Summary
תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.
Abstract
שריר לב בילוד תרבותי כבר מזמן משמש ללמוד myofibrillogenesis ופונקציות myofibrillar. שריר לב בתרבית מאפשר חקירה קלה ומניפולציה של מסלולים ביוכימיים, וההשפעה שלהם על המאפיינים ביומכניים של ספונטני להכות שריר לב.
פרוטוקול 2 הימים הבאים מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מראים כיצד לנתח בקלות את לב מילודים, לנתק את רקמת הלב ולהעשיר את שריר לב מתאי אוכלוסיית לב. אנחנו דנים בשימוש בתערובות אנזים שונות לתא דיסוציאציה, וההשפעות שלהם על תא את יכולת הקיום. שריר הלב המבודד יכול לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי או ביומכנית. אנו מותאמים הפרוטוקול לחוסן ושחזור, על ידי שימוש בפתרונות רק זמינים מסחרית ואנזים מתערבב שshהשתנות קטנות ow הרבה להרבה. אנחנו גם להתמודד עם בעיות נפוצות הקשורות לבידוד והתרבות של שריר לב, ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.
Introduction
הדיווחים המוקדמים ביותר לניתוק והתרבות המוצלחים של תאי לב מכרסמים שתחילתה ב1960 של 1,2. גם אז, הררי ופארלי שמו לב ששריר לב בתרבית "עשוי לספק מערכת ייחודית ללימוד הדרישות של ההתכווצות התקופתית [ואולי] לספק אמצעי קביעת התרומה של מסלולי מטבוליים שונים ל[ מכות] התהליך". למרות ששריר לב מבודד ומתורבת הררי ופארלי מחולדות צעירות, והפרוטוקול המקורי הותאם והותאם על ידי מדענים רבים במשך השנים, הליך הבידוד וculturing הכללי לא השתנה באופן משמעותי. עם זאת, אנזימים טובים יותר 3, פתרונות סטנדרטיים 4,5, והתוספת של הערוץ הפיך וBDM מעכבי ATPase שרירן כדי להגן על תאים במהלך הליך בידוד 6-9 השתפרו באופן משמעותי תא תשואה וכדאיות.
מבוגרים לעומת cardiomyo בילודcytes
יש לי cardiomyocytes המבודד ומתורבת מעכברים או חולדות בילוד מספר יתרונות על פני תרבויות של שריר לב מבוגר. בראש ובראשונה, הליך הבידוד ללבם עכבר או עכברוש בילוד הוא קל יותר ויקר פחות, בהשוואה לבידוד של שריר לב מעכבר בוגר או חולדה 10. cardiomyocytes ילודים הם הרבה פחות רגיש להשבה לטבע לבינוני מכיל סידן לאחר ניתוק, מאוד להגדיל תא תשואה. יתרון גדול נוסף הוא ששריר לב עכבר בילוד עובר טשטוש הבדלים מהיר יותר - מחזור redifferentiation שבדרך כלל תוצאות באופן ספונטני להכות תאים 20 שעות לאחר ציפוי, בעוד שבדרך כלל שריר לב מבוגר דורש לצעוד כדי לגרום להתכווצות. cardiomyocytes ילודים הם גם יותר בקלות transfectable עם שיטות transfection liposomal, ואילו שריר לב מבוגר דורש וקטורים ויראליים למסירה מוצלחת של ה-DNA המהונדס. בניגוד לcardiomyocyte בילודים, התרבות של cardiomyocytes מכרסמים המבוגר 11-13 מאפשרת לחקירות של השפלה myofibrillar והקמתה מחדש סופו של דבר את מנגנון ההתכווצות. שינויים מורפולוגיים האופייניים אלה בשריר לב בוגרים מתרחשים על פני תקופות של 1-2 שבועות. טשטוש ההבדלים - מחזור redifferentiation מלווה reexpression של התכנית הגנטית של העובר, ובכך מחקה שינויים פתולוגיים שנצפו בcardiomyopathies אדם 14. יתרון נוסף של שריר לב חולדה בוגר מעל התרבות של שריר לב בילוד הוא יכולת תרבות תאים אלה לפרקי זמן ארוכים.
עכברוש לעומת cardiomyocytes עכבר
יש הבידוד והתרבות של שריר לב בילוד חולדה כמה יתרונות על פני זו של שריר לב בילוד עכבר, כוללים תשואות גבוהות יותר של תאי קיימא ושיעורי transfection מוגברים. עם זאת, השימוש הרחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטי למחלות לב (כגון: </ Em> העכבר בנוקאאוט חלבון Lim השרירים כמודל לcardiomyopathy מורחב 15) הוביל לעיבוד של הליך הבידוד לשריר לב שנלקח מעכברים בילוד. למרות שהפרוטוקולים המשמשים לבודד את שריר לב חולדה ועכבר בילוד הם כמעט זהים, טיפול גדול יותר יש לקחת בבחירת תמהיל אנזים מתאים לאפשרות השנייה. אכן, שריר לב עכבר בילוד הוא בדרך כלל רגיש יותר לoverdigestion, וכתוצאה מכך תא תשואה וכדאיות מופחתים. יתר על כן, צפיפות ציפוי צריכה להיות מותאמת, כי שריר לב שנלקח מעכברי יילודים הם מעט קטן יותר בהשוואה לתאי שמקורם בלב חולדה בילוד.
