Summary
Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.
Abstract
Cardiomiociti neonatali in coltura sono stati a lungo utilizzati per studiare myofibrillogenesis e le funzioni miofibrillari. Cardiomiociti in coltura consentono una facile ricerca e manipolazione di vie biochimiche, e il loro effetto sulle proprietà biomeccaniche di battere spontaneamente cardiomiociti.
Il protocollo 2-giorno seguente descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo. Mostriamo come sezionare facilmente cuore da neonati, dissociare il tessuto cardiaco e arricchire cardiomiociti dalle cellule popolazione cardiaca. Discutiamo l'utilizzo di diversi mix di enzimi per la cella-dissociazione, e dei loro effetti sulla cellula-vitalità. I cardiomiociti isolati possono essere successivamente utilizzati per una varietà di,,, saggi di cellule biologiche o biomeccanica biochimici elettrofisiologici morfologiche. Abbiamo ottimizzato il protocollo per robustezza e riproducibilità, utilizzando solo soluzioni disponibili in commercio e l'enzima mix che shpoca variabilità ow lotto a lotto. Ci rivolgiamo anche a problemi comuni associati con l'isolamento e la coltura di cardiomiociti, e di offrire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.
Introduction
Le prime relazioni per la dissociazione di successo e coltura di cellule cardiache del roditore risale al 1960 1,2. Anche allora, Harary e Farley notato che cardiomiociti in coltura "possono fornire un sistema unico per lo studio dei requisiti della contrattilità periodica [e possono] fornire un mezzo per determinare il contributo dei vari percorsi metabolici per la [battito] processo". Anche se Harary e Farley cardiomiociti isolati e coltivati da giovani ratti, e il protocollo originale è stato adattato e modificato da molti scienziati nel corso degli anni, la procedura generale isolamento e la coltura non è molto cambiata. Tuttavia, enzimi migliori 3, soluzioni standardizzate 4,5, e l'aggiunta del canale reversibile e miosina ATPasi inibitore BDM per proteggere le cellule durante la procedura di isolamento 6-9 è migliorata significativamente cellula-resa e la fattibilità.
Adulto vs cardiomiopatia neonataleciti
Cardiomiociti isolati e coltivati da topi o ratti neonati hanno diversi vantaggi rispetto colture di cardiomiociti adulti. Primo, la procedura di isolamento di topo o ratto cuori neonatali è più semplice e meno costosa, rispetto all'isolamento di cardiomiociti di topo adulto o ratto 10. Cardiomiociti neonatali sono molto meno sensibili alle reintroduzione in un mezzo contenente calcio dopo dissociazione, aumentando notevolmente cella rendimento. Un altro grande vantaggio è che i cardiomiociti neonatali di topo subiscono una più rapida de-differenziazione - ciclo ridifferenziazione che di solito si traduce in modo spontaneo battere cellule 20 ore dopo la placcatura, mentre cardiomiociti adulti in genere richiedono stimolazione per indurre la contrazione. Cardiomiociti neonatali sono anche più facilmente transfectable con i metodi liposomiale trasfezione, considerando che i cardiomiociti adulti necessitano di vettori virali per la consegna di successo di DNA transgenico. In contrasto con cardiomiociti neonatalis, la cultura dei cardiomiociti roditori adulti 11-13 consente di ricerche di degradazione miofibrillare ed eventuale ripristino dell'apparato contrattile. Questi cambiamenti morfologici caratteristici cardiomiociti adulti avvengono su periodi di 1-2 settimane. Il dedifferentiation - ciclo ridifferenziazione è accompagnata da reexpression del programma gene fetale, imitando in tal modo i cambiamenti patologici osservati in cardiomiopatie umani 14. Un altro vantaggio di cardiomiociti di ratto adulto di coltura di cardiomiociti neonatali è la capacità di coltura queste cellule per lunghi periodi di tempo.
Rat vs cardiomiociti di topo
L'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto ha alcuni vantaggi rispetto quella del topo cardiomiociti neonatali, compresi rendimenti più elevati di cellule vitali e un aumento dei tassi di trasfezione. Tuttavia, l'ampio utilizzo di modelli murini geneticamente modificati per le malattie cardiache (es. </ Em> il lim muscolo topo knockout proteine come modello per la cardiomiopatia dilatativa 15) ha portato alla adeguamento della procedura di isolamento di cardiomiociti derivati da topi neonati. Sebbene i protocolli utilizzati per isolare neonatali di ratto e di topo cardiomiociti sono quasi identiche, una maggiore attenzione deve essere posta nella scelta di un mix enzima appropriato per quest'ultimo. Infatti, cardiomiociti neonatali di topo sono generalmente più suscettibili a overdigestion, risultante in una cella rendimento e ridotta vitalità. Inoltre, la densità di placcatura deve essere regolata, perché cardiomiociti derivati da topi neonati sono più piccole rispetto alle cellule derivate da cuori di ratto neonatale.
