Summary
Primära mus cardiomyocyte kulturer är en av de centrala verktygen för att utreda myofibrillar organisation och funktion. Följande protokoll beskriver isolering och odling av primära kardiomyocyter från neonatal mouse hearts. De resulte cardiomyocyte kulturer kan därefter användas för en mångfald av biomekaniska, biokemiska och cellbiologiska analyser.
Abstract
Odlade neonatala hjärtmuskelceller har länge använts för att studera myofibrillogenesis och myofibrillära funktioner. Odlade hjärtmuskelceller möjliggör enkel utredning och hantering av biokemiska vägar, och deras effekt på de biomekaniska egenskaperna av spontant slående hjärtmuskelceller.
Följande 2-dagars protokoll beskriver isolering och odling av nyfödda mus cardiomyocytes. Vi visar hur du enkelt dissekera hjärtan från nyfödda, dissociera hjärtvävnad och berika cardiomyocytes från hjärt-cell-populationen. Vi diskuterar användningen av olika enzymblandningar för cell-dissociation, och deras effekter på cell-livskraft. De isolerade kardiomyocyter därefter kan användas för en variation av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska eller biomekaniska analyser. Vi optimerat protokoll för robusthet och reproducerbarhet, genom att endast använda kommersiellt tillgängliga lösningar och enzym blandar att show litet parti till parti variabilitet. Vi vänder oss också vanliga problem i samband med isolering och odling av hjärtmuskelceller, och erbjuder en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.
Introduction
De tidigaste rapporterna för den framgångsrika dissociation och kultur av gnagare hjärtceller går tillbaka till 1960-talet 1,2. Även då Harary och Farley märkt att odlade hjärtmuskelceller "kan ge ett unikt system för studier av kraven i den periodiska kontraktilitet [och kan] ge ett sätt att fastställa bidraget av olika metaboliska vägar för [stryk] process". Även Harary och Farley isolerade och odlade hjärtmuskelceller från unga råttor, och det ursprungliga protokollet har anpassats och modifierats av många forskare genom åren, har den allmänna isolering och odling förfarandet inte mycket förändrats. Dock har bättre enzymer 3, standardiserade lösningar 4,5, och tillsats av den reversibla kanal och myosin ATPase inhibitor BDM att skydda celler under isoleringsförfarandet 6-9 signifikant förbättrad cellutbyte och viabilitet.
Vuxen vs neonatal cardiomyocyter
Cardiomyocytes isolerade och odlade från neonatala möss eller råttor har flera fördelar jämfört med kulturer av vuxna hjärtmuskelceller. Främst, är isoleringsförfarandet för neonatal mus-eller råtthjärtan enklare och billigare, jämfört med isolering av kardiomyocyter från vuxen mus eller råtta 10. Neonatal cardiomyocytes är mycket mindre känsliga för återinförande till en kalciuminnehållande mediet efter dissociation, kraftigt ökar cell-avkastning. En annan stor fördel är att neonatal mus cardiomyocytes genomgå en snabbare dedifferentiering - redifferentiering cykel som oftast resulterar i spontant slående celler 20 timmar efter plätering, medan vuxna cardiomyocytes kräver normalt pacing att inducera kontraktion. Neonatal cardiomyocytes är också lättare transfekterbara med liposomalt transfektion metoder, medan vuxna cardiomyocytes kräver virala vektorer för framgångsrik leverans av transgent DNA. I motsats till neonatal cardiomyocytes, kultur av vuxna gnagare cardiomyocytes 11-13 möjliggör undersökningar av myofibrillar nedbrytning och slutligen återupprättande av den kontraktila apparaten. Dessa karakteristiska morfologiska förändringar hos vuxna hjärtmuskelceller uppstår under perioder om 1-2 veckor. Den dedifferentiering - redifferentiering cykeln åtföljs av reexpression av fostrets genen programmet och därigenom härma sjukliga förändringar som observerats i humana kardiomyopati 14. En annan fördel av vuxna råttkardiomyocyter under odlingen av neonatala kardiomyocyter är förmågan att odla dessa celler under längre tidsperioder.
