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Biology

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Published: September 6, 2013 doi: 10.3791/50154

Summary

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

Abstract

교양 신생아 심근 긴 myofibrillogenesis와 근원 섬유의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 심근 쉽게 조사 및 조작 생화학 경로, 그리고 자발적으로 심근 박동의 생 역학적 특성에 미치는 영향에 대해 수 있습니다.

다음 2 일간의 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 우리는 쉽게, 신생아에서 마음을 해부 심장 조직을 떼어 놓다 및 심장 세포 집단에서 심근을 풍부하게하는 방법을 보여줍니다. 우리는 세포 분리에 대해 서로 다른 효소 혼합물의 사용, 세포 생존 능력에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 고립 된 심근 이후에 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 또는 생체 역학 분석의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 단지 시판되는 용액을 사용하여, 견고성과 재현성을위한 프로토콜을 최적화 효소 혼합물이 SH오우 작은 로트의 변화. 우리는 또한 심근의 분리 및 문화와 관련된 일반적인 문제를 해결하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

Introduction

쥐의 심장 세포의 성공적인 해리와 문화에 대한 최초의 보고서는 다시 1960 년대 1, 2로 거슬러 올라갑니다. 그렇다하더라도, Harary 및 팔리 배양 심근는 "주기적인 수축의 요구 사항의 연구를위한 독특한 시스템을 제공 할 수있다 [월] [치는] 프로세스의 다양한 대사 경로의 기여를 결정하는 수단을 제공하는"것으로 나타났습니다. 젊은 쥐, 원래의 프로토콜에서 Harary 및 팔리 격리 배양 심근 수년에 걸쳐 적응 많은 과학자들에 의해 수정되었지만, 일반적으로 분리 및 배양 과정은 크게 변경되지 않았습니다. 그러나, 더 나은 효소 3, 표준화 된 솔루션 4,5 및 분리 절차 동안 6-9 세포를 보호하기 위해 가역 채널 및 미오신 ATPase의 억제제 BDM의 첨가는 크게 휴대 수율 및 생존을 개선했다.

신생아 cardiomyo 대 성인cytes

신생아 생쥐 나 쥐에서 분리 배양 심근 성인 심근의 문화에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성인 마우스 또는 쥐 10에서 심근의 분리에 비해 제일, 신생아 마우스 또는 쥐 마음의 분리 절차는 쉽고 적은 비용이다. 신생아 심근 크게 세포 수율을 증가하고, 분리 한 후 칼슘 함유 배지에 재 도입에 훨씬 덜 민감하다. 성인 심근는 일반적으로 수축을 유도하기 위해 서성 필요로하지만 일반적으로, 자발적으로 도금 한 후 세포를 20 시간을 치고 결과 재분화주기 - 또 다른 큰 장점은 신생아 마우스의 심근이 더 빠른 탈분화를 받아야한다는 것입니다. 성인 심근는 형질 전환 DNA의 성공적인 전달을 위해 바이러스 성 벡터를 필요로하는 반면 신생아 심근은 더 쉽게 또한 리포좀 형질 전환 방법과 형질이다. 신생아 심장 근세포 대조적의, 성인 쥐 심근 11-13의 문화는 근원 섬유 저하 및 수축성 장치의 궁극적 인 회복의 조사를 할 수 있습니다. 성인 심근에서 이러한 특성을 형태 학적 변화는 1-2 주 기간에 걸쳐 발생합니다. 탈분화 - 재분화주기함으로써 인간의 심근 병증이 14에서 관찰 된 병리학 적 변화를 흉내 낸, 태아 유전자 프로그램의 reexpression 함께합니다. 신생아 심근 세포의 배양을 통해 성숙한 래트 심근 세포의 또 다른 장점은 오랜 시간 동안 배양 할 수있는 능력이 세포이다.

마우스 심근 대 쥐

쥐 신생아 심근의 분리 및 배양 가능한 세포의 높은 수율 증가 형질 전환 속도 등의 마우스 신생아 심근의 그 이상 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 심장 질환에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 광범위한 사용 (예를 들어 </ 엠> 확장 성 심근증 15 모델과 근육 임 단백질 녹아웃 마우스) 신생아 쥐에서 유래 심근 세포의 분리 절차의 적응되었다. 신생아 래트 심근 세포 및 마우스를 분리하는 데 사용되는 프로토콜은 거의 동일하지만, 그레이트 손질 후자위한 적절한 효소 믹스의 선택에주의해야한다. 사실, 신생아 마우스의 심근이 감소 된 세포 수율과 생존의 결과로, 일반적으로 overdigestion에 더 취약합니다. 신생아 생쥐 유래 심근 신생아 래트 심장 유래의 세포에 비해 다소 작은 때문에 또한, 도금 밀도는 조정되어야한다.

