Summary
Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.
Abstract
Kultivierten neonatalen Kardiomyozyten seit langem verwendet, um Myofibrillogenese und myofibrillären Funktionen zu studieren. Kultivierte Kardiomyozyten ermöglichen eine einfache Untersuchung und Manipulation von biochemischen Wege, und ihre Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des spontan schlagenden Herzmuskelzellen.
Die folgende 2-Tages-Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Wir zeigen, wie leicht zu sezieren Herzen von Neugeborenen, distanzieren das Herzgewebe und bereichern Kardiomyozyten aus dem Herz-Zell-Population. Wir diskutieren den Einsatz von verschiedenen Enzymmischungen für Zell-Dissoziation und ihre Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit. Die isolierten Herzmuskelzellen kann anschließend für eine Vielzahl von morphologischen, elektrophysiologischen, biochemischen und zellbiologischen biomechanische Tests verwendet werden. Wir optimieren das Protokoll für die Robustheit und Reproduzierbarkeit, indem nur kommerziell erhältlichen Lösungen und Enzymmischungen, dass show wenig viel-zu-viel Variabilität. Wir wenden uns auch gemeinsame Probleme mit der Isolierung und Kultivierung von Herzmuskelzellen verbunden und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.
Introduction
Die frühesten Berichte für die erfolgreiche Dissoziation und Kultur von Nagetier Herzzellen stammt aus dem 1960 1,2. Selbst dann Harary und Farley bemerkt, dass kultivierte Kardiomyozyten "kann eine einzigartige System für die Untersuchung von den Anforderungen des Perioden Kontraktilität [und kann] ein Mittel zur Bestimmung des Beitrages der verschiedenen Stoffwechselwege für die [Schlagen] Prozess". Obwohl Harary und Farley isolierten und kultivierten Kardiomyozyten aus jungen Ratten, und der ursprüngliche Protokoll wurde angepasst, und über die Jahre von vielen Wissenschaftlern geändert, hat die allgemeine Isolation und Kultivierung Verfahren nicht wesentlich verändert. Allerdings hat bessere Enzyme 3, standardisierte Lösungen 4,5, und die Zugabe des reversiblen Kanal-und Myosin-ATPase-Inhibitor BDM Zellen während der Isolationsverfahren 9.6 Schutz deutlich verbessert Zell-Ertrag und Rentabilität.
Erwachsene vs Neugeborenen-Kardiomyozytenzyten
Kardiomyozyten isolierten und kultivierten neonatalen Mäusen oder Ratten haben mehrere Vorteile gegenüber Kulturen von adulten Kardiomyozyten. Vor allem ist das Isolierungsverfahren für neonatale Maus oder Rattenherzen einfacher und kostengünstiger im Vergleich zu der Isolierung von Kardiomyozyten aus adulten Maus oder Ratte 10. Neonatale Kardiomyozyten sind weit weniger empfindlich auf in eine Calcium-haltigem Medium nach der Dissoziation Wiedereinführung, Zellausbeute stark erhöht. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass neonatale Kardiomyozyten der Maus durchlaufen eine schnellere Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus, führt in der Regel spontan nach der Plattierung schlagen Zellen 20 Stunden, während adulte Kardiomyozyten erfordern in der Regel Tempo der Kontraktion induzieren. Neonatale Kardiomyozyten sind auch leichter transfizierbar mit liposomalen Transfektion Methoden, während adulte Kardiomyozyten erfordern virale Vektoren für die erfolgreiche Umsetzung der transgenen DNA. Im Gegensatz zur neonatalen Kardiomyozytens, die Kultur der erwachsenen Nagetieren Kardiomyozyten 11-13 ermöglicht Untersuchungen von myofibrillären Abbau und späteren Wiederherstellung der kontraktilen Apparates. Diese charakteristischen morphologischen Veränderungen in adulten Kardiomyozyten treten über einen Zeitraum von ca. 1-2 Wochen. Die Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus wird durch Reexpression des fetalen Gen Programm begleitet, was in der menschlichen Kardiomyopathien 14 beobachteten pathologischen Veränderungen imitiert. Ein weiterer Vorteil des adulten Rattenherzmuskelzellen auf die Kultur von neonatalen Kardiomyozyten ist die Fähigkeit, diese Zellen Kultur für lange Zeiträume.