Rat vs mouse kardiomyocyter
Isolering och odling av råttneonatala kardiomyocyter har vissa fördelar jämfört med den hos mus-neonatala kardiomyocyter, inklusive högre utbyten av viabla celler och ökade transfektion hastigheter. Men den breda användningen av genetiskt modifierade musmodeller för hjärtsjukdomar (t ex </ Em> muskel lim protein knockout-mus som modell för dilaterad kardiomyopati 15) har lett till en anpassning av isoleringsförfarandet för cardiomyocytes härrör från neonatala möss. Trots att de protokoll som används för att isolera neonatal råtta och mus kardiomyocyter är nästan identiska bör större försiktighet iakttas vid val av en lämplig enzymblandning för den senare. Indeed, neonatal mouse kardiomyocyter i allmänhet är mer mottagliga för overdigestion, vilket resulterar i en reducerad cellavkastning och viabilitet. Dessutom bör pläteringen densitet justeras, eftersom kardiomyocyter härledda från neonatala möss är något mindre jämfört med celler som härrör från neonatala råtthjärtan.
Med många användningsområden för utredningen av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska och biomekaniska parametrar samt för arbetet med myofibrillogenesis har odlade neonatala hjärtmuskelceller blivit en av de mest mångsidiga system för att studerahjärtcellfunktioner in vitro. Det första steget till en framgångsrik analys dock, beroende på en enkel och tillförlitlig metod för att isolera neonatal mus cardiomyocytes. Vår protokoll drar sin metodik från många källor och var optimerad för reproducerbarhet och robusthet. Vi diskuterar faktorer som påverkar cardiomyocyte-avkastning och lönsamhet, och ger en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nedan beskrivs en tvådagarsprotokoll 16,17 för isolering och odling av neonatala möss hjärtmuskelceller. Alla lösningar är sterila eller sterilfiltrerades. Alla verktyg är steriliseras genom ytsterilisering med 75% etanol. Med undantag för den första vävnads utvinning, är alla steg utförs i en steril laminärt flöde cellkultur huva. Detta protokoll är avsedd för isolering av neonatal mus hjärtan 1-2 kull (er) - cirka 5-14 valpar, men kan anpassas för större kullstorlek och råtta neonatal cardiomyocytes. Skala media / enzymanvändning som är lämpligt.
För arbete med neonatal gnagare, se lokala riktlinjer för universitets och regler som anges av lagstiftaren och / eller djur vårdprogram, och hålla sig till din institutionellt godkänd djurprotokoll. Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av UC San Diego Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), och hålla sig till fedeRAL och statliga bestämmelser.
Dag 1.
1. Isolering av hjärtvävnad från neonatala möss
- Förbered 50 ml 1x PBS (utan Ca 2 +, Mg 2 +) kompletterat med 20 mM BDM 6-8, och sprida i två sterila bakteriella mat som ställs på is.
- Förbered 10 ml isoleringsmedium i 50 ml sterilt koniskt Falcon rör. Håll alla lösningar på is. Sterilisera sax (en böjd, en rak), och pincett (böjda, Dumont No.7).
- 1-3 dagar gamla neonatala möss sköljs snabbt i 75% etanollösning för ytsterilisering. Valpar dekapiteras använder steril sax (raka), och bröstkorgen öppnas längs bröstbenet för att ge tillgång till brösthålan och hjärtat (Figur 1A, Supple Movie S1).
Teknisk kommentar: Neonatal möss äldre än 3 dagar kan användas, men resulterar i färre livskraftiga celler 2. - Hjärtan extraheras frånkroppen med böjd sax och överförs omedelbart i bakterie skålen innehåller 1x PBS (utan Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM, på is. Alla efterföljande steg utförs i den sterila cellodlings huva.
- Ta lungvävnad, större fartyg (och förmak, om så önskas). Tvätta hjärtan i 1x PBS-lösning (utan Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM (på is) för att ta bort blod. Överföring tvättade hjärtan från första skålen i den andra bakterie skålen innehåller 1x PBS (utan Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM (på is) med hjälp av pincett eller en perforerad sked (Figur 1B).
- Överföring rengöras / tvättas hjärtan i en droppe isoleringsmedium (ca 250 l, Figur 1 C) i ett tredje bakteriell skålen (på is) och använd böjd sax för att mala hjärtan i små bitar (ca 0,5-1 mm 3, eller mindre; Figur 1D, 1E).