형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 및 생체 역학 매개 변수뿐만 아니라 myofibrillogenesis의 프로세스의 조사를 위해 많은 용도로, 배양 신생아 심근는 연구를위한 가장 다양한 시스템 중 하나가되고 있습니다체외에서 심장 세포 기능. 성공적인 분석의 첫 번째 단계는하지만, 신생아 마우스 심근를 분리 할 수​​있는 쉽고 안정적​​인 방법에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 다양한 소스에서의 방법론을 그리고 재현성 및 안정성을 위해 최적화되었다. 우리는 심근 세포 수율과 생존에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

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Protocol

다음 절차는 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 대한 이틀간의 프로토콜 (16, 17)에 대해 설명합니다. 모든 솔루션은 살균 또는 멸균 필터링됩니다. 모든 공구는 75 %의 에탄올로 표면을 살균 소독한다. 초기 티슈 추출을 제외하고, 모든 단계는 무균 층류 세포 배양 후드에서 수행된다. 이 프로토콜은 하나, 둘, 쓰레기 (들)에서 신생아 마우스 마음의 분리를위한 것입니다 - 약 5-14 새끼,하지만 더 큰 쓰레기의 크기와 쥐 신생아 심근을 위해 구성 될 수있다. 적절한 규모의 미디어 / 효소 사용.

신생아 설치류와 작업의 경우, 의회 및 / 또는 동물 관리 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학 지침 및 규칙을 참조하여 제도적으로 승인 된 동물 프로토콜을 준수. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을, 그리고 FEDE에 부착 된RAL 및 주 규정.

1 일.

1. 신생아 쥐의 심장 조직의 분리

  1. 20 mM의 BDM 6-8로 보충 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS 50 ㎖를 준비하고, 얼음에 배치 된 두 개의 멸균 세균 요리에 분산.
  2. 50 ㎖ 멸균 원뿔 팔콘 튜브에 격리 매체의 10 ㎖를 준비합니다. 얼음에 모든 솔루션을 유지합니다. 그리고 집게 (곡선, 뒤몽 7 번), 가위 (하나의 직선 곡선을) 소독.
  3. 1-3일 된 신생아 마우스는 표면 살균에 대한 75 %의 에탄올 용액에 신속하게 세척된다. 새끼는 멸균 가위 (직선)을 사용하여 참수하고, 가슴은 흉강에 대한 액세스 및 심장 (그림 1A, 보충 영화 S1)을 허용하는 흉골을 따라 열립니다.
    기술 코멘트 : 3 일 이전의 신생아 마우스는 사용하지만, 적은 가능한 세포 2 발생할 수 있습니다.
  4. 하츠에서 추출곡선 가위로 몸과 20 mM의 BDM과 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 박테리아 접시에 즉시 전송, 얼음. 모든 다음 단계는 무균 세포 문화 후드에서 수행됩니다.
  5. (원하는 경우, 및 심방) 폐 조직, 큰 혈관을 제거합니다. 1X PBS 용액에 세척 하트 (칼슘없이 2 +, Mg를 2 +) 20 mM의 BDM (얼음)와 혈액을 제거합니다. 전송 20 MM (얼음) BDM 집게를 사용하거나 구멍 스푼 (그림 1B)와 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 두 번째 박테리아 접시에 첫 번째 접시에서 마음을 씻어.
  6. 전송 청소 / 절연 매체의 드롭 (약 250 μL, 그림 1C)에 마음을 세척 (얼음) 세 번째 박테리아 접시에 작은 조각 (약 0.5 mm 3 이하로 마음을 말하다 곡선 가위를 사용한다; 그림 1D, 1E).
  7. 원추형으로 다진 마음을 전송튜브 (얼음) 절연 매체의 10 ㎖를 포함, 밤에 4 ° C에서 교반과 함께 배양한다.

2 일.