Con molti usi per le indagini, parametri morfologici, elettrofisiologici, biochimici cellulari-biologica e biomeccanica nonché per il processo di myofibrillogenesis, cardiomiociti neonatali coltivate sono diventati uno dei sistemi più versatili per lo studio difunzioni delle cellule cardiache in vitro. Il primo passo per un saggio di successo però, dipende da una metodologia semplice e affidabile per isolare i cardiomiociti neonatali di topo. Il nostro protocollo trae metodologia da molte fonti e stato ottimizzato per la riproducibilità e robustezza. Discutiamo fattori che influenzano cardiomyocyte rendimento e la redditività, e di fornire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.
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Protocol
La procedura seguente descrive un protocollo 16,17 di due giorni per l'isolamento e la cultura dei cardiomiociti neonatali di topo. Tutte le soluzioni sono sterili o sterili filtrata. Tutti gli strumenti sono sterilizzati mediante sterilizzazione superficie con il 75% di etanolo. Tranne per l'estrazione del tessuto iniziale, tutte le fasi vengono eseguite in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare sterile. Questo protocollo è destinato per l'isolamento di cuori neonatali di topo 1-2 cucciolata (s) - circa 5-14 cuccioli, ma può essere adattato per dimensioni dei cuccioli più grandi e cardiomiociti neonatali di ratto. L'utilizzo di supporti Scala / enzima come appropriato.
Per il lavoro con i roditori neonatali, consultare le linee guida universitari locali e le regole stabilite dal legislatore e / o programmi di cura degli animali, e di aderire al vostro protocollo animali istituzionalmente approvato. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dalla Institutional Animal Care ed uso commissione UC San Diego (IACUC), e di aderire alla fedenormative ral e statali.
Giorno 1.
1. Isolamento di tessuto cardiaco da topi neonati
- Preparare 50 ml di PBS 1x (senza Ca 2 +, Mg 2 +) supplementato con 20 BDM mM 6-8, e disperdere in due piatti sterili batteriche immessi sul ghiaccio.
- Preparare 10 ml di terreno di isolamento in 50 ml sterile tubo Falcon conica. Conservare tutte le soluzioni su ghiaccio. Sterilizzare le forbici (una curva, una retta), e pinze (curve, Dumont No.7).
- 1-3 giorni vecchi topi neonati sono sciacquati rapidamente in una soluzione di etanolo al 75% per la sterilizzazione di superficie. I cuccioli vengono decapitati con forbici sterili (diritti), e il torace si apre lungo lo sterno per consentire l'accesso alla cavità toracica e il cuore (Figura 1A, Supplemental Movie S1).
Commento tecnico: topi neonati di età superiore ai tre giorni possono essere utilizzati, ma comportano un minor numero di cellule vitali 2. - Cuori sono estratti dail corpo con forbici curve e trasferiti immediatamente nel piatto batterica contenente PBS 1x (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM, su ghiaccio. Tutte le fasi sono eseguite nella cappa coltura cellulare sterile.
- Rimuovere il tessuto polmonare, navi più grandi (e atri, se lo si desidera). Lavare cuori nella soluzione 1x PBS (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 BDM mm (su ghiaccio) per rimuovere il sangue. Trasferimento lavato cuori dal primo piatto al secondo piatto batterico contenente 1x PBS (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 BDM mm (su ghiaccio) con pinze o un mestolo forato (Figura 1B).
- Cuori Transfer pulito / lavato in una goccia di terreno di isolamento (circa 250 microlitri; la figura 1C) in un terzo piatto batterica (su ghiaccio) e usare le forbici curve di sminuzzare i cuori in piccoli pezzi (circa 0,5-1 mm 3, o più piccoli; Figura 1D, 1E).
- Trasferire cuori tritati in una conicaprovetta contenente 10 ml di terreno di isolamento (su ghiaccio), e incubare con lieve agitazione a 4 ° C durante la notte.
Day 2.