Ratten-Herzmuskelzellen gegen Maus
Die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen hat einige Vorteile gegenüber der von der Maus neonatalen Kardiomyozyten, darunter höhere Ausbeuten an lebenden Zellen und erhöhte Transfektionsraten. Doch die breite Verwendung von genetisch veränderten Mausmodellen für Herzerkrankungen (zB </ Em> der Muskel lim Protein-Knockout-Maus als Modell für die dilatative Kardiomyopathie 15) wurde auf die Anpassung der Verfahren für die Isolation von Kardiomyozyten neugeborenen Mäusen abgeleitet geführt. Obwohl die zur neonatalen Ratte und Maus Kardiomyozyten isolieren Protokolle sind nahezu identisch, müssen größere Sorgfalt bei der Auswahl eines geeigneten Enzymmischung für die letztere eingenommen werden. Tatsächlich sind neonatalen Maus Kardiomyozyten im allgemeinen anfälliger für overdigestion, was zu einer verringerten Zell Ausbeute und Lebensfähigkeit. Außerdem sollte die Beschichtung Dichte eingestellt werden, weil Kardiomyozyten aus neugeborenen Mäusen abgeleitet Vergleich zu Zellen von neugeborenen Rattenherzen abgeleitet sind etwas kleiner.
Bei vielen Anwendungen für die Untersuchung der morphologischen, elektrochemische, biochemische, zellbiologische und biomechanische Parameter als auch für das Verfahren der Myofibrillogenese haben kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zu einem der vielseitigsten Systeme für das Studium derHerzzellfunktionen in vitro. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Test hängt jedoch auf eine einfache und zuverlässige Methode zur neonatalen Kardiomyozyten der Maus zu isolieren. Unser Protokoll bezieht seine Methodik aus vielen Quellen und wurde für die Reproduzierbarkeit und Robustheit optimiert. Wir diskutieren Faktoren, die Kardiomyozyten-Ertrag und Rentabilität zu beeinflussen, und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das folgende Verfahren beschreibt eine zweitägige Protokoll 16,17 für die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Alle Lösungen sind steril und steril filtriert. Alle Werkzeuge werden durch Oberflächensterilisation mit 75% Ethanol sterilisiert. Mit Ausnahme der anfänglichen Gewebeentnahme, werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömung Zellkulturhaube durchgeführt. Dieses Protokoll wird für die Isolierung von neonatalen Mäuseherzen 1-2 Wurf (s) bestimmt - etwa 5-14 Jungtieren, kann aber für größere Wurfgrößen und neonatalen Ratten-Kardiomyozyten angepasst werden. Skala media / Enzymeinsatz als angemessen.
Für die Arbeit mit Neugeborenen Nagetiere, finden Sie in Ihrer örtlichen Universität Richtlinien und Regeln von der Legislative und / oder Tierpflege-Programme eingestellt, und sich an Ihren institutionell genehmigten Tier Protokoll. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden von der UC San Diego Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt wurde, und sich an federal und Vorschriften.
1. Tag.
1. Isolation von Herzgewebe von neugeborenen Mäusen
- Bereiten Sie 50 ml 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM 8.6 ergänzt und zerstreuen sich in zwei sterile Bakterien Gerichte auf Eis gestellt.
- Bereiten Sie 10 ml Isolationsmedium in 50 ml sterile konische Falcon-Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Sterilisieren Schere (eine gekrümmte, eine geradeaus) und Zange (gekrümmt, Dumont Nr. 7).
- 1-3 Tage alten neugeborenen Mäusen werden schnell in 75% Ethanol-Lösung für die Oberflächensterilisation gespült. Jungtiere werden mit einer sterilen Schere (gerade) geköpft, und die Brust wird entlang dem Brustbein geöffnet werden, um Zugang zu der Brusthöhle und das Herz (1A, Supplemental Film S1) zu ermöglichen.
Technische Anmerkung: Neugeborene Mäuse älter als 3 Tage verwendet werden können, aber zu weniger lebensfähigen Zellen 2. - Herzen sind aus extrahiertder Körper mit gekrümmten Scheren und sofort in die Bakterienschale mit 1x PBS mit 20 mM BDM übertragen (ohne Ca 2 +, Mg 2 +), auf Eis. Alle folgenden Schritte werden in dem sterilen Zellkulturhaube durchgeführt.
- Lungengewebe zu entfernen, größere Gefäße (Vorhöfe und, falls gewünscht). Wash Herzen in der 1x PBS-Lösung (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis), um Blut zu entfernen. Über gewaschen Herzen aus der ersten in die zweite Schüssel Bakterienschale mit 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis) mit einer Pinzette oder einer gelochten Löffel (Abbildung 1B).
- Über gereinigt / gewaschen Herzen in einem Tropfen Isolationsmedium (etwa 250 ul; 1C) in einem dritten Bakterienschale (auf Eis) und die Verwendung der gebogenen Schere, um die Herzen in kleine Stücke (ca. 0,5-1 mm 3, Hackfleisch oder kleiner; 1D, 1E).
- Übertragen Hackfleisch Herzen in einer konischenRöhrchen mit 10 ml Isolationsmedium (auf Eis), und Inkubation unter leichtem Schütteln bei 4 ° C über Nacht.