עם שימושים רבים לחקירה של פרמטרים מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי ויומכנית, כמו גם לתהליך של myofibrillogenesis, שריר לב בילוד בתרבית הפכו לאחד המערכות המגוונות ביותר ללימודפונקציות תא לב במבחנה. הצעד הראשון לassay מוצלח לעומת זאת, תלוי במתודולוגיה קלה ואמינה לבודד את שריר לב עכבר בילוד. הפרוטוקול שלנו שואב את המתודולוגיה שלה ממקורות רבים והיה מותאם לשחזור וחוסן. אנו דנים בגורמים המשפיעים על cardiomyocyte תשואה וכדאיות, ולספק מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך הבא מתאר 16,17 פרוטוקול בן יומיים לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. כל הפתרונות עקרים או עקרים מסונן. כל הכלים הם מעוקרים על ידי עיקור משטח עם 75% אתנול. פרט למיצוי הרקמה הראשוני, כל הצעדים שבוצעו במכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית סטרילי. פרוטוקול זה מיועד לבידוד של לב עכבר בילוד מהמלטה אחת ושתיים (ים) - כ 5-14 גורים, אך הוא עשוי להיות מותאם לגדלי המלטה גדולים ושריר לב בילוד חולדה. שימוש במדיה בקנה מידה / אנזים כמתאים.
לעבודה עם מכרסמים בילוד, עיינו בהנחיות המקומיות שלך באוניברסיטה וכללים שנקבעו על ידי המחוקק ו / או תוכניות טיפול בבעלי חיים, ולדבוק בפרוטוקול שאושר על בעלי החיים המוסדי שלך. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC), ולדבוק fedeתקנות RAL ומדינה.
יום 1.
1. בידוד של רקמת לב מעכברי ילודים
- הכן 50 מיליליטר של 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) בתוספת 20 מ"מ BDM 6-8, ולפזר לשתי מנות חיידקי סטרילי מונחות על קרח.
- הכן 10 מיליליטר של מדיום בידוד ב50 מיליליטר צינור פלקון חרוטי סטרילי. שמור את כל הפתרונות על קרח. לעקר מספריים (אחד מעוגל; ישרה אחד), ומלקחיים (מעוגלים, דומון מס '7).
- עכברים בילוד בן 1-3 ימים הם שטופים במהירות ב75% אתנול פתרון לעיקור פני השטח. גורים הם ערופים באמצעות מספריים סטרילי (ישר), והחזה נפתח לאורך עצם החזה כדי לאפשר גישה לבית החזה והלב (איור 1 א, משלימה הסרט S1).
תגובה טכנית: ניתן להשתמש בעכברים יילודים יותר מ 3 ימים, אבל לגרום לתאי קיימא פחות 2. - לבבות המחולציםהגוף עם מספריים מעוגלים והועבר מייד לצלחת המכילה חיידקי 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ"מ BDM, על קרח. כל הצעדים הבאים מבוצעים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים.
- הסרה של רקמת ריאה, כלי גדול יותר (ואטרייה, אם רוצה). לבבות לשטוף בפתרון 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ"מ BDM (על קרח) כדי להסיר דם. העברה שטפה את לב מהמנה ראשונה למנה השנייה בקטריאלי המכילה 1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) עם 20 מ"מ BDM (על קרח) באמצעות מלקחיים או כף מחוררת (איור 1).
- העברה ניקתה / שטף את לב לירידה של מדיום בידוד (כ 250 μl; איור 1 ג) בצלחת שלישית בקטריאלי (על קרח) ולהשתמש במספריים מעוגלים לברר בלבם לחתיכות (כ 0.5-1 מ"מ 3, או קטנים יותר קטנות; איור 1D, 1E).
- העבר את הלבבות טחונים לתוך חרוטיצינור המכיל 10 מיליליטר של מדיום הבידוד (על קרח), ודגירה עם תסיסה עדינה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
יום 2.
2. רקמות אנזימתי עיכול וציפוי של תאים
- לשקול ב15 מ"ג של תערובת collagenase / dispase (Roche), ולפזר את תערובת האנזים ב10 מיליליטר 5 L15-המדיום השלימו עם 20 מ"מ BDM (בינוני עיכול). סינון סטרילי בינוני העיכול במכסת מנוע תרבית תאים לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר פלקון.