2. Tissue digestione enzimatica e la placcatura delle cellule
- Pesare 15 mg di collagenasi / dispasi miscela (Roche), e sciogliere la miscela enzimatica in 10 ml L15-medio 5 supplementato con 20 mM BDM (medium digestione). Filtro sterile il mezzo digestione nella cappa coltura cellulare in un nuovo tubo sterile 50 ml Falcon.
- Preparare 30 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM, e media placcatura.
- Piastre Coat coltura cellulare con la soluzione di collagene (Sigma C-8919), per un minimo di 1 ora. Rimuovere la soluzione di collagene (può essere riutilizzato) e collagene rivestito a secco coltura cellulare piatti in cappa coltura cellulare a flusso laminare sterile.
- Rimuovere il tubo conico contenente i cuori predigerito da 4 ° C. Frammenti di tessuto devono essere aggregati (Figura 1G). Lasciate che i frammenti di tessuto si depositanoil fondo del tubo e rimuovere il surnatante (assicurarsi di non perdere i frammenti di tessuto;. normalmente, circa 1 ml di terreno di isolamento possono restare nel tubo). Aggiungere 5 ml di terreno digestione e 5 ml di L-15 supplementato con 20 BDM mM di frammenti di tessuto e le sospensioni ossigenare con ossigeno o aria per 1 min.
- Trasferire il tubo conico sigillata contenente i frammenti di tessuto cardiaco in mezzo digestione a 37 ° C a bagnomaria per circa 2 min per regolare la temperatura della soluzione digestione.
- Incubare frammenti di tessuto cardiaco a 37 ° C con agitazione delicata per 20-30 min (es shaker a 37 ° C, insieme a non più di 60rpm). Tempi di digestione possono dipenderà in gran miscela di enzimi e numero di lotto. Attenzione: periodi di incubazione più lunghi o concentrazioni enzimatiche più elevate possono ridurre la vitalità cellulare.
Commento tecnico: Si consiglia l'utilizzo di una miscela collagenasi / dispasi da Roche (art: 10269638001), che ha ben poca variabilità da lotto a lotto. L'enzima classica per l'isolamento di cardiomiociti di topo è tripsina e / o collagenasi di tipo II 3,16-20 disponibile da Worthington (Cat n CLS-2). Tuttavia, le prestazioni di collagenasi II può differire sostanzialmente da lotto a lotto. Worthington consente in genere per la sperimentazione di diversi lotti di collagenasi per ottimizzare i tempi di digestione e l'enzima utilizzo. In alternativa, Worthington vende un kit di isolamento cardiomiociti con una miscela di enzimi pre-testati inclusi che possono essere adattate per l'isolamento di cardiomiociti di topo 17 (Cat. No.: NCIS).
- Posizionare sterile cell-filtro (40-100 micron maglia di nylon) in freschi sterile 50 ml tubo conico falco. Filtro cella di prelavaggio con 5 ml L-15 supplementato con 20 BDM mm. Frammenti di tessuto delicatamente triturare con un pre-bagnata 10 ml di coltura cellulare pipetta per circa 10-20 volte. I frammenti di tessuto devono principalmente disperdere durante questa fase, rilasciando le cellule in suspension (Figura 1H).
- Lasciate frammenti di tessuto grandi sedimenti e surnatante trasferimento contenente cellule sospese in provetta conica attraverso la cella-filtro (Figura 1I).
- Re-sospendere i frammenti di tessuto non digerito in 5 ml di mezzo la digestione e incubare per altri 5-10 minuti a 37 ° C con agitazione.
- Dopo aver continuato digestione dei restanti frammenti di tessuto, triturare delicatamente il tessuto per 10-20 volte e aggiungere al tubo contenente cellule coniche dal primo digerire attraverso il filtro delle cellule. Risciacquare cellula-filtro con 5 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM per consentire il passaggio di tutte le cellule digerite.
- Provetta conica centrifugato contenente cardiomiociti sospensione per 5 min a 300 rpm (circa 50-100 xg). Rimuovere il surnatante (contenente principalmente fibroblasti e cellule endoteliali) e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di placcatura medie.
- Celle a piastre in cella 10 cm piatto di coltura (Figura 2A) e incubare per 1-3 Ore in cella cultura incubatore. Questa fase di pre-placcatura rimuove fibroblasti e cellule endoteliali (Figura 2B), che aderirà al piatto coltura cellulare non patinata (Figura 2C).
- Dopo l'incubazione, lavare i cardiomiociti non aderenti da 10 cm piatto cultura (ri-sospensione delle cellule pipettando ripetutamente il mezzo placcatura sopra il piatto), e le cellule risospese trasferimento ad una conica provetta Falcon da centrifuga sterile (15 ml o 50 ml).