2. Tag.
2. Enzymatische Verdauung und Gewebeüberzug der Zellen
- Wiegen in 15 mg Collagenase / Dispase Mischung (Roche) und lösen die Enzymmischung in 10 ml Medium L15-5 mit 20 mM BDM (Digestionsmedium) ergänzt. Sterilfilter der Digestionsmedium in der Zellkultur Haube in eine neue sterile 50 ml-Falcon-Röhrchen.
- Bereiten Sie 30 ml L-15-Medium mit 20 mM BDM ergänzt und Plattierungsmedium.
- Mantel Zellkulturplatten mit Collagen-Lösung (Sigma C-8919) für mindestens 1 Stunde. Entfernen Kollagenlösung (kann wiederverwendet werden) und trocken Kollagen beschichtete Zellkulturschalen in sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Kapuze.
- Entfernen Sie die konischen Rohr, das die Herzen von vorverdaut 4 ° C Gewebefragmente sollten zusammengefasst werden (1G). Lassen Sie die Gewebefragmente sinkender Boden der Röhre und Überstand (stellen Sie sicher, dass keine Gewebefragmente zu verlieren;. normalerweise kann ca. 1 ml der Isolationsmedium in der Röhre bleiben). 5 ml Digestionsmedium und 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt, um Gewebefragmente und sauerstoffhaltige Suspension unter Verwendung von Sauerstoff oder Luft für 1 min.
- Übertragen des versiegelten konischen Rohr die Herzgewebefragmente in Digestionsmedium, enthaltend bis 37 ° C Wasserbad für ungefähr 2 Minuten, um die Temperatur der Aufschlußlösung einzustellen.
- Herzgewebefragmente Bei 37 ° C unter leichtem Schütteln für 20-30 min (zB Schüttler bei 37 ° C, nicht mehr als 60 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist). . Aufschlusszeiten können stark von Enzymmischung und Chargennummer Achtung ab: längere Inkubationszeiten oder höhere Enzymkonzentrationen kann die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren.
Technische Anmerkung: Wir empfehlen Verwendung einer Collagenase / Dispase Mischung von Roche (Kat.-Nr.: 10269638001), die hat sehr wenig viel-zu-viel Variabilität. Die klassische Enzym für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten Trypsin und / oder Collagenase Typ II 3,16-20 verfügbar von Worthington (Cat No CLS-2). Jedoch kann die Leistung der Collagenase II im wesentlichen von Charge zu Charge variieren. Worthington können typischerweise für die Prüfung mehrerer Kollagenase Lose Aufschlusszeiten zu optimieren und Enzymverbrauch. Alternativ verkauft Worthington eine Kardiomyozyten Isolation Kit mit einer vorab getesteten Enzymgemisch enthalten, dass kann für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten 17 (Best.-Nr.: NCIS) angepasst werden.
- Zeigen sterilen Zell-Sieb (40-100 um Nylon-Mesh) in frischem sterilen 50 ml konischen Falcon-Röhrchen. Pre-Nasszelle Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt. Sanft verreiben Gewebefragmente mit einem vorbenetzten 10 ml Zellkultur-Pipette für etwa 10-20 mal. Die Gewebestücke sollten vor allem bei diesem Schritt zu zerstreuen, die Freigabe der Zellen in suspension (Fig. 1H).
- Lassen Sie größere Gewebestücke sedimentieren und Transferüberstand, der suspendierten Zellen in frisches konischen Rohr durch Zell-Sieb (1I).
- Die unverdaute Gewebefragmente Re-suspend in 5 ml Digestionsmedium und Inkubation für weitere 5-10 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
- Nach Fortsetzung der Verdauung der verbleibenden Gewebefragmente, sanft verreiben Gewebe 10-20 mal und in den konischen Röhrchen mit Zellen aus dem ersten bis Zellsieb verdauen. Spülen der Zelle-Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt um den Durchgang von allen verdaut Zellen zu ermöglichen.
- Zentrifugat konischen Röhrchen suspendiert Kardiomyozyten für 5 Minuten bei 300 rpm (ca. 50-100 × g). Den Überstand (enthaltend hauptsächlich Fibroblasten und Endothelzellen) und resuspendieren Zellpellet in 10 ml Agarmedium.
- Teller-Zellen in 10 cm Zellkulturschale (2A) und Inkubation für 1-3 H in Zellkulturbrutschrank. Diese Pre-Beschichtungsschritt entfernt Fibroblasten und Endothelzellen (Figur 2B), die auf den unbeschichteten Zellkulturschale (2C) haftet.
- Nach der Inkubation, Waschen nicht haft Kardiomyozyten von 10 cm Kulturschale (resuspendieren Zellen durch wiederholtes Pipettieren der Plattenmedium über die Schale) und Transfer resuspendierten Zellen in ein steriles Falcon konische Zentrifugenröhrchen (15 ml oder 50 ml).