- Överför malet hjärtan i en koniskrör innehållande 10 ml av isoleringsmediet (på is) och inkubera under försiktig omrörning vid 4 ° C över natten.
Dag 2.
2. Enzymatisk Tissue Digestion och plätering av celler
- Väg in 15 mg kollagenas / dispas blandning (Roche) och lös upp den enzymblandningen i 10 ml L15-medel 5 kompletterat med 20 mM BDM (matsmältning medium). Sterilfiltrera uppslutningsmediet i cellodling huven in i en ny steril 50 ml Falcon-rör.
- Förbered 30 ml L-15-medium kompletterat med 20 mM BDM, och plätering medium.
- Coat cellkulturplattor med kollagenlösning (Sigma C-8919) i minst en timme. Ta kollagenlösning (kan återanvändas) och torra kollagenbelagd cell-kultur rätter i steril laminärt flöde cellkultur huva.
- Ta bort den koniska rör som innehåller de predigested hjärtan från 4 ° C. Vävnads fragment bör aggregeras (figur 1G). Låt vävnadsfragment sjunka tillbotten av röret och avlägsna supernatanten (se till att inte förlora någon vävnadsfragment,. normalt, får ca 1 ml av isoleringsmediet kvar i röret). Tillsätt 5 ml digestion mediet och 5 ml L-15 kompletterat med 20 mM BDM att vävnadsfragment och oxygenat suspension med användning av syre eller luft under en minut.
- Överför den förseglade koniskt rör innehållande hjärtvävnaden fragment i digere medium till 37 ° C vattenbad under ca 2 minuter för att justera temperaturen hos matsmältningen lösning.
- Inkubera hjärtvävnadsfragment vid 37 ° C med försiktig omröring under 20-30 minuter (t.ex. skak vid 37 ° C, inställd på att inte mer än 60 rpm). Digestionstid kan i hög grad bero på enzymblandning och partinummer Varning:. Längre inkubationstid eller högre enzymkoncentrationer kan minska cellernas livskraft.
Teknisk kommentar: Vi rekommenderar användning av en kollagenas / dispas blandning från Roche (Beställningsnr: 10269638001), som har mycket liten sats-till-lot variation. Det klassiska enzym för isolering av mus-kardiomyocyter är trypsin och / eller kollagenas typ II 3,16-20 tillgänglig från Worthington (Kat. nr CLS-2). Däremot kan utförandet av kollagenas II skiljer sig avsevärt från parti till parti. Worthington gör vanligtvis för testning av flera kollagenas massor att optimera matsmältningen tider och enzymanvändning. Alternativt Worthington säljer en cardiomyocyte isolering kit med en pre-testade enzymblandning ingår som kan anpassas för isolering av mus cardiomyocytes 17 (Cat No: NCIS).
- Placera steril cell-sil (40-100 um nylonnät) i fräscha sterila 50 ml koniska Falcon rör. Pre-wet cell sil med 5 ml L-15 kompletterat med 20 mM BDM. Försiktigt mal sönder vävnad fragment med en pre-fuktade 10 ml cellkultur pipett i ca 10-20 gånger. De vävnadsfragment bör mestadels dispergera under detta steg, och släppte celler till suspension (figur 1 H).
- Låt större vävnadsfragment sediment och överföra supernatanten innehållande suspenderade celler i friska koniska rör genom cell-sil (figur 1I).
- Återuppslamma osmälta vävnadsfragment i 5 ml digestion medium och inkubera under ytterligare 5 till 10 minuter vid 37 ° C med försiktig omrörning.
- Efter fortsatt nedbrytning av kvarvarande vävnadsfragment, försiktigt mal sönder vävnad för 10-20 gånger och lägg till koniska rör som innehåller celler från det första smälta igenom cell sil. Skölj cell sil med 5 ml L-15 kompletterat med 20 mM BDM att tillåta passage av alla digererade celler.
- Centrifugatet koniskt rör innehållande suspenderade kardiomyocyter för 5 minuter vid 300 varv per minut (ca 50 till 100 x g). Avlägsna supernatanten (innehållande mestadels fibroblaster och endotelceller) och slamma cellpelleten i 10 ml plätering medium.
- Plate celler i 10 cm cellodlingsskål (Figur 2A) och inkubera i 1-3 Tim i cellkultur inkubator. Denna pre-plating steg avlägsnar fibroblaster och endotelceller (Figur 2B), som kommer att häfta vid det obelagda cellodlingsskål (figur 2C).