2. 세포의 효소 조직 소화 도금

  1. 콜라게나 / 디스 파제 혼합물 (로슈)의 15 밀리그램의 무게를, 20 mM의 BDM (소화 매체)로 보충 10 ㎖ L15 매체 5 효소 믹스를 녹입니다. 살균 필터 새로운 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 세포 배양 후드에서 소화 매체.
  2. 30 ML L-15 20 mM의 BDM 보충 매체와 도금 매체를 준비합니다.
  3. 1 시간의 최소 콜라겐 용액 (시그마 C-8919)를 가진 외투 세포 배양 플레이트. 멸균 층류 세포 문화 후드에 콜라겐 용액 (재사용 할 수있는) 건조 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시를 제거합니다.
  4. 4 ℃에서 predigested 마음을 포함하는 원뿔 튜브를 제거 조직의 조각 (그림 1G)을 집계해야합니다. 조직 단편에 싱크하자튜브의 바닥 (모든 조직의 조각을 느슨하게하지 않도록하십시오., 일반적으로, 절연 매체의 약 1 ㎖ 튜브에 남아있을 수 있습니다) 뜨는을 제거합니다. 소화 배지 5 ㎖를 1 분 동안 산소 또는 공기를 이용하여 조직 절편 및 옥시 현탁액에 20mM의​​ BDM 보충 된 L-15 5 mL를 추가.
  5. 소화 용액의 온도를 조절하기 위해 약 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 소화 매체에서 심장 조직의 조각을 포함하는 밀봉 원뿔 튜브를 전송합니다.
  6. 20 ~ 30 분 동안 교반과 (60RPM 이하 이상으로 설정 37 ° C에서 예를 들어, 셰이커,)와 37 ° C에서 심장 조직의 조각을 품어. . 소화 시간은 크게 효소 혼합물 및 로트 번호주의에 따라 달라질 수 있습니다 : 더 이상 부화 기간 이상 효소의 농도는 세포 생존 능력을 감소시킬 수있다.

기술 코멘트 : 102696 : 우리는 (Cat.No. 로슈에서 콜라게나 / 디스 파제 혼합물의 사용을 추천합니다38001)이 아주 작은 로트의 변화가 있습니다. 마우스 심근의 분리를위한 고전적인 효소 트립신 및 / 또는 워딩 턴 (고양이 없음 CLS-2)에서 사용 가능한 콜라게나 제 II 형 3,16-20입니다. 그러나, 콜라게나 II의 성능은 로트에서 실질적으로 다를 수 있습니다. 워딩 턴은 일반적으로 소화 시간을 최적화하고 사용을 효소 몇 가지 콜라게나 많이 테스트 할 수 있습니다. 대안 적으로, 워딩은 사전 테스트 효소 혼합물로 심근 분리 키트를 판매하고 그 마우스 심장 근세포 17 (: NCIS 카탈로그 번호)의 분리를 위해 적응 될 수있다 포함.

  1. 신선한 멸균 50 ML 원뿔 팔콘 튜브에 멸균 세포 스트레이너 (40 ~ 100 μm의 나일론 메쉬)를 놓습니다. 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15와 사전 젖은 셀 스트레이너. 10 ~ 20 회 미리 침수 10 ㎖ 세포 배양 피펫을 사용하여 부드럽게 씹다 조직 조각. 조직 단편을 주로 suspensio로 세포를 방출이 단계 중에 분산해야N (그림 1H).
  2. 큰 조직 파편이 침전하자 세포 스트레이너 (그림 1I)를 통해 신선한 원뿔 튜브에 중단 세포를 포함 뜨는 전송.
  3. 5 ㎖의 소화 매체에 소화되지 않은 조직의 조각을 다시하면 일시 중지 및 교반과 함께 37 ° C에서 추가로 5 ~ 10 분 동안 품어.
  4. 남아있는 조직 조각의 지속적인 소화 한 후, 가볍게 10 ~ 20 회 조직을 씹다 첫 번째 셀 스트레이너를 통해 다이제스트에서 원뿔 튜브 포함하는 셀을 추가 할 수 있습니다. 모든 소화 세포의 통과를 허용하는 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15 세포 스트레이너를 씻어.
  5. Centrifugate 원뿔 튜브 300 rpm에서 5 분 (약 50 ~ 100 XG)에 대한 중단 심근을 포함. (대부분 섬유 아 세포와 내피 세포를 포함) 상층 액을 제거하고 매체를 도금 10 ㎖에 다시 중단 세포 펠릿.
  6. 10cm의 세포 배양 접시 (그림 2A)로 1 부화 플레이트 세포세포 배양 인큐베이터에서 -3의 시간. 이 사전 도금 단계는 코팅되지 않은 세포 배양 접시 (그림 2C)에 부착되는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포 (그림 2B)를 제거합니다.
  7. 배양 후, 전송 재현 탁 세포는 멸균 원뿔 팔콘 원심 분리 관 (15 ㎖