Optional: Wiederholen Sie den Vor-Galvanisieren Schritt, um weitere Fibroblasten von Zell-Suspension zu entfernen. Falls gewünscht, können die anhaftenden Fibroblasten und Endothelzellen kultiviert werden. - Zählen von Zellen (zB durch Verwendung Neubauer Zählkammer, Trypanblau-Ausschluss-Färbung 21).
- Teller Zellen in Kollagen-beschichteten Zellkulturschalen mit einer Dichte von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro cm 2 (2D, siehe auch Kommentare in Tabelle 1 auf Plattierungund Beschichtung).
Setzen Gerichte in Zellkultur-Inkubator und lassen Sie ungestört für 12-18 h, für die Einhaltung und Verbreitung von Kardiomyozyten ermöglichen.
Tag 3 - Kultur der neonatalen Kardiomyozyten
- Bereiten Erhaltungsmedium und vorgewärmte in 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Zugabe von Proliferationshemmer oder chronotrope Mittel oder das Verfahren zur liposomalen Transfektion von neonatalen Maus Kardiomyozyten.
- Einen Tag nach der Beschichtung, sollten Kardiomyozyten in die Zellkulturschale eingehalten haben und optimal spontan beginnen zu schrumpfen (2E, 2F, STADT Movie-S2, siehe Tabelle 2 für häufige Probleme bei der Isolierung / Kultur Verfahren). Ersetzen Plattierungsmedium mit Erhaltungsmedium und Kultur für weitere 1-5 Tage. Medium gegebenenfalls ändern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Über dieses Protokoll isolierten wir Herzen aus 8 einen Tag alt neugeborenen Mäusen (1A, 1B, STADT Film S1). Nach dem Waschen und Zerkleinern der die Herzen mit einer Schere (1C-1F), Gewebefragmente wurden in Isolationsmedium über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln vorverdaut. Nach Vorverdauung (1G), die Gewebefragmente übertragen wir in frisch gemacht Verdauung Medium und die Gewebefragmente für 20 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. Die resultierende Zellsuspension (1H) wurde durch ein Zellsieb (1G) filtriert. Nach der Zentrifugation wurden die pelletierten Zellen in 8 ml Plattierungsmedium resuspendiert und in eine 10 cm Zellkulturschale (2A) vorplattiertes und für 2 h gezüchtet, um für die Befestigung des kardialen Fibroblasten und Endothelzellen (Fig. 2B, 2C) zu ermöglichen. Zellen, die nicht schnell zu befestigen habe waren rein den Beschichtungsmedium suspendiert. 10 ul der Zellsuspension, die Kardiomyozyten wurde in ein Eppendorf-Röhrchen pipetteted und mit Trypan-Blau-Lösung in einem Verhältnis von 1:1 gefärbt. Die Zellen wurden mit einem automatisierten Zellzähler gezählt, was in etwa 5,1 x 10 5 lebenden Zellen / ml Plattierungsmedium. Nach dem Zählen wurden die Zellen in vier 30 mm Kollagen beschichtete Zellkulturschalen (2 ml pro Schale) plattiert, was zu etwa 1 x 10 6 Zellen pro Schale plattiert (1,4 x 10 5 Zellen / cm 2, Fig. 2D). 18 Stunden nach dem Ausplattieren wurden Kardiomyozyten auf die Kollagen-beschichtete Zellkulturschalen (mit ca. 70% Konfluenz) angebracht und begann spontan kontrahieren (2E, STADT Movie-S2). Anschließend wurden Herzmuskelzellen entweder liposomalen Transfektion verwendet (siehe Tabelle 1) oder die Zellen direkt aus dem Überzug in dem Erhaltungsmedium (Fig. 2F) übertragen und für weitere 3 Tage kultiviert. Nach Kultivierung wurden die Kardiomyozyten kurz in 1x PBS gewaschen, 5 min in 4% PFA / PBS fixiert und verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in einem der unserem jüngsten Veröffentlichungen 22 beschrieben. Repräsentative Ergebnisse darstellt immunologisch gefärbten untransfizierten und transfizierten Kulturen Kardiomyozyten sind in den Figuren 2G und 2H gezeigt. Die kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zeigen die erwartete Zellarchitektur, wie aus der Darstellung der Myofibrillen (rotes Signal in Fig. 2G) und die eingelagerten, scheibenartigen Strukturen (Grün-Signal in Fig. 2G). Sie sind auch zugänglich für transiente Transfektionen, wie in Fig. 2H zu sehen (grün Signal das Protein transfiziert; Rotsignal Gegenfärbung von Myofibrillen Verwendung eines alpha-Actinin sarcomeric Antikörper).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Isolierung von Herzgewebe von neugeborenen Mäusen. A) Das Herz wird vorsichtig aus dem Brustkorb mit einer gebogenen Pinzette entfernt (siehe auch Zusatz Film S1). B) Herzen von acht Neugeborenen isoliert werden in 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM ergänzt auf Eis. C) Herzen werden in einem Tropfen Isolationsmedium übertragen. DE) Mincing der neonatalen Herzen mit einer gebogenen Schere. F) Transfer von Hackfleisch Herzgewebe unter Verwendung eines vorher benetzt Pipette. G) vorverdaut Herzgewebe nach Inkubation über Nacht bei 4 ° C H) Kardiomyozyten in Suspension nach 20 min der Verdauung und Verreiben. Unverdauten Herzgewebe sammelt sich am Boden des Röhrchens. I) die Aussetzung der isolierten cardiomyocytes wird durch ein Zellsieb filtriert.