Facoltativo: Ripetere la fase di pre-plating per rimuovere i fibroblasti supplementari dalla cella-sospensione. Se lo si desidera, le cellule di fibroblasti ed endoteliali aderenti possono essere ulteriormente coltivate. - Contare le celle (ad esempio utilizzando emocitometro Neubauer, trypan esclusione colorazione blu 21).
- Celle a piastre in collagene rivestite piatti di coltura di cellule con una densità di circa 1,5 x 10 5 cellule per cm 2 (Figura 2D; vedi i commenti anche nella tabella 1 sulla placcaturae rivestimento).
Mettere i piatti nella cella cultura incubatore e lasciare indisturbati per 12-18 ore per consentire l'aderenza e la diffusione dei cardiomiociti.
Giorno 3 - Cultura di cardiomiociti neonatali
- Preparare terreno di mantenimento e Preriscaldare a 37 ° C bagnomaria. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'aggiunta di inibitori di proliferazione o agenti cronotropi, o la procedura per la trasfezione liposomiale dei cardiomiociti neonatali di topo.
- Un giorno, dopo la placcatura, cardiomiociti dovrebbero hanno aderito al piatto di coltura cellulare e in modo ottimale inizia spontaneamente a contrarsi (Figura 2E, 2F, lettera Movie S2, vedi Tabella 2 per i problemi più comuni durante la procedura di isolamento / cultura). Sostituire placcatura media con terreno di mantenimento, e la cultura per altri 1-5 giorni. Cambiare mezzo come necessario.
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Representative Results
Usando questo protocollo, abbiamo isolato i cuori da 8 un giorno di età topi neonati (Figure 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Dopo il lavaggio e macinazione i cuori con le forbici (Figure 1C-1F), frammenti di tessuto sono stati predigerito in terreno di isolamento per tutta la notte a 4 ° C con agitazione. Dopo predigestione (Figura 1G), abbiamo trasferito i frammenti di tessuto in mezzo digestione appena fatto, e incubate i frammenti di tessuto per 20 min a 37 ° C con agitazione. La sospensione cellulare risultante (Figura 1H) è stata filtrata attraverso un filtro cella (Figura 1G). Dopo la centrifugazione, le cellule pellet sono stati risospesi in 8 ml di placcatura medio e PRONTI in una piastra di coltura cellulare 10 cm (Figura 2A), e coltivate per 2 ore per consentire fissaggio dei fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali (Figure 2B, 2C). Le cellule che non si attaccano rapidamente erano resospeso nel mezzo di placcatura. 10 ml di sospensione cellulare contenente cardiomiociti creata pipetteted in una provetta eppendorf e colorate con una soluzione di blu tripano in un rapporto 1:1. Le cellule sono state contate utilizzando un contatore automatico di cellule, causando circa 5,1 x 10 5 cellule viventi / ml placcatura mezzo. Dopo il conteggio, le cellule sono state piastrate in quattro 30 millimetri collagene rivestite piatti di coltura cellulare (2 ml per piastra), conseguente circa 1 x 10 6 cellule piastrate per piatto (1,4 x 10 5 cellule / cm 2; Figura 2D). 18 ore dopo la placcatura, cardiomiociti sono state allegate ai collagene rivestito di coltura cellulare piatti (con circa il 70% di confluenza) e ha iniziato a contrarsi spontaneamente (Figura 2E, Supplemental Movie S2). Successivamente, cardiomiociti sono stati utilizzati sia per liposomiale trasfezione (vedere Tabella 1) o le cellule sono state trasferite direttamente dal fasciame nel mezzo di manutenzione (Figura 2F) e coltivate per altri 3 giorni. Seguendo cultura, cardiomiociti stati brevemente lavate in PBS 1x, fissato per 5 min a 4% PFA / PBS e trasformati per immunofluorescenza come descritto in una delle nostre recenti pubblicazioni 22. Risultati rappresentativi raffiguranti immunologicamente macchiati culture cardiomiociti non trasfettate e trasfettate sono mostrati nelle Figure 2G e 2H, rispettivamente. I cardiomiociti neonatali coltivate visualizzare il citoarchitettura previsto, come è evidente dalla visualizzazione delle miofibrille (segnale rosso in figura 2G) e le strutture discoidali intercalate (segnale verde nella figura 2G). Essi sono anche suscettibili di trasfezioni transitorie, come si vede nella Figura 2H (segnale verde è la proteina transfettate; segnale rosso di contrasto di miofibrille, utilizzando un anticorpo actinin alfa-sarcomerica).