- להכין מדיום 30 מיליליטר L-15 תוספת 20 מ"מ BDM, ובינוני ציפוי.
- צלחות מעיל תרבית תאים עם פתרון קולגן (Sigma C-8919) למינימום של 1 שעה. הסר פתרון קולגן (ניתן לעשות שימוש חוזר) ומנות תרבית תאי קולגן מצופים יבשות במכסת מנוע תרבית תאי זרימה למינרית סטרילי.
- הסר את צינור חרוטי המכיל לבבות המעוכלים מראש מ4 ° C. יש מצטברים שברי רקמה (איור 1G). בואו שברי הרקמה לשקועהחלק התחתון של הצינור ולהסיר את supernatant (לוודא שלא יאבדו את כל שברי רקמה;. בדרך כלל, כ 1 מיליליטר של מדיום הבידוד עשוי להישאר בצינור). הוסף 5 מיליליטר של מדיום עיכול ו5 מיליליטר של L-15 תוספת 20 מ"מ BDM לברי רקמה והשעית חמצן באמצעות חמצן או אוויר דקות 1.
- העבר את צינור חרוטי החתום המכיל שברי רקמת לב במדיום עיכול ל37 ° C אמבט מים למשך כ -2 דקות כדי להתאים את הטמפרטורה של פתרון העיכול.
- דגירה שברי רקמת לב על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה של 20-30 דקות (לדוגמא שייקר על 37 מעלות צלזיוס, מוגדר לא יותר מ60rpm). זמני עיכול עשויים להיות תלויים במידה רבה על תערובת אנזים ומספר הרבה זהירות:. תקופות דגירה ארוכות יותר או ריכוזי אנזים גבוהים יותר עשויות להפחית את כדאיות תא.
תגובה טכנית: אנו ממליצים שימוש בתערובת collagenase / dispase מרוש (Cat.No.: 102,69638001) שיש לו מעט מאוד שונות הרבה להרבה. האנזים הקלאסי לבידוד של שריר לב עכבר הוא טריפסין ו / או סוג collagenase השני 3,16-20 זמין וורטינגטון (חתול לא CLS-2). עם זאת, ביצועים של collagenase השני עשויים להיות שונים באופן מהותי מהרבה להרבה. וורטינגטון מאפשר בדרך כלל לבדיקה של כמה הרבה collagenase כדי לייעל את זמני עיכול ואנזים שימוש. לחלופין, וורטינגטון מוכר ערכת בידוד cardiomyocyte בתערובת אנזים נבדקה מראש כלל שיכול להיות מותאם לבידוד של cardiomyocytes עכבר (מס 'חתול: NCIS) 17.
- הנח תא מסננת סטרילי (40-100 רשת ניילון מיקרומטר) ב50 מיליליטר סטרילי הטרי צינור בז חרוטי. מסננת תא טרום רטובה עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ"מ BDM. שברי רקמת העדינות triturate באמצעות פיפטה תרבית תאי 10 מיליליטר רטוב מראש במשך כ 10-20 פעמים. שברי הרקמה צריכים בעיקר לפזר במהלך שלב זה, משחררים את התאים לתוך suspension (איור 1H).
- בואו שברי רקמה גדולים יותר משקעים וsupernatant העברה המכיל תאים מושעים לתוך צינור חרוטי טרי דרך תא מסננת (איור 1I).
- Re-להשעות את שברי רקמות מעוכלים ב5 בינוני עיכול מיליליטר ו דגירה של 5-10 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- לאחר עיכול מתמשך של שברי רקמה שנותרו, בעדינות triturate רקמות ל10-20 פעמים ולהוסיף לתאי צינור המכיל חרוטי מלעכל הראשון דרך מסננת תא. יש לשטוף את תא מסננת עם 5 L-15 מיליליטר בתוספת 20 מ"מ BDM כדי לאפשר מעבר של כל התאים מתעכלים.
- צינור חרוטי Centrifugate המכיל שריר לב על תנאים למשך 5 דקות ב300 סל"ד (כ XG 50-100). הסר את supernatant (המכיל בעיקר fibroblasts ותאי האנדותל) ותא גלולה מחדש להשעות ב10 מיליליטר ציפוי בינוני.
- פלייט תאים ל10 צלחת תא סנטימטר התרבות (איור 2 א) ו דגירה של 1שעה -3 בחממת תרבות תא. צעד לפני ציפוי זה מסיר fibroblasts ותאי אנדותל (איור 2), שידבק לצלחת ללא ציפוי תרבית תאים (איור 2 ג).
- לאחר דגירה, לשטוף את שריר לב שאינו חסיד מ10 צלחת תרבות סנטימטר (תאים מחדש להשעות ידי pipetting בינוני ציפוי מעל הצלחת שוב ושוב), ותאי resuspended להעביר צינור סטרילי חרוטי צנטריפוגות פלקון (15 מיליליטר או 50 מיליליטר).