Abbildung 2. Kultur der neonatalen Kardiomyozyten der Maus und repräsentative Immunfluoreszenz-Bilder. A) Auflage von isolierten Zellen zu Beginn der Pre-Plattierungsschritt. B) Herz-Fibroblasten und Endothelzellen beginnen, auf den unbeschichteten Zellkulturschale nach 1-3 h halten der Kultur während der Pre-Plattierungsschritt. C) Nach Resuspension der nicht haft Kardiomyozyten können verbleibende kardialen Fibroblasten und Endothelzellen kultiviert werden, falls gewünscht. D) Beschichtung des isolierten und gereinigten neonatalen Maus Kardiomyozyten in Kollagen-beschichteten Zellkulturschalen . E) nach 18 h in Kultur, Kardiomyozyten, die beschichteten d haftenPfarreien und optimal starten spontane Kontraktionen (siehe auch Zusatz Movie-S2). F) Austausch der Plattenmedium mit Erhaltungsmedium entfernt abgestorbene Zellen aus der Kultur. A)-F) Maßstabsbalken 0,2 mm. G) Immunfluoreszenz-Bild des Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten mit Antikörper gegen Myomesin gefärbten Vertreter (Developmental Studies Hybridoma Bank-, Iowa, MMAC Myomesin B4, in rot) und beta-Catenin (Sigma, Kat.-Nr .: C2206, in grün). Maßstabsbalken 10 um. H) Repräsentative Immunfluoreszenz Bild von transfizierten neonatalen Kardiomyozyten der Maus mit dem ausgedrückt GFP-markierten Protein in grün (GFP-Titin N2B-Fragment) und alpha-Actinin (Sigma, Kat. Nr. A-7811-) rot . Maßstabsleiste 20 um. Ein Verfahren für die Transfektion und immunologische Färbung in 2G verwendet werden) und 2H) sind in Tabelle 1 zu finden und wird in einer unserer aktuellen Publikationen 22 zusammengefasst.
STADT Film S1. STADT Film S2. Klicken Sie hier, um zusätzliche Film anzusehen . Tabelle 1. Optimierung von Beschichtungs-und Kulturbedingungen, liposomale Transfektion. Tabelle 2. Fehlerbehebung. Viele Faktoren können die erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Primärzellen beeinflussens. Bitte konsultieren Sie Handbücher wie "Culture of Animal Cells" von Ian Freshney 21, wie allgemeine Einführungen in die Grundlagenzellkulturtechniken. Mögliche Ursachen für Probleme bei der Isolierung und Kultur procedur der neonatalen Maus cardiomocytes, die wir am häufigsten anzutreffen sind in dieser Tabelle aufgeführt. Pre-Beschichtung Vor-Galvanisieren von Zellen nach der Isolierung erheblich entfernt kardialen Fibroblasten und Endothelzellen aus der gesamten Zellgemisch. Eine einzelne Vorgalvanisierung Schritt entfernt etwa 50-80% der nicht-Kardiomyozyten aus dem zell Bevölkerung. Wiederholung der vorge Plattieren mehr als zweimal, sowie Vor-Galvanisieren mal länger als 3 Stunden ist nicht empfohlen, da ein zusätzlicher Verlust von Herzmuskelzellen. Substitution von Pre-Vergoldung mit Percoll-Gradienten 23,24 kann die Reinheit der Kardiomyozyten Zellpopulation zu verbessern. Beschichtungs-und Zellkultursubstrat Beschichtung von Zellkulturschalen mit der Exzellulären Matrix (ECM)-Komponenten wie Kollagen, Fibronektin, Laminin, komplexen ECM-Mischungen (dh Matrigel 25,26) oder künstliche Substrate (dh Silikonpolymer 27, Organosilan 28) positiv auf die Einhaltung Kardiomyozyten, die Lebensfähigkeit der Zellen und Zellausbreitung während der ersten Beschichtungsschritt und zur anschließenden Kulturperiode. Insbesondere die Kultur von Kardiomyozyten auf Glassubstraten erfordert die Beschichtung der Oberfläche mit ECM-Komponenten, um eine ordnungsgemäße Haftung des Kardiomyozyten zu erreichen.