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Figura 1. Isolamento del tessuto cardiaco di topi neonati. A) Il cuore viene accuratamente rimosso dal torace con pinze curve (vedi anche la lettera Movie S1). B) cuori isolati da 8 neonati vengono lavati in PBS 1x (senza Ca 2 +, Mg 2 +) integrato con 20 BDM mm su ghiaccio. C) Hearts vengono trasferiti in una goccia di terreno di isolamento. DE) Tritacarne di cuori neonatali con le forbici ricurve. F) Trasferimento del tessuto cardiaco tritato con una pipetta pre-bagnata. G) tessuto cardiaco predigerito dopo incubazione durante la notte a 4 ° C. H) Cardiomyocytes in sospensione dopo 20 min di digestione e triturazione. Tessuto cardiaco non digerito si accumula sul fondo del tubo. I) La sospensione di isolati cardiomyocytes viene filtrata attraverso un filtro cella.
Figura 2. Cultura di cardiomiociti neonatali di topo e immagini di immunofluorescenza rappresentative. A) Placcatura di cellule isolate all'inizio della pre-placcatura passo. B) fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali iniziano ad aderire alla cella piatto di coltura non rivestito dopo 1-3 hr della cultura durante il pre-placcatura passo. C) Dopo la risospensione dei cardiomiociti non aderenti, rimasti fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali possono essere ulteriormente coltivate, se lo si desidera. D) placcatura di isolati e purificati cardiomiociti neonatali di topo in collagene rivestito coltura cellulare piatti . E) Dopo 18 ore di cultura, cardiomiociti aderire al d rivestiterocchie, e in modo ottimale iniziare a contrazioni spontanee (vedere anche film Supplemental S2). F) Sostituzione del mezzo di placcatura con il mezzo di manutenzione rimuove le cellule morte dalla cultura. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) immagine immunofluorescenza Rappresentante di cardiomiociti neonatali di topo, colorate con anticorpi contro myomesin (Developmental Studies Ibridoma Bank, Iowa, MMAC myomesin B4, in rosso) e beta-catenina (Sigma, Cat. N. .: C2206, in verde). Scalebar 10 micron. H) immagine immunofluorescenza Rappresentante di trasfettate cardiomiociti neonatali mouse con la proteina espressa GFP-tagged in verde (GFP-titina-N2B frammento), e alfa-actinina (Sigma, Cat.-No.A-7811) in rosso . Scalebar 20 micron. Procedimento per la trasfezione e colorazione immunologica usato in 2G) e 2H) possono essere trovate nella tabella 1, è riassunta in una delle nostre recenti pubblicazioni 22.
Supplemental Movie S1. Supplemental Movie S2. Clicca qui per visualizzare filmati supplementare . Tabella 1. Ottimizzazione delle condizioni di placcatura e cultura, liposomiale trasfezione. Tabella 2. Risoluzione dei problemi. Molti fattori possono influenzare l'isolamento successo e la cultura di cellule primaries. Si prega di consultare manuali come "cultura di cellule animali" di Ian Freshney 21, come introduzioni generali in tecniche di base di colture cellulari. Possibili cause di problemi in isolamento e la coltura di immissio cardiomocytes neonatali di topo che abbiamo incontrato più spesso sono elencati in questa tabella. Pre-placcatura Pre-placcatura delle cellule dopo l'isolamento rimuove notevolmente fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali dalla miscela cellula intera. Una singola fase di pre-placcatura rimuove circa il 50-80% dei non cardiomiociti dalla cellula-popolazione. Ripetizione di pre-placcatura più di due volte, così come dei tempi pre-placcatura superiori a 3 ore non è raccomandato, a causa della perdita supplementare di miociti cardiaci. Sostituzione di pre-placcatura con Percoll-gradiente 23,24 può migliorare la purezza della popolazione cellulare cardiomiociti. Rivestimento e coltura cellulare substrato Rivestimento di piatti di coltura cellulare con l'exmatrice extracellulare (ECM) componenti come collagene, fibronectina, laminina, miscele ECM complessi (cioè matrigel 25,26) o substrati artificiali (cioè polimero siliconico 27, organosilano 28) influenza positivamente cardiomiociti aderenza, la vitalità cellulare e diffusione delle cellule durante la fase iniziale di placcatura e per il successivo periodo di coltura. In particolare la cultura di cardiomiociti su substrati di vetro richiede il rivestimento della superficie con componenti ECM per ottenere una corretta aderenza dei cardiomiociti.