אופציונאלי: חזור על השלב טרום ציפוי להסיר fibroblasts נוסף מתא השעיה. אם תרצה, תאי פיברובלסטים ואנדותל חסיד יכולים להיות מתורבתים יותר. - ספירת תאים (למשל על ידי השימוש בhemocytometer נויבאואר, trypan הדרה כחולה מכתימה 21).
- פלייט תאים לתוך צלחות תרבית תאי קולגן מצופה בצפיפות של כ 1.5 x 10 5 תאים לכל 2 סנטימטר (איור 2 ד, וראה גם הערות בטבלה 1 בציפויוציפוי).
הנח כלים בתרבית תאי חממה ולהשאיר באין מפריע במשך 12-18 שעה כדי לאפשר לדבקות והפצה של שריר לב.
יום 3 - תרבות של שריר לב בילוד
- להכין מדיום תחזוקה וprewarm ב37 אמבט מים C °. עיין בטבלת 1 לתוספת של מעכבי התפשטות או סוכני chronotropic, או הליך transfection liposomal של cardiomyocytes עכבר בילוד.
- יום אחד לאחר ציפוי, שריר לב צריך דבק בצלחת תרבית תאים בצורה אופטימלית ולהתחיל באופן ספונטני לחוזה (איור 2E, 2F; משלימה הסרט S2; עיין בטבלה 2 לבעיות נפוצות במהלך הליך בידוד / התרבות). החלפת ציפוי בינוני עם בינוני תחזוקה, ותרבות ל1-5 ימים נוספים. שנה בינונית במידת צורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבודדים לבבות מ8 עכברי יום אחד ישן בילוד (איורים 1 א, 1 ב ', משלים הסרט S1). לאחר הכביסה וקוצץ את הלבבות עם מספריים (איורים 1C-1F), שברי רקמה היו מעוכלים מראש במדיום בידוד במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. בעקבות predigestion (איור 1G), שהעברנו את שברי הרקמה לתוך מדיום עיכול טרי, וטופחו ברי רקמה עבור 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. ההשעיה וכתוצאה מכך התא (איור 1H) הייתה מסוננת דרך מסננת תא (איור 1G). בעקבות צנטריפוגה, תאי pelleted היו resuspended ב8 מיליליטר ציפוי בינוני וpreplated לתוך צלחת תא 10 סנטימטר תרבות (איור 2 א), ותרבית למשך 2 שעות, כדי לאפשר התקשרות של fibroblasts לב ותאי אנדותל (2B דמויות, 2C). תאים שמהירות לא ייחס היו מחדשהושעה לתוך מדיום ציפוי. 10 μl של ההשעיה התא המכילה שריר לב היה pipetteted לתוך צינור Eppendorf ומוכתם עם פתרון trypan כחול ביחס של 1:1. תאים נספרו באמצעות מונה תא אוטומטי, וכתוצאה מכך כ 5.1 x 10 5 תאי חיים / מיליליטר ציפוי בינוני. לאחר ספירה, תאים היו מצופים לארבע מנות 30 מ"מ מצופה קולגן תרבית תאים (2 מיליליטר למנה), וכתוצאה מכך כ 1 x 10 6 תאים מצופים לכל צלחת (1.4 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר; איור 2 ד). 18 שעות לאחר ציפוי, שריר לב היו מחובר לתרבות מנות תא קולגן המצופה (עם confluency כ 70%) והתחיל להתכווץ באופן ספונטני (איור 2E, משלימה הסרט S2). כתוצאה מכך, שריר לב שימשו גם עבור transfection liposomal (ראה טבלה 1) או התאים הועברו ישירות מהציפוי לתוך מדיום התחזוקה (איור 2F) ותרבית לעוד 3 ימים. בעקבות התרבות, cardiomyocytes נשטף בקצרה ב1x PBS, קבוע במשך 5 דקות ב 4% PFA / PBS ומעובד לimmunofluorescence כפי שמתואר באחד מהפרסומים האחרונים שלנו 22. נציג תוצאות המתארות תרבויות cardiomyocyte untransfected וtransfected immunologically מוכתמות מוצגות איורים 2G ו 2H, בהתאמה. שריר הלב בילוד התרבותי להציג את cytoarchitecture הצפוי, כפי שעולה ההדמיה של myofibrils (האות אדומה באיור 2G) ומבני intercalated כמו דיסק (אות ירוקה באיור 2G). הם גם הנתונים לtransfections החולף, כפי שניתן לראות באיור 2H (אות ירוקה היא חלבון transfected; counterstaining אות אדומה של myofibrils באמצעות נוגדן actinin אלפא sarcomeric).