- Efter inkubering tvättas icke-vidhäftande kardiomyocyter från 10 cm odlingsskål (återsuspendera cellerna genom upprepad pipettering pläterings mediet över skålen), och förflyttnings resuspenderade cellerna till en steril konisk Falcon centrifugrör (15 ml eller 50 ml).
Tillval: Upprepa pre-plating steg för att ta bort ytterligare fibroblaster från cell-suspension. Om så önskas kan de vidhäftande fibroblaster och endotelceller vara odlades vidare. - Räkna celler (t.ex. genom att använda Neubauer hemocytometer, trypanblåttuteslutning färgning 21).
- Plate celler till kollagenbelagda cellodlingsskålar med en densitet av ca 1,5 x 10 5 celler per cm 2 (fig 2D, se även kommentarer i tabell 1 på bordläggningenoch beläggning).
Placera diskgodset i cellkultur inkubator och lämna ostört under 12-18 timmar för att möjliggöra vidhäftning och spridning av hjärtmuskelceller.
Dag 3 - Kultur av neonatal cardiomyocytes
- Förbered underhållsmedium och Förvärm i 37 ° C vattenbad. Se tabell 1 för tillsättning av spridnings inhibitorer eller kronotropa agenter, eller förfarandet för liposomal transfektion av neonatala möss hjärtmuskelceller.
- En dag efter plätering, borde cardiomyocytes ha anslutit sig till cellodlingsskål och optimalt börjar spontant att ingå avtal (Figur 2E, 2F, Supple Movie S2, se tabell 2 för vanliga problem under isolering / kultur förfarande). Ersätt plätering medium med underhåll medium och kultur för ytterligare 1-5 dagar. Ändra medel som behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, isolerade vi hjärtan från 8 en dag gamla neonatala möss (fig. 1A, 1B, Supple Movie S1). Efter tvättning och mals hjärtan med en sax (figurerna 1C-1F), var vävnadsfragment predigested i isoleringsmedium över natt vid 4 ° C med försiktig omrörning. Efter försmältning (figur 1G), överförs vi vävnadsfragment i nybakade matsmältning medium och inkuberas vävnadsfragment för 20 minuter vid 37 ° C under försiktig omrörning. Den resulterande cellsuspension (figur 1H) filtrerades genom ett cellfilter (figur 1G). Efter centrifugering, de pelleterade cellerna resuspenderades i 8 ml plating medium och pläterad i en 10 cm cellodlingsskål (figur 2A), och odlades under 2 timmar för att möjliggöra fastsättning av hjärt fibroblaster och endotelialceller (Figurerna 2B, 2C). Celler som inte snabbt fäster var resuspenderades i pläterings-medium. 10 | il av cellsuspensionen innehållande kardiomyocyter var pipetteted i ett Eppendorf-rör och färgades med en lösning av trypanblått i ett förhållande 1:1. Cellerna räknades med användning av en automatiserad cellräknare, vilket resulterar i ca 5,1 x 10 5 levande celler / ml plating medium. Efter räkning, spreds cellerna i fyra 30 mm kollagenbelagda cellodlingsskålar (2 ml per skål), vilket resulterar i cirka 1 x 10 6 utstrukna celler per skål (1,4 x 10 5 celler / cm 2, fig. 2D). 18 timmar efter plätering, var cardiomyocytes knutna till kollagenbelagda cellodlingsskålar (med ca 70% sammanflytning) och började att dra ihop sig spontant (figur 2E, Supple Movie S2). Därefter kardiomyocyter användes antingen för liposomal transfektion (se tabell 1), eller cellerna direkt överförs från bordläggningen till underhållsmedium (Figur 2F) och odlades under ytterligare 3 dagar. Efter kultur, var hjärtmuskelceller korthet tvättas i 1x PBS, fast i 5 minuter i 4% PFA / PBS och behandlas för immunofluorescens som beskrivs i en av våra senaste publikationer 22. Representativa resultat som visar immunologiskt färgade otransfekterade och transfekterade cardiomyocyte kulturer visas i fig 2G och 2H, respektive. De odlade neonatala kardiomyocyter visar den förväntade cytoarchitecture, såsom framgår av visualisering av myofibriller (röd signal i fig. 2G) och de inskjutna skivliknande strukturer (grön signal i fig. 2G). De är också mottaglig för transienta transfektioner, såsom ses i figur 2H (grön-signalen är det transfekterade proteinet; röd signal motfärgning av myofibriller med användning av en alfa-sarkomeriskt actinin antikropp).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Figur 1. Isolering av hjärtvävnad från neonatala möss. A) Hjärtat avlägsnas försiktigt från bröstkorgen med hjälp av böjda pincett (se även Supple Film S1). B) hjärtan isolerade från 8 nyfödda tvättas i 1 x PBS (utan Ca 2 +, Mg 2 +) kompletterat med 20 mM BDM på is. C) Hjärtan överförs till en droppe isoleringsmediet. DE) Finhacka av neonatala hjärtan med hjälp av böjd sax. F) Överföring av malet hjärtvävnad med hjälp av en pre-fuktade pipett. G) predigested hjärtvävnad efter över-natten inkubation vid 4 ° C. H) Cardiomyocytes i suspension efter 20 min för matsmältning och finfördelning. Ospjälkad hjärtvävnad ackumuleras vid botten av röret. I) Suspensionen av isolerad cardiomyocytes filtreras genom ett cellfilter.