Wir testeten Beschichtung von Zellkultur-behandelten Kunststoff-und Glassubstrate mit einer Vielzahl von ECM-Komponenten, einschließlich 0,1% ige Collagenlösung (Sigma C-8919), 3 mg / ml Kollagen Typ 1-Lösung (Advanced Biomatrix, PureCol), 1% Gelatine-Lösung ( Sigma G9391, in H 2 O, autoklaviert) gelöst, Laminin-Lösungen (Sigma L4544), oder komplexe ECM Mischungen aus Schweineherzen 29 oder kardialen Fibroblasten 30 abgeleitet. Zell kulre Schalen wurden mit den ECM-Lösungen für mindestens 1 h bis über Nacht in der Zellkultur-Inkubator inkubiert und nach Entfernen der ECM in der laminaren Strömung Zellkulturhaube getrocknet. ECM Lösungen viele Male (10-20 mal) wieder verwendet werden, wenn die Sterilität und Integrität ECM-Protein bei längerer Lagerung erhalten bleibt (z. B. Lagerung bei 4 º C oder gefroren). Vorsicht aufgrund der sauren Natur einiger der verwendeten ECM-Proteine auflösen Puffer, Waschen der Kulturplatten mit 1 × PBS nach der Beschichtung kann vor dem Plattieren der Zellen benötigt werden. Plating Technik und Dichte Je anschließenden Tests, sollte eine optimale Zellkonzentrationen für die Beschichtung in der Nähe von konfluenten Monoschichten Kardiomyozyten führen. Überzug von Kardiomyozyten bei hohen Konzentrationen führen zu vielschichtigen Kardiomyozyten Aggregate und niedrige Homogenität, während niedrige Konzentrationen reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ergebnisse in einzelnen, isolierten Herzmuskelzellen frei von spezialisierten Zell-Zell-Schützets (lagert scheibenartige Strukturen). Beim Pipettieren Zellen für die Beschichtung zu beachten, dass Herzmuskelzellen sind ziemlich groß und schwer, und neigen dazu, auf dem Boden des Falcon-Röhrchen zu konzentrieren. Resuspension der Zellen in zwischen Plattierungsschritte gewährleistet eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen Gerichten. Wenn Galvanisierzellen bewegen Gerichte in der Form einer "8", um Konzentration der Zellen in die Mitte der Schale zu vermeiden. Das optimale Zusammenfließen der neonatalen Kardiomyozyten für liposomale Transfektion bezeichnet sollte um 70-80% am Tag nach der Beschichtung sein. Serum Die Nutzung der Zellkultur getestet fötalen (oder Neugeborenen) Rinderserum und Pferdeserum in der Beschichtungsmedium für die Lebensfähigkeit der Zellen und die Einhaltung der Herzmuskelzellen während der Beschichtungsschritt notwendig ist. Die Qualität des verwendeten Serum einer der kritischen Schritte bei der Beschichtung / Kulturverfahren sein. Ergänzung der Erhaltungsmedium mit geringen Mengen an Serum ist optional, kann jedoch stark improve Dauer der Kulturzeit.
Achtung: die Zugabe von Serum signifikant biochemischen Signalwege in kultivierten Kardiomyozyten ändern und kann in Bezug auf Versuchsparameter, die Hypothese und die anschließende Interpretation der Ergebnisse beurteilt werden. Serum-freien Kulturen von Kardiomyozyten beschrieben worden, 10,31 und können Verzerrungen der Ergebnisse aufgrund unbekannter Wachstum im Serum vorhandenen Faktoren zu verhindern. Proliferationshemmer Terminal differenzierten Kardiomyozyten in der Regel nicht Zellteilung zu unterziehen. Die Zugabe von Proliferationsinhibitoren, wie beispielsweise 10 &mgr; M AraC (Cytosin-BD-Arabino-Furanosid-Hydrochlorid, Sigma C6645) mit dem Erhaltungsmedium empfohlen, um die Proliferation von kardialen Fibroblasten und Endothelzellen verhindern. Auch mit dem Zusatz von Vor-Galvanisieren vor, um die Population von kardialen Fibroblasten und Endothelzellen zu verringern, werden die restlichen Zellen Fibroblasten unterzogen proliferation und signifikant die kultivierten Zell-Population im Laufe der Zeit ändern.