"עבור: src =" "/> /" = src "/ files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg
לבבות איור 1. בידוד של רקמת לב מעכברי יילודים.) הלב הוא הסיר בזהירות מבית החזה באמצעות מלקחיים מעוקלים (ראה גם משלים הסרט S1). B) מבודדים מ8 ילודים נשטפים ב1x PBS (ללא Ca 2 +, Mg 2 +) בתוספת 20 מ"מ BDM על קרח. C) לבבות מועברים לירידה של מדיום בידוד. DE) ממינסינג לב בילוד באמצעות מספריים מעוגלים העברה. F) של רקמת לב טחון באמצעות פיפטה רטוב מראש. G) רקמת לב מעוכלת מראש לאחר דגירה על הלילה ב 4 ° C. H) cardiomyocytes בהשעיה לאחר 20 דקות של עיכול וטחינה דק. רקמת לב מעוכלת מצטברת בחלק התחתון של צינור. אני) ההשעיה של ג המבודדardiomyocytes מסונן דרך מסננת תא.
איור 2. תרבות של שריר לב עכבר בילוד ותמונות immunofluorescence נציג.) ציפוי של תאים מבודדים בתחילת שלב. ב 'טרום ציפוי) fibroblasts לב ותאי אנדותל להתחיל לדבוק בצלחת תרבית התאים ללא ציפוי אחרי 1-3 שעות של התרבות במהלך שלב. C טרום ציפוי) לאחר resuspension של שריר לב שאינו חסיד, fibroblasts לב שנותר ותאי האנדותל יכולים להיות מתורבתים יותר, אם תרצה בכך. ד ') ציפוי של שריר לב עכבר בילוד מבודד ומטוהר במנות תרבית תאי קולגן מצופים . E) לאחר 18 שעות בתרבות, שריר לב לדבוק ד המצופהishes, וצורה אופטימלית להתחיל התכווצויות ספונטניות (ראה גם סרט משלימה S2). F) החלפת מדיום ציפוי עם מדיום תחזוקה מסיר תאים מתים מהתרבות. תמונת immunofluorescence נציג)-F) Scalebar 0.2 מ"מ. G) של שריר לב עכבר בילוד, מוכתם נוגדנים נגד myomesin (התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק, איווה, B4 myomesin MMAC, באדום) ובטא קטנין (Sigma, קט ', לא .: C2206, בירוק). Scalebar 10 מיקרומטר. H) תמונת immunofluorescence נציג של שריר לב עכבר בילוד transfected עם החלבון לידי ביטוי ה-GFP-tagged בירוק (שבר ה-GFP-titin-N2B), ואלפא actinin (Sigma, קט '-No.A-7811) באדום . Scalebar 20 מיקרומטר. ניתן למצוא שיטה לtransfection ומכתים חיסוניים בשימוש ב2G) ו2H) בטבלה המס '1, והוא סיכם באחד מהפרסומים האחרונים שלנו 22.
משלימה הסרט S1. משלימה הסרט S2. לחץ כאן לצפייה בסרט משלים. טבלת 1. אופטימיזציה של תנאי ציפוי והתרבות, transfection liposomal. טבלה 2. פתרון בעיות. גורמים רבים יכולים להשפיע על הבידוד והתרבות המוצלחים של תא ראשוניs. נא להתייעץ מדריכים כמו "תרבות של תאים של בעלי החיים" על ידי איאן Freshney 21, כהקדמות כלליות לתרבות טכניקות תא בסיסיות. סיבות אפשריות לבעיות בprocedur הבידוד והתרבות של cardiomocytes עכבר בילוד שאנחנו נתקלנו לרוב מופיעות בטבלה זו. טרום ציפוי טרום ציפוי של תאים לאחר בידוד מאוד מסיר fibroblasts לב ותאי אנדותל מתערובת כל התא. צעד לפני ציפוי יחיד מסיר כ 50-80% מהלא שריר לב מתאי האוכלוסייה. חזרה של טרום ציפוי יותר מפעמיים, כמו גם פעמים לפני ציפוי יותר מ 3 שעות אינה מומלצת, בשל אובדן נוסף של myocytes לב. החלפה של טרום ציפוי עם Percoll-שיפוע 23,24 עשוי לשפר את הטוהר של אוכלוסיית תא cardiomyocyte. מצע ציפוי ותרבית תאים ציפוי של מנות תרבית תאים עם האקסמטריקס tracellular רכיבים (ECM) כמו קולגן, פיברונקטין, laminin, תערובות מורכבות ECM (כלומר matrigel 25,26) או מצעים מלאכותיים (פולימר כלומר סיליקון 27, organosilane 28) השפעה חיובית על דבקות cardiomyocyte, כדאיות תא ותא מתפשט במהלך שלב ציפוי הראשוני ולתקופה של התרבות שלאחר מכן. במיוחד את התרבות של שריר לב על מצעי זכוכית דורשת ציפוי של פני השטח עם רכיבי ECM כדי להשיג דבקות תקינה של שריר לב.