Figur 2. Kultur av neonatal mus hjärtmuskelceller och representativa immunfluorescensbilder. A) plätering av isolerade celler i början av pre-plating steg. B) Hjärtat fibroblaster och endotelceller börjar följa den obelagda cellodlingsskål efter 1-3 tim kultur under pre-plating steg. C) Efter resuspension av icke-vidhäftande cardiomyocytes, kan resterande hjärt fibroblaster och endotelceller ytterligare odlas, om så önskas. D) Plating av isolerade och renade neonatal mus cardiomyocytes i kollagenbelagda cell-kultur rätter . E) Efter 18 timmar i kultur, cardiomyocytes följa den belagda dishes och optimalt starta spontana kontraktioner (se även Supple Movie S2). F) Byta plating medium med underhållsmedium avlägsnar döda celler från kulturen. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) Representant immunofluorescens bild av neonatal mus cardiomyocytes, färgade med antikroppar mot myomesin (Utvecklingsstudier Hybridoma Bank, Iowa, MMAC myomesin B4, i rött) och beta-catenin (Sigma, kat.-Nej .: C2206, i grönt). Scalebar 10 um. H) Representant immunofluorescens bild av transfekterade neonatal mus cardiomyocytes med uttryckt GFP-märkta proteinet i grönt (GFP-titin-N2B fragment), och alfa-actinin (Sigma, katalog-No.A-7811) i rött . Scalebar 20 um. En metod för transfektion och immunologisk färgning används i 2G) och 2H) återfinns i tabell 1, och sammanfattas i en av våra senaste publikationer 22.
Supple Film S1. Kompletterande Movie S2. Klicka här för att visa extra film . Tabell 1. Optimering av plätering och odlingsbetingelser, liposomal transfektion. Tabell 2. Felsökning. Många faktorer kan påverka den framgångsrika isolering och odling av primärceller. Rådgör handböcker som "Culture of Animal Cells" av Ian Freshney 21, som allmänna introduktioner till grundläggande cellodlingsteknik. Möjliga orsaker till problem i isolering och odling procedur för neonatal mus cardiomocytes som vi stött på oftast listas i den här tabellen. Pre-plating Pre-plätering av celler efter isolering tar bort mycket hjärt fibroblaster och endotelceller från hela cellblandningen. En enda pre-plating steg bort cirka 50-80% av den icke-hjärtmuskelceller från cellpopulationen. Repetition av pre-plating mer än två gånger, samt för pre-plating gånger längre än 3 timmar rekommenderas inte, på grund av ytterligare förlust av hjärtmuskelceller. Substitution av pre-plating med Percoll-gradient 23,24 kan förbättra renheten hos cardiomyocyte cellpopulationen. Beläggning och cellodlingssubstrat Beläggning av cell-kultur rätter med extracellular matrix (ECM) komponenter som kollagen, fibronektin, laminin, komplexa ECM blandningar (dvs. Matrigel 25,26) eller artificiella substrat (dvs. silikonpolymer 27 organosilanen 28) påverkar positivt cardiomyocyte följsamhet, cellviabilitet och cellspridning under den inledande pläteringssteget och för den efterföljande odlingsperioden. Särskilt odling av kardiomyocyter på glas substrat kräver beläggning av ytan med ECM-komponenter för att uppnå rätt vidhäftning av kardiomyocyter.