Abbiamo testato il rivestimento di coltura delle cellule trattate substrati di plastica e di vetro, con una varietà di componenti ECM, tra cui una soluzione allo 0,1% di collagene (Sigma C-8919), tipo 3 mg / ml di collagene soluzione 1 (ottimo Biomatrix, PureCol), soluzione di gelatina 1% ( Sigma G9391, sciolto in H 2 O, autoclave), soluzioni di laminina (Sigma L4544), o miscele ECM complessi derivati dai cuori di suino 29 o fibroblasti cardiaci 30. Cul cellularere i piatti sono stati incubati con le soluzioni ECM per un minimo di 1 ora per tutta la notte in incubatrice coltura cellulare, e dopo la rimozione di ECM secca nella cappa coltura cellulare a flusso laminare. Soluzioni ECM possono essere riutilizzati più volte (10-20 volte) se sterilità e dell'integrità proteine ECM durante lo stoccaggio prolungato viene mantenuta (ad esempio conservazione a 4 ° C o congelati). Attenzione, a causa della natura acida di alcuni dei buffer utilizzati per sciogliere proteine ECM, lavaggio di piatti di coltura con PBS 1x dopo il rivestimento può essere richiesto prima placcatura delle cellule. Tecnica e la densità di placcatura A seconda saggi successivi, la concentrazione cellulare ottimali per placcatura dovrebbero risultare in monostrati cardiomiociti vicino-confluenti. Placcatura dei cardiomiociti ad alte concentrazioni provoca aggregati cardiomiociti multistrato e bassa omogeneità, considerando che basse concentrazioni riduce la vitalità delle cellule e dei risultati in singoli cardiomiociti isolati privi di contat cellula-cellula specializzatats (strutture discoidali intercalate). Quando pipettaggio cellule per la placcatura di tenere a mente che cardiomiociti sono piuttosto grandi e pesanti, e tendono a concentrarsi sul fondo della provetta falco. Risospensione delle cellule tra i passaggi di placcatura garantisce una distribuzione uniforme delle cellule durante i vostri piatti. Quando le cellule placcatura muovono piatti a forma di una figura "8" per evitare la concentrazione delle cellule al centro del piatto. La confluenza ottimale di cardiomiociti neonatali designato liposomiale trasfezione dovrebbe essere intorno al 70-80% il giorno dopo la placcatura. Siero L'uso di coltura cellulare testato fetale (o neonato) siero bovino e siero di cavallo nel mezzo placcatura è necessaria per la vitalità cellulare e l'adesione dei cardiomiociti durante la fase di placcatura. La qualità del siero può essere utilizzato uno dei passi critici durante il processo di rivestimento / cultura. Integrazione del terreno di mantenimento con basse quantità di siero è facoltativa, tuttavia può notevolmente Improve durata del tempo di coltura.
Attenzione: l'aggiunta di siero può alterare significativamente vie di segnalazione biochimica in cardiomiociti in coltura e può essere giudicato rispetto ai parametri sperimentali, ipotesi e la successiva interpretazione dei risultati. Culture privo di siero di cardiomiociti sono stati descritti 10,31, e possono impedire la distorsione dei risultati a causa di fattori di crescita sconosciuti presenti nel siero. Inibitori Proliferazione Cardiomiociti terminalmente differenziate in genere non subiscono divisione cellulare. Tuttavia, l'aggiunta di inibitori della proliferazione, come 10 pM AraC (citosina-BD-arabino-furanoside cloridrato; Sigma C6645) al mezzo di manutenzione è altamente raccomandato per prevenire la proliferazione di fibroblasti cardiaca e cellule endoteliali. Anche con l'aggiunta di fasi di pre-placcatura per ridurre la popolazione di fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali, i fibroblasti rimanenti saranno sottoposti proli cellulariliferazione e cambiare significativamente la cella popolazione coltivate nel tempo.