בדקנו ציפוי של מצעי פלסטיק וזכוכית טופלו תרבית תאים עם מגוון רחב של רכיבי ECM, כולל 0.1% פתרון קולגן (Sigma C-8919), סוג 3 מ"ג / מיליליטר פתרון קולגן 1 (מתקדם Biomatrix, PureCol), 1% פתרון ג'לטין ( סיגמא G9391; מומס בH 2 O, autoclaved), פתרונות laminin (Sigma L4544), או תערובות ECM מורכבות הנגזרות מלב חזיר 29 או fibroblasts לב 30. cultu תאמחדש מנות הודגרו עם פתרונות ECM למינימום של 1 שעות ליותר מ הלילה בחממת תרבית תאים, ולאחר הסרת ECM היבש במכסת מנוע תרבית תאי הזרימה למינרית. פתרונות ECM ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות (10-20 פעמים) אם סטריליות ויושרה חלבון ECM בעת האחסון ממושכת נשמר (לדוגמא אחסון על 4 מעלות צלזיוס או קפואה). זהירות, בשל אופי חומצי של חלק מהמאגרים משמשים להמסת חלבוני ECM, שטיפת הכלים תרבות עם 1x PBS לאחר הציפוי עשויה להידרש לפני ציפוי של התאים. ציפוי טכניקה וצפיפות בהתאם למבחנים שלאחר מכן, ריכוזי תא אופטימליים עבור ציפוי צריכים לגרום monolayers cardiomyocyte הקרוב ומחוברות. ציפוי של שריר לב בריכוזים גבוהים לגרום לאגרגטים cardiomyocyte רב שכבתיים והומוגניות נמוכה, ואילו ריכוזים נמוכים מקטין את כדאיויות תא ותוצאות בשריר לב בודד, מבודד נטולות אנשי הקשר תאי תאים מיוחדיםts (מבנים דמויי דיסק intercalated). כאשר pipetting תאים לציפוי לזכור כי שריר לב הוא די גדול וכבדים, ונוטה להתרכז בחלק התחתון של הצינור הבז. Resuspension של תאים בין צעדי ציפוי מבטיח חלוקה שווה של תאים בכל הכלים שלך. כאשר תאי ציפוי להעביר מנות בצורה של דמות "8", כדי למנוע ריכוז של התאים למרכז הצלחת. Confluency האופטימלי של שריר לב בילוד המיועד לtransfection liposomal צריך להיות בסביבות 70-80% היום לאחר ציפוי. נסיוב השימוש בתרבית תאים שנבדק בעובר (או שזה עתה נולד) בסרום שור וסוס בסרום במדיום ציפוי הוא הכרחי לכדאיויות תא ודבקות של שריר לב במהלך שלב ציפוי. האיכות של הסרום המשמש עשויה להיות אחד השלבים הקריטיים במהלך הליך ציפוי / התרבות. תוספת של מדיום התחזוקה עם כמויות נמוכות של סרום היא אופציונלית, אך ייתכן מאוד improיש משך זמן תרבות.
זהירות: התוספת של סרום עשויה לשנות באופן משמעותי את מסלולי איתות ביוכימי בשריר לב בתרבית ועלולה להישפט ביחס לפרמטרים ניסיוניים, השערה ופרשנות מאוחרת יותר של התוצאות. תרבויות ללא סרום של cardiomyocytes תוארו 10,31, ועלולות למנוע הטיה של תוצאות בשל גורמי גדילה ידועים נוכחים בסרום. מעכבי התפשטות שריר לב הבדיל סופני בדרך כלל אינו עובר תא חלוקה. עם זאת, התוספת של מעכבי התפשטות, כגון 10 מיקרומטר Arac (ציטוזין-BD-arabino-furanoside hydrochloride; Sigma C6645) למדיום התחזוקה מומלצת מאוד כדי למנוע התפשטות של פיברובלסטים לב ותאי האנדותל. אפילו עם התוספת של שלבים טרום ציפוי כדי להפחית את האוכלוסייה של fibroblasts לב ותאי אנדותל, fibroblasts הנותר יעבור proli תאferation ולשנות באופן משמעותי את התאים בתרבית האוכלוסייה לאורך זמן.
