没有可见的细胞团块保持没有跳动的细胞 -新增变时代理维护媒介（ 例如 ：苯肾上腺素，异丙肾上腺素）
- 更换培养基
- 通道的eck高数心脏成纤维细胞/内皮细胞大量的成纤维细胞 - 添加在分离过程中额外的预镀步
-新增增殖抑制剂，以维持液（ 表1） 许多死细胞 - 更换细胞培养基
- 减少在分离过程中酶的浓度和/或消化时间
-检查细胞培养恒温箱（CO 2，温度，湿度）
- 检查是否有污染污染 -坚持以无菌细胞培养工作条件21
- 更换培养基，使用新的青霉素/链霉素溶液
- 表面消毒新生小鼠用75％的乙醇溶液
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Discussion
利用动物模型来研究心脏疾病在心血管研究已经成为标准。这些模型的建立更紧密的生化特性（ 即研究心肌细胞的直接反应，生物化学或生物力学刺激）通常需要心脏组织或心肌细胞的分离。调查研究心脏的生理反应体外 （ 如对乙酰胆碱40，或在缺血再灌注场景41）一般采用的Langendorff灌注整个心灵42,43，而植体培养心肌组织碎片44,45允许对心肌细胞的研究中一个三维组织的环境。然而，培养外植体组织可能阻碍营养素的扩散，有可能产生该组织的核心内的坏死集群。此外，心肌细胞是组织内不动的，因此出细胞外植体的迁移是唯一OBSERVED非心肌细胞，成纤维细胞状或推定心肌祖细胞44。因此调查需要建立隔离和培养程序的心肌细胞的发育，细胞生物学，生物化学和生物物理行为。哺乳动物心肌细胞的分离和培养早期协议利用新生大鼠1,2。然而，鼠标的崛起，作为遗传学研究的模式系统（ 即转基因敲入和基因敲除小鼠）必要建立隔离和培养方法的适应性。不幸的是，与更传统使用的新生大鼠心肌细胞相比，新生小鼠心肌细胞的分离是特别具有挑战性的。所提出的协议描述为新生小鼠心肌细胞的分离和培养优化的可靠和稳定的方法。我们描述了所需的初始组织提取的步骤，对于解离次从心脏成纤维细胞和内皮细胞的心肌细胞的纯化，而对于电镀和培养条件。而协议提供了一个基本方法的新生小鼠心肌细胞在标准条件下的分离和培养，它可以很容易地适应对乳鼠心肌细胞的分离和培养，以及为特定的后续试验类型：分离细胞，例如文化在柔性膜（ 如 BIOflex就会培养板）调查生物力学特性，文化的玻璃底菜（MatTek）活细胞成像的xCELLigence心电子板的心肌细胞，或文化（商Acea，罗氏，Cat.-No.：06417051001）研究药物对收缩功能的影响。此外，我们还提供了分离和培养过程的优化选项，并讨论源可能遇到的问题及其解决方案。因此，该协议应协助研究人员研究了最新的最新的，高度重复性和经济实惠的方法制备新生鼠心肌细胞培养。
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Disclosures
无。
Acknowledgments
我们感谢名誉教授让 - 克洛德·Perriard和伊夫林Perriard（瑞士联邦理工学院，瑞士）的引入隔离技术的新生大鼠和小鼠心肌细胞。我们要感谢朱教授和陈教授西尔维娅·埃文斯（加州大学圣地亚哥分校，美国）的支持。在EE的实验室工作是由一个MRC事业建立格兰特。 SL是由K99/R00途径独立性奖从NIH / NHLBI（HL107744）的支持。 TMM是由美国心脏协会（11POST7310066）的博士后奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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