Achtung: je nach genetischen Faktoren und die Isolierung Zeitpunkt, embryonalen und neonatalen Kardiomyozyten der Maus können immer noch Proliferationspotential 23,32,33. Verwendung von AraC sollte je nach Versuchsparameter, Hypothese und Interpretation der Ergebnisse beurteilt werden. Die Zugabe von chronotropen Mitteln Ergänzung der Erhaltungsmedium mit Agenten 34, wie Phenylephrin (0,1 mM, bevorzugt für neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, Sigma P6126) oder Isoproterenol (1 uM, bevorzugt für neonatale Kardiomyozyten der Maus, Sigma I6501) erhöht Sarkomerogenese, Verbreitung von Kardiomyozyten auf die Platte sowie spontane Schlag von Zellen. Jedoch sollte die Zugabe dieser Mittel in Bezug auf die gewünschte Testparameter (z. B. Zugabe kann Kontraktionsverhalten und biochemische Parameter Skew) abgewogen werden. Transfektion Liposomalen Transfektion von DNA / RNA in neonatalen Maus Kardiomyozyten ist stark abhängig von der Transfektion Zeitpunkt Transfektionsreagenz, Kulturdichte, DNA / RNA-Konzentration und der verwendeten DNA-Konstrukt. Wir testeten eine Vielzahl von liposomalen Transfektionsreagenzien und fand ESCORT III (Sigma) und Lipofectamin 2000 (Invitrogen) anwendbar. Transfektion von Zellen 24 Stunden nach dem Ausstreichen durch den Austausch des Plattenmedium 2 h vor der Transfektion mit Antibiotika Wartung Medium. Für die Transfektion von neonatalen Kardiomyozyten in 30 mm Schalen kultiviert, mischen 1-2 ug DNA mit 200 ul DMEM in einem sterilen Eppendorf-Röhrchen, und fügen Sie 4 ul von Escort III zu der verdünnten DNA-Gemisch. Vorsichtig mischen und Inkubation für mindestens 5 min in der sterilen Haube DNA / Liposom-Komplex Bildung zu ermöglichen. Ersetzen Sie die Antibiotika-freie Erhaltungsmedium mit 800 ul frisch Antibiotika-freien Erhaltungsmedium und fügen DNA / Liposomen-Gemisch zu den Zellen. Inkubieren Zellen in Zell culture Inkubator und ersetzen mit frischen Standard-Erhaltungsmedium nach 24 Stunden. Ein repräsentatives Ergebnis für erfolgreich transfizierten neonatalen Kardiomyozyten der Maus ist in Abbildung 2H gezeigt. Transfektion unter Verwendung von Calciumfällung von DNA ist möglich. Transfektion von neonatalen Kardiomyozyten der Maus ist schwieriger im Vergleich zu neonatalen Ratten-Kardiomyozyten mit typischen Transfektionseffizienzen zwischen 1-20%. Virale Vektoren sind erforderlich, um höhere Wirkungsgrade zu erzielen 35-37 (zB Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Lentivirus). Elektroporation von neonatalen Kardiomyozyten in unseren Händen ist für die Lieferung von DNA / RNA jedoch ungeeignet mehrere Berichte zeigen Erfolg mit Elektroporation von embryonalen und neonatalen Kardiomyozyten 38,39. In einem aktuellen Artikel 38, Djurovic et al. Fassen mehrere Transfektion Methoden, Erfolgsraten sowie ihre Vor-und Nachteile. Passagierung Freezing / StoWut Die Passage von Kardiomyozyten wird nicht empfohlen, ein. Einfrieren von isolierten neonatalen Kardiomyozyten für eine längere Lagerung ist äußerst schwierig und nicht zu empfehlen aufgrund der geringen Effizienz und geringe Wiederfindungsraten. Mehrere Unternehmen bieten spezielle Gefriermedium für den menschlichen Kardiomyozyten Primärkulturen (z. B. celprogen, Katze. Nr. M36044-15FM), die auch für die Kryokonservierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus sein kann, aber Bedingungen können optimiert werden müssen. Die erfolgreiche Passagieren und Kryokonservierung von Vorhof Kardiomyozyten wurde in einem transgenen Mausmodell 32 beschrieben. Keine lebensfähig oder haftenden Zellen 1 Tag nach Beschichtung - Verringerung der Enzymkonzentration und / oder Verdauungszeit
- Änderung Enzymmischung
- Change Serum für Plattierungsmedium
- Änderung ECM / Beschichtungsmedium und / oder die Art der Zellkulturschalen
- Um die Isolierung / Verdauung Medien hinzufügen 20 mM BDM
- Überprüfen, für die Kontamination von Zellen Niedrige Zellausbeute - Zu erhöhen Aufschlusszeit und / oder Enzymkonzentration
- Erhöhung der Zentrifugation Zeit / Geschwindigkeit während Isolierungsverfahren
- Erhöhung Verreiben Zeitraum Konfluenz der Zellen in Kultur zu niedrig / hoch, unebene Beschichtung - Count Zellen während Isolierungsverfahren und stellen Anzahl der Zellen / Schale während der Plattierung
- Anpassung Beschichtung Konzentration
- Sorgfältig resuspendieren Zellpellet nach Zentrifugation und vor der Beschichtung durch wiederholtes Pipettieren (Tag 2 Schritt 13), stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Zellklumpen bleiben Keine schlagen Zellen - Fügen chronotropen Mitteln in Erhaltungsmedium (z. B. Phenylephrin, Isoproterenol)