זהירות: תלוי בגורמים גנטיים ונקודת זמן הבידוד, ייתכן שעדיין יש cardiomyocytes עכבר עוברי והילוד 23,32,33 פוטנציאל התפשטות. שימוש בArac צריך להישפט בהתאם לפרמטרים ניסיוניים, השערה ופרשנות של תוצאות. תוספת של סוכני chronotropic תוספת של מדיום התחזוקה עם סוכנים 34, כגון phenylephrine (0.1 מ"מ, מעדיף לשריר לב עכברוש בילוד; Sigma P6126), או isoproterenol (1 מיקרומטר, מעדיף לשריר לב עכבר בילוד; Sigma I6501) מגדילה מאוד sarcomerogenesis, הפצה של שריר לב על צלחת כמו גם מכות ספונטניות של תאים. עם זאת, התוספת של סוכנים אלה צריכה להישקל ביחס לפרמטרי assay רצויים (למשל בנוסף עשוי להטות התנהגות התכווצות ופרמטרים ביוכימיים). Transfection transfection liposomal של ה-DNA / RNA לשריר לב עכבר בילוד הוא תלוי במידה רבה בזמן נקודת transfection, מגיב transfection, צפיפות התרבות, ריכוז ה-DNA / RNA וה-DNA המבנה בשימוש. בדקנו מגוון של חומרים כימיים transfection liposomal ומצאתי ESCORT III (Sigma) וlipofectamine 2000 (Invitrogen) ישים. Transfect תאים 24 שעות לאחר ציפוי על ידי החלפת שעה בינונית 2 ציפוי לפני transfection עם אנטיביוטיקה בינונית תחזוקה חינם. עבור transfection של שריר לב בילוד בתרבית 30 מנות מ"מ, לערבב 1-2 DNA מיקרוגרם עם 200 DMEM μl בצינור Eppendorf סטרילי, ולהוסיף 4 μl של ליווי III לתערובת ה-DNA בדילול מלא. לערבב בעדינות ודגירה למינימום של 5 דקות בשכונה סטרילי כדי לאפשר היווצרות מורכבת DNA / יפוזום. החלף את מדיום תחזוקת אנטיביוטיקה חינם עם 800 אנטיביוטיקה ללא μl טרי בינוני תחזוקה ולהוסיף תערובת ה-DNA / יפוזום לתאים. דגירה תאים בתא מ"קחממה וlture להחליף עם מדיום תחזוקה סטנדרטי טרי לאחר 24 שעות. תוצאת נציג לשריר לב עכבר בילוד transfected בהצלחה מוצגת באיור 2 ח. Transfection באמצעות משקעים סידן של ה-DNA הוא גם אפשרי. Transfection של שריר לב עכבר בילוד הוא קשה יותר בהשוואה לשריר לב עכברוש בילוד, עם יעילות transfection טיפוסית נעה 1-20%. וקטורים ויראליים נדרשים על מנת להשיג יעילות גבוהה יותר 35-37 (לדוגמא: adenovirus, וירוס adeno קשור, lentivirus). Electroporation של שריר לב בילוד הוא בידיים שלנו אינן מתאימות למשלוח של ה-DNA / RNA, לעומת זאת כמה דיווחים להראות הצלחה באמצעות electroporation של שריר לב עוברי וילוד 38,39. במאמר שפורסם לאחרונה 38, Djurovic et al. לסכם מספר שיטות transfection, שיעורי הצלחה, כמו גם יתרונות והחסרונות שלהם. הקפאת Passaging / סטוזעם Passaging של שריר לב אינו מומלץ 1. הקפאה של שריר לב בילוד מבודד לאחסון ממושך היא קשה מאוד ואינה מומלץ בשל יעילות נמוכה ושיעורי החלמה נמוכים. מספר חברות מציעות מדיום הקפאה מיוחד לתרבויות אנושיות cardiomyocyte העיקריים (למשל celprogen, חתול. לא. M36044-15FM) שיכול להיות גם מתאים לשימור בהקפאה של cardiomyocytes עכבר בילוד, לעומת זאת תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים. Passaging והשימור בהקפאה המוצלח של שריר לב פרוזדורים תוארו במודל של עכברים הטרנסגניים 32. לא תאי קיימא או חסיד יום 1 לאחר ציפוי - להפחית את ריכוז אנזים ו / או זמן עיכול
- תערובת אנזים שינוי
- צ'הסרום nge לציפוי בינוני
- בינוני שינוי ECM / ציפוי ו / או סוג של מנות תרבית תאים
- להוסיף 20 מ"מ BDM לתקשורת בידוד / עיכול
- לבדוק אם יש זיהום של תאים תשואת תא נמוכה - להגדיל את זמן עיכול ו / או ריכוז אנזים
- זמן צנטריפוגה העלייה / מהירות במהלך הליך בידוד
- תקופת טחינה דקה עלייה Confluency של תאים בתרבית הוא נמוך מדי / גבוה; ציפוי אחיד - לספור תאים במהלך הליך בידוד ולהתאים את מספר תאים / צלחת בציפוי
- להתאים את ריכוז ציפוי