Attenzione: a seconda di fattori genetici e il time-point isolamento, cardiomiociti embrionali e neonatali di topo possono ancora avere la proliferazione potenziale 23,32,33. Uso di AraC dovrebbe essere giudicata a seconda dei parametri sperimentali, ipotesi e interpretazione dei risultati. Aggiunta di agenti cronotropi Integrazione del terreno di mantenimento con agenti 34, come fenilefrina (0,1 mm, preferenzialmente per cardiomiociti neonatali di ratto; Sigma P6126), o isoproterenolo (1 micron, preferenzialmente per cardiomiociti neonatali di topo; Sigma I6501) aumenta notevolmente sarcomerogenesis, diffusione di cardiomiociti sul piastra nonché battito spontanea delle cellule. Tuttavia, l'aggiunta di questi farmaci deve essere pesato rispetto ai parametri di dosaggio desiderato (ad esempio aggiunta può inclinare comportamento contrattile e parametri biochimici). Transfezione Liposomiale trasfezione di DNA / RNA in cardiomiociti neonatali di topo è fortemente dipendente dal tempo-point transfezione, reagente di trasfezione, densità cultura, la concentrazione di DNA / RNA e costrutto di DNA utilizzati. Abbiamo testato una varietà di reagenti di trasfezione liposomiali e abbiamo trovato ESCORT III (Sigma) e lipofectamina 2000 (Invitrogen) applicabile. Trasfettare cellule 24 ore dopo la placcatura sostituendo la placcatura mezzo 2 ore prima della trasfezione con antibiotici medio manutenzione. Per la trasfezione di cardiomiociti neonatali coltivato in 30 millimetri piatti, mescolare 1-2 mg DNA con 200 microlitri DMEM in un tubo eppendorf sterile e aggiungere 4 ml di Escort III alla miscela di DNA diluito. Mescolare delicatamente e incubare per un minimo di 5 min nella cappa sterile per consentire DNA / liposomi formazione del complesso. Sostituire il mezzo di manutenzione senza antibiotici con 800 liberi antibiotici-ul freschi terreno di mantenimento e aggiungere la miscela DNA / liposomi alle cellule. Incubare le cellule in cu cellularelture incubatore e sostituirlo con terreno di mantenimento standard di fresco dopo 24 ore. Un risultato rappresentativo per transfettate con successo cardiomiociti neonatali di topo è mostrato in Figura 2H. Trasfezione usando precipitazione di calcio del DNA è anche possibile. La trasfezione di cardiomiociti neonatali di topo è più difficile rispetto a cardiomiociti neonatali di ratto, con efficienze di trasfezione tipici che vanno 1-20%. Vettori virali sono tenuti a conseguire maggiori efficienze 35-37 (es.: adenovirus, virus adeno-associati, lentivirus). Elettroporazione di cardiomiociti neonatali è nelle nostre mani inadatti per la consegna del DNA / RNA, tuttavia più rapporti indicano successo con elettroporazione di cardiomiociti embrionali e neonatali 38,39. In un recente articolo 38, Djurovic et al. Riassumere diversi metodi di trasfezione, i tassi di successo così come i loro vantaggi e svantaggi. Passaging congelamento / Storabbia Passaging dei cardiomiociti non è raccomandato 1. Congelamento di isolati cardiomiociti neonatali per la conservazione prolungata è estremamente difficile e non raccomandabile a causa della bassa efficienza e bassi tassi di recupero. Diverse compagnie offrono medio congelamento specializzato per le culture umane cardiomiociti primari (ad esempio celprogen, cat. N. M36044-15FM) che possono anche essere adatti per la crioconservazione di cardiomiociti neonatali di topo, ma le condizioni possono avere bisogno di essere ottimizzato. Il passaging successo e crioconservazione di cardiomiociti atriali è stata descritta in un modello di topo transgenico 32. Nessun cellule vitali o aderenti 1 giorno dopo la placcatura - Ridurre la concentrazione di enzima e / o tempo di digestione
- Miscela enzimatica cambiamento
- Chasiero ESN per placcatura medio
- A medio e / o tipo di piatti di coltura di cellule cambiamento ECM / rivestimento
- Aggiungere 20 BDM mM di terreni di isolamento / digestione
- Verificare la presenza di contaminazione delle cellule Quantità di cellule Basso - Aumentare il tempo di digestione e / o concentrazione dell'enzima
- Tempo di aumento di centrifugazione / velocità durante la procedura di isolamento
- Periodo di aumento triturazione Confluenza delle cellule in coltura è troppo basso / alto; irregolare placcatura - Contare le celle durante la procedura di isolamento e regolare il numero di cellule / piatto durante la placcatura
- Regolare la concentrazione di placcatura
- Risospendere accuratamente pellet cellulare dopo centrifugazione e prima della placcatura pipettando ripetute (giorno 2 step 13), assicurarsi che non rimangano grumi di cellule-visibili Nessun cellule battendo - Aggiungere agenti cronotropi medio manutenzione (ad esempio: fenilefrina, isoproterenolo)