- Medium ersetzen
- Check für hohe Anzahl von kardialen Fibroblasten / Endothelzellen Hohe Anzahl von Fibroblasten - Fügen zusätzliche Vorabscheidungsverfahren Schritt bei der Isolierung
- Fügen Proliferationsinhibitor in Erhaltungsmedium (Tabelle 1) Viele tote Zellen - Das Zellkulturmedium ersetzen
- Enzymkonzentration und / oder Verdauungszeit während der Isolationsverfahren reduzieren
- Kontrollzellkultur-Inkubator (CO 2, Temperatur, Feuchtigkeit)
- Überprüfen auf Verschmutzung Kontamination - Sterile Zellkulturarbeitsbedingungen 21 haften
- Neue Penicillin / Streptomycin-Lösung ersetzen Medium verwenden
- Oberfläche sterilisieren neonatalen Mäusen, die mit 75% Ethanol-Lösung
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Verwendung von Tiermodellen, um Herzerkrankungen zu untersuchen hat sich in der kardiovaskulären Forschung Standard. Closer biochemische Charakterisierung dieser Modelle (dh Studium direkte Antworten von Herzzellen zu biochemischen oder biomechanischen Reize) erfordert in der Regel die Isolierung von Herzgewebe oder Herzmuskelzellen. Studien, die physiologischen Reaktionen des Herzens ex vivo (z. B. Acetylcholin 40 oder in Ischämie-Reperfusion Szenarien 41) in der Regel nutzen Langendorff-perfundierten ganzem Herzen 42,43, während Explantatkulturen 44,45 von Herzgewebe Fragmente ermöglichen Untersuchungen von Kardiomyozyten in eine dreidimensionale Gewebeumgebung. Jedoch Kulti Explantat Gewebe können die Diffusion von Nährstoffen zu verhindern, was möglicherweise Erzeugen eines nekrotischen Cluster innerhalb des Kerns des Gewebes. Darüber hinaus sind Kardiomyozyten unbeweglich im Gewebe, daher Migration von Zellen aus Explantaten nur obsefür nicht-Kardiomyozyten, wie Fibroblasten oder vermeintlichen Herzvorläuferzellen 44 rved. Die Untersuchung der Entwicklungs-, zellbiologischen, biochemischen und biophysikalischen Verhalten von Kardiomyozyten daher erforderlich die Einrichtung der Isolation und Kultivierung Verfahren. Frühe Protokolle für die Isolierung und Kultivierung von Säugetier Kardiomyozyten nutzen neugeborenen Ratten 1,2. Doch der Aufstieg der Maus als Modellsystem für genetische Studien (dh genetisch veränderten Knock-in-oder Knock-out-Mäuse) erforderte die Anpassung der Isolierung und Kultivierung von etablierten Methoden. Leider ist die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus eine besondere Herausforderung gegenüber, dass der eher traditionell verwendet neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine zuverlässige und robuste Methode zur Isolierung und Kultur der neonatalen Kardiomyozyten der Maus optimiert. Wir beschreiben die für die erste Gewebeentnahme notwendigen Schritte, für die Dissoziation einnd Reinigung von Kardiomyozyten aus kardialen Fibroblasten und Endothelzellen, sowie für die Beschichtungs-und Kulturbedingungen. Während das Protokoll bietet einen Ansatz, um die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus in Standardbedingungen, kann es leicht zur Isolierung und Kultur von neugeborenen Ratten Kardiomyozyten für spezifische weiteren Testtypen angepasst werden, ebenso wie: zB Kultur der isolierten Zellen auf flexiblen Membranen (zB Bioflex Kulturplatten) zu biomechanischen Eigenschaften zu untersuchen, Kultur im Glasbodenschalen (MatTek) für die Live-Cell-Imaging oder Kultur von Herzmuskelzellen in xCELLigence Cardio-E-Platten (ACEA, Roche, Best.-Nr.: 06417051001) um die Auswirkungen von Medikamenten auf kontraktile Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus bieten wir Optionen für die Optimierung der Isolierung und Kulturverfahren und diskutieren Quellen für mögliche Probleme und ihre Lösungen. Daher sollte dieses Protokoll unterstützen Forscher untersuchen ein up-to-date, hoch reproduzierbare undkostengünstige Methode zur Herstellung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus Kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine.
Acknowledgments
Wir danken Prof. emeritus Jean-Claude Perriard und Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) für die Einführung in die Isolation Techniken zur neonatalen Ratten-und Maus-Kardiomyozyten. Wir möchten Prof. Ju Chen und Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) für ihre Unterstützung danken. Arbeit im Labor von EE wurde von einem MRC Karriere Gründung Zuschuss finanziert. SL wird von einem K99/R00 Weg in die Unabhängigkeit Auszeichnung von der NIH / NHLBI (HL107744) unterstützt. TMM wurde durch ein Postdoc-Stipendium der American Heart Association (11POST7310066) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