- Resuspend תא גלולה בזהירות לאחר צנטריפוגה ולפני ציפוי על ידי pipetting חוזר ונשנה (יום 2 שלב 13), לוודא שאף תא גושים גלויים יישארו לא תאים פועמים - להוסיף סוכני chronotropic עד בינוני תחזוקה (לדוגמא: phenylephrine, isoproterenol)
- להחליף בינוני
- Chאק למספר גבוה של fibroblasts לב / תאי האנדותל מספר גבוה של fibroblasts - להוסיף צעד preplating נוסף במהלך הליך בידוד
- להוסיף מעכב התפשטות למדיום תחזוקה (טבלה 1) תאים מתים רבים - להחליף את מדיום תרבית תאים
- להפחית את ריכוז אנזים ו / או זמן עיכול במהלך הליך בידוד
- חממת תרבות המחאת תא (CO 2, טמפרטורה, לחות)
- לבדוק אם יש זיהום נגיעות - לדבוק בתנאי עבודה תרבית תאים סטריליים 21
- להחליף בינוני, השתמש בפתרון פניצילין / סטרפטומיצין החדש
- משטח לעקר עכברי יילודים עם 75% פתרון אתנול
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחלות לב הפך סטנדרטיים במחקר לב וכלי דם. אפיון ביוכימי קרוב יותר של מודלים אלה (כלומר, לומדים את תגובות ישירות של תאי לב לגירויים ביוכימי או ביומכנית) בדרך כלל דורש הבידוד של רקמות לב או שריר לב. מחקרים חוקרים תגובות פיסיולוגיות של הלב לשעבר vivo (למשל לאצטילכולין 40, או בתרחישי איסכמיה reperfusion 41) בדרך כלל לנצל את הלבבות-perfused Langendorff כל 42,43, בעוד תרבויות explant 44,45 של שברי רקמת לב מאפשרים לחקירות של שריר לב ב סביבת רקמה תלת ממדית. עם זאת, culturing רקמות explant עלול לעכב דיפוזיה של חומרים מזינים, פוטנציאל יצירת אשכול נמקים בתוך הליבה של הרקמה. יתר על כן, שריר לב הוא ללא תנועה בתוך הרקמה, ולכן הגירה של תאים מexplants היא obse בלבדrved עבור מים שאינו שריר לב, כמו fibroblasts או תאי לב המשוערת 44. חוקר את התפתחותי, תא ביולוגי, ביוכימיות וbiophysical ההתנהגות של שריר לב ולכן נדרש הקמת הבידוד ונהלי culturing. פרוטוקולים מוקדם לבידוד והתרבות של שריר לב של יונקים לנצל חולדות ילודים 1,2. עם זאת, עלייתו של העכבר כמערכת מודל למחקרים גנטיים (כלומר מהונדס גנטית עקום או עקום החוצה עכברים) חייבה ההתאמה של הבידוד הוקם ומתודולוגיות culturing. למרבה הצער, את הבידוד של שריר לב עכבר בילוד הוא מאתגר במיוחד לעומת זה של שריר לב עכברוש בילוד בשימוש יותר באופן מסורתי. הפרוטוקול המובא מתאר שיטה אמינה וחזקה מותאמת במיוחד לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מתארים את הצעדים הדרושים להפקת רקמות ראשונית, לניתוקnd טיהור של שריר לב מfibroblasts לב ותאי אנדותל, ולתנאי ציפוי והתרבות. בעוד שהפרוטוקול מציע גישה בסיסית לבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד בתנאים סטנדרטיים, זה יכול להתאים בקלות לבידוד והתרבות של שריר לב עכברוש בילוד, כמו גם עבור סוגי assay הבאים ספציפיים: למשל תרבות של התאים המבודדים על קרום גמיש (לדוגמא: צלחות יופלקס תרבות) לחקור מאפייני יומכנית, תרבות במנות תחתית כוס (MatTek) להדמית תא חי, או תרבות של שריר לב בדואר צלחות אירוביים xCELLigence (אסיאה, רוש, Cat.-No.: 06417051001) כדי לחקור את ההשפעות של תרופות על פונקציות התכווצות. יתר על כן, אנו מציעים אפשרויות לאופטימיזציה של הבידוד והליך התרבות ולדון במקורות לבעיות והפתרונות אפשריים שלהם. לפיכך, פרוטוקול זה צריך לסייע לחוקרים לבחון עד כה, לשעתקו מאוד ושיטה סביר להכנת תרבויות cardiomyocyte העכבר בילוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופ 'אמריטוס ז'אן קלוד Perriard ואוולין Perriard (מכון שוויצרי פדרלי לטכנולוגיה, שוויץ) למבוא לטכניקות בידוד לעכברוש בילוד ושריר לב עכבר. ברצוננו להודות לפרופ 'ג'ו חן ופרופ' סילביה אוונס (UCSD, ארה"ב) על תמיכתם. עבודה במעבדה של EE מומנה על ידי MRC קריירה הקמת גרנט. SL נתמך על ידי מסלול K99/R00 להעניק עצמאות מ-NIH / NHLBI (HL107744). TMM נתמכה על ידי מלגה הבתר מאיגוד הלב האמריקאי (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