- Sostituire il mezzo
- ChEck per elevato numero di fibroblasti cardiaci cellule endoteliali / Elevato numero di fibroblasti - Aggiungere ulteriore passo preplating durante la procedura di isolamento
- Aggiungere inibitore della proliferazione di terreno di mantenimento (Tabella 1) Molte cellule morte - Sostituire il mezzo di coltura cellulare
- Ridurre la concentrazione di enzima e / o tempo di digestione durante la procedura di isolamento
- Cell assegno cultura incubatore (CO 2, temperatura, umidità)
- Verificare la presenza di contaminazione Contaminazione - Aderire alla coltura cellulare sterile condizioni di lavoro 21
- Sostituire il mezzo, utilizzare la nuova soluzione di penicillina / streptomicina
- Superficie sterilizzare topi neonati con una soluzione di etanolo al 75%
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Discussion
L'uso di modelli animali per studiare le malattie cardiache è diventato standard nella ricerca cardiovascolare. Caratterizzazione Closer biochimica di questi modelli (ovvero studiando risposte dirette su cellule cardiache a stimoli biochimici e biomeccanici) richiede in genere l'isolamento dei tessuti cardiaci o cardiomiociti. Gli studi che indagano risposte fisiologiche del cuore ex vivo (ad esempio dell'acetilcolina 40, o in scenari ischemia-riperfusione 41) generalmente utilizzano Langendorff-perfusione interi cuori 42,43, mentre le culture espianto 44,45 di frammenti di tessuto cardiaco consentire ricerche di cardiomiociti in un ambiente tridimensionale di tessuto. Tuttavia, la coltura tessuti espianto può ostacolare la diffusione di nutrienti, potenzialmente generando un cluster necrotico all'interno del nucleo del tessuto. Inoltre, cardiomiociti sono immobili all'interno del tessuto, quindi la migrazione di cellule su espianti è solo observed per i non-cardiomiociti, come fibroblasti o presunte cellule progenitrici cardiache 44. Indagare il comportamento delle cellule-biologico, biochimico e biofisico sviluppo dei cardiomiociti richiesto pertanto l'istituzione di isolamento e procedure di coltura. I primi protocolli per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti mammiferi utilizzano ratti neonati 1,2. Tuttavia, l'aumento del mouse come sistema modello per studi genetici (cioè geneticamente modificati knock-in e knock-out topi) ha reso necessario l'adeguamento dell'isolamento stabilito e metodologie di coltura. Purtroppo, l'isolamento di cardiomiociti neonatali di topo è particolarmente difficile rispetto a quella dei cardiomiociti neonatali di ratto utilizzati più tradizionalmente. Il protocollo presentato descrive un metodo affidabile e robusto ottimizzato per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo. Descriviamo i passi necessari per l'estrazione del tessuto iniziale, per la dissociazione di unnd purificazione dei cardiomiociti da fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali, e per le condizioni di placcatura e cultura. Mentre il protocollo offre un approccio di base per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo in condizioni standard, può essere facilmente adattato per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto, nonché per specifici tipi di saggio successivi: per es coltura delle cellule isolate sulle membrane flessibili (ad es Bioflex piastre di coltura) per indagare le proprietà biomeccaniche, la cultura in piatti di fondo di vetro (MatTek) per l'imaging cellulare dal vivo, o la coltura di cardiomiociti in xCELLigence cardio e-piastre (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) per studiare gli effetti dei farmaci sulle funzioni contrattili. Inoltre, offriamo opzioni per l'ottimizzazione dell'isolamento e della procedura cultura e discutere le fonti di possibili problemi e le relative soluzioni. Quindi, questo protocollo dovrebbe aiutare i ricercatori esame di una up-to-date, altamente riproducibile emetodo conveniente per preparare le culture del mouse cardiomiociti neonatali.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Siamo grati al Prof. emerito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Istituto Federale Svizzero di Tecnologia, Svizzera) per l'introduzione di tecniche di isolamento per ratto neonato e cardiomiociti di topo. Vorremmo ringraziare il Prof. Ju Chen e il Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) per il loro supporto. Il lavoro nel laboratorio di EE è stato finanziato da un MRC Career Istituzione Grant. SL è supportato da un K99/R00 percorso di aggiudicazione indipendenza dal NIH / NHLBI (HL107744). TMM è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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References
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