Vi testade beläggning av cellodlings behandlade plast-och glassubstrat med en variation av ECM-komponenter, inklusive 0,1% kollagenlösning (Sigma C-8919), 3 mg / ml kollagen typ 1-lösning (Advanced Biomatrix, PureCol), 1% gelatinlösning ( Sigma G9391, löstes i H2O, autoklaverat), laminin lösningar (Sigma L4544), eller komplexa ECM-blandningar erhållna från svinhjärtan 29 eller hjärt fibroblaster 30. Cell kulture rätter inkuberades med ECM-lösningar för minst 1 timme till över natten i cellkultur inkubator, och efter avlägsnande av ECM torkas i laminärt flöde cellkultur huva. ECM-lösningar kan återanvändas många gånger (10-20 gånger) om sterilitet och ECM protein integritet under långvarig lagring bibehålls (t.ex. lagring vid 4 ° C eller fryst). Försiktighet, på grund av den sura karaktären hos vissa av de buffertar som används för upplösning ECM-proteiner, tvättning av odlingsskålar med 1x PBS efter beläggning kan krävas innan plätering av cellerna. Plätering Teknik och densitet Beroende på efterföljande analyser, bör optimala cellkoncentrationer för plätering leda till nära-sammanflytande cardiomyocyte monolager. Plätering av hjärtmuskelceller vid höga koncentrationer orsaka flerskiktade cardiomyocyte aggregat och låg homogenitet, medan låga halter minskar cellviabiliteten och resultat i enstaka, isolerade cardiomyocytes saknar specialiserad cell-cell contacts (inskjutna skivliknande uppbyggnader). När pipet celler för plätering ha i åtanke att hjärtmuskelceller är ganska stora och tunga, och tenderar att koncentrera sig på botten av falk rör. Resuspension av celler i mellan bordläggningen steg säkerställer jämn fördelning av celler i hela disken. Vid utstrykning av celler flyttas rätter i form av en figur "8" för att undvika koncentration av cellerna till centrum av skålen. Den optimala confluency av neonatala hjärtmuskelceller som utsetts för liposomalt transfektion bör vara cirka 70-80% dagen efter plätering. Serum Användningen av cellodling testade foster (eller nyfödd) bovint serum och hästserum i bordläggningen mediet är nödvändig för cellernas livskraft och vidhäftning av hjärtmuskelceller under pläteringssteget. Kvaliteten på det använda serumet kan vara en av de kritiska stegen under pläteringen / kultur förfarandet. Komplettering av underhållsmediet med låga mängder av serum är valfritt, men kan kraftigt improve längd kulturtiden.
Varning: tillägg av serum kan signifikant ändra biokemiska signalvägar i odlade hjärtmuskelceller och kan bedömas med avseende på experimentella parametrar, hypotes och efterföljande tolkning av resultaten. Serumfria odlingar av kardiomyocyter har beskrivits 10,31, och kan förhindra skevning av resultat på grund av okända tillväxtfaktorer som är närvarande i serumet. Proliferations inhibitorer Terminalt differentierade cardiomyocytes vanligtvis inte genomgå celluppdelning. Men tillägg av spridnings hämmare, såsom 10 ^ M AraC (Cytosin-BD-arabino-furanosid hydroklorid, Sigma C6645) är till underhållsmediet rekommenderas för att förhindra spridning av hjärt fibroblaster och endotelceller. Även med tillägg av pre-plating åtgärder för att minska populationen av hjärt fibroblaster och endotelceller, kommer de återstående fibroblaster genomgå cell proliferation och väsentligt ändra odlade cell-population över tiden.
Varning: beroende på genetiska faktorer och isolering tidspunkt, embryonala och neonatala möss hjärtmuskelceller kan fortfarande ha spridning potential 23,32,33. Användning av AraC bör bedömas beroende på experimentella parametrar, hypotes och tolkning av resultat. Tillsats av kronotropa medel Komplettering av underhållsmediet med medel 34, såsom fenylefrin (0,1 mM, företrädesvis för neonatala råttkardiomyocyter, Sigma P6126), eller isoproterenol (1 ^ M, företrädesvis för neonatal mus cardiomyocytes, Sigma I6501) ökar kraftigt sarcomerogenesis, spridning av hjärtmuskelceller på platta och spontan misshandel av celler. Dock bör tillägg av dessa medel vägas med avseende på önskade analysparametrar (t.ex. Dessutom kan skeva sammandragande beteende och biokemiska parametrar). Transfektion Liposomal transfektion av DNA / RNA in i neonatal mouse kardiomyocyter är starkt beroende av den transfektion tid-punkt, transfektionsreagens, odlingstäthet, DNA / RNA-koncentration och användes DNA-konstruktion. Vi har testat ett antal olika liposomala transfektionsreagens och fann ESCORT III (Sigma) och lipofektamin 2000 (Invitrogen) är tillämpligt. Transfektera celler 24 timmar efter plätering genom att ersätta plätering mediet 2 timmar före transfektion med antibiotika gratis underhåll medium. För transfektion av neonatala hjärtmuskelceller odlas i 30 mm skålar, blanda 1-2 mikrogram DNA med 200 l DMEM i ett sterilt Eppendorf-rör och tillsätt 4 l av Escort III till den utspädda DNA-blandningen. Blanda försiktigt och inkubera i minst 5 minuter i den sterila huven för att låta DNA / liposomkomplex bildning. Ersätt antibiotika-free upprätthållande medium med 800 | il färskt antibiotika-free underhållsmedium och till DNA / liposom-blandningen till cellerna. Inkubera cellerna i cell culture inkubator och ersätta med nytt standard underhållsmedium efter 24 tim. Ett representativt resultat för framgångsrikt transfekterade neonatal mouse kardiomyocyter visas i fig 2H. Transfektion med användning av kalcium-utfällning av DNA är också möjlig. Transfektion av neonatal mus cardiomyocytes är svårare jämfört med neonatala råttkardiomyocyter, med typiska transfektionseffektiviteter sträcker 1-20%. Virala vektorer som krävs för att uppnå högre effektivitet från 35 till 37 (t.ex. adenovirus, adenoassocierade virus, lentivirus). Elektroporation av neonatala hjärtmuskelceller är i våra händer som är olämpliga för leverans av DNA / RNA, men flera rapporter visar framgång med hjälp av elektroporation av embryonala och neonatal cardiomyocytes 38,39. I en nyligen publicerad artikel 38, Djurovic et al. Sammanfatta flera transfektion metoder, träffsäkerhet och deras fördelar och nackdelar. Passage Frysning / Storaseri Passage av hjärtmuskelceller rekommenderas inte 1. Frysning av isolerade neonatal cardiomyocytes för långvarig förvaring är ytterst svårt och rekommenderas inte på grund av låg effektivitet och låga återvinningsnivåer. Flera företag erbjuder specialiserad frysmedium för humana cardiomyocyte primärkulturer (t.ex. celprogen, katt. Nr. M36044-15FM) som också kan vara lämpliga för frysförvaring av neonatal mus cardiomyocytes dock förhållanden kan behöva optimeras. Den framgångsrika passage och kryokonservering av atriella kardiomyocyter har beskrivits i en transgen musmodell 32. Inga livsdugliga eller vidhäftande celler 1 dag efter plätering - Minska enzymkoncentration och / eller matsmältningen tid
- Förändring enzymblandning
- Change serum för plätering av mediet
- Förändring ECM / beläggning medium och / eller typ av cellodlingsskålar
- Lägg till 20 mM BDM till isolering / matsmältning media
- Kontrollera förorening av celler Lågt cellutbyte - Öka koktiden och / eller enzymkoncentration
- Ökning centrifuge tid / hastighet under isoleringsförfarandet
- Ökning finfördelning period Sammanflytning av celler i kultur är för låg / hög, ojämn plätering - Räkna celler under isoleringsförfarandet och justera antalet celler / skål under pläteringen
- Justera bordläggningen koncentration
- Försiktigt resuspendera cellpelleten efter centrifugering och innan plattor genom upprepad pipettering (dag 2 steg 13), se till att inga synliga cellklumpar kvar Ingen slår celler - Lägga kronotropa agenter till underhåll medium (t.ex. fenylefrin, isoproterenol)
- Byt medel
- Check för högt antal hjärt fibroblaster / endotelceller Högt antal fibroblaster - Lägga till ytterligare preplating steg under isoleringsförfarandet
- Lägga spridning hämmare till underhållsmedium (tabell 1) Många döda celler - Byt ut cellkulturmedium
- Minska enzymkoncentration och / eller matsmältningen tid under isoleringsförfarandet
- Check cellodling inkubator (CO2, temperatur, fuktighet)
- Kontrollera förorening Förorening - Hålla sig till sterila cellodlings arbetsvillkor 21
- Byt medium, använd ny penicillin / streptomycin lösning
- Yta sterilisera neonatala möss med 75% etanollösning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av djurmodeller för att studera hjärtsjukdomar har blivit standard i kardiovaskulär forskning. Närmare biokemisk karakterisering av dessa modeller (dvs. studerar direkta svar av hjärtceller till biokemiska och biomekaniska stimuli) kräver vanligen isolering av hjärt vävnader eller hjärtmuskelceller. Studier som undersöker fysiologiska reaktioner i hjärtat ex vivo (t.ex. för att acetylkolin 40, eller i ischemi-reperfusion scenarier 41) i allmänhet utnyttjar Langendorff-perfusion hela hjärtan 42,43, medan Explantation kulturer 44,45 av hjärtvävnadsfragment möjliggör undersökningar av hjärtmuskelceller i en tredimensionell vävnadsmiljö. Emellertid kan odling Explantation vävnader hindra diffusion av näringsämnen, vilket kan generera en nekrotisk kluster inuti härden i vävnaden. Dessutom kardiomyocyter är orörliga i vävnaden, därför migration av celler av explantat endast observed för icke-hjärtmuskelceller, som fibroblaster eller förmodade hjärt progenitorceller 44. Undersöka utvecklings, cellbiologiska, biokemiska och biofysiska beteende cardiomyocytes krävs det därför särskilda isoleringen och odlingsförfaranden. Tidiga protokoll för isolering och odling av däggdjurshjärtmuskelceller utnyttjar neonatala råttor 1,2. Men ökningen av musen som modellsystem för genetiska studier (dvs. genetiskt modifierade knock-in eller knock-out-möss) krävde anpassning av etablerade isolering och odling metoder. Tyvärr är isoleringen av neonatal mus cardiomyocytes särskilt utmanande jämfört med den för de mer traditionellt använda neonatala råttkardiomyocyter. Den presenterade protokollet beskriver en pålitlig och robust metod optimerade för isolering och odling av nyfödda mus cardiomyocytes. Vi beskriver de steg som behövs för inledande vävnad utvinning, för dissociation ennd rening av hjärtmuskelceller från hjärt fibroblaster och endotelceller, och för plätering och odlingsbetingelser. Medan protokollet erbjuder en enkel metod för isolering och odling av nyfödda mus kardiomyocyter under standardförhållanden, kan den lätt anpassas för isolering och odling av neonatala råttkardiomyocyter, liksom för specifika efterföljande analystyper, t.ex. odling av de isolerade cellerna på flexibla membran (t.ex. Bioflex odlingsplattor) att undersöka biomekaniska egenskaper, kultur i glas botten rätter (Mattek) för levande cell imaging, eller odling av hjärtmuskelceller i xCELLigence cardio e-plattor (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) att studera effekterna av läkemedel på kontraktila funktioner. Dessutom erbjuder vi alternativ för optimering av isolering och odling förfarande och diskutera källor för möjliga problem och lösningar. Därför bör detta protokoll hjälpa forskare pröva en up-to-date, mycket reproducerbar ochprisvärd metod för framställning av neonatal mus cardiomyocyte kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till professor emeritus Jean-Claude Perriard och Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) att föra in isoleringstekniker för neonatal råtta och mus cardiomyocytes. Vi vill tacka professor Ju Chen och professor Sylvia Evans (UCSD, USA) för deras stöd. Arbetet i laboratoriet av EE har finansierats av en MRC Career Establishment Grant. SL stöds av en K99/R00 väg till självständighet utmärkelse från NIH / NHLBI (HL107744). TMM fick stöd av ett postdoktorsstipendium från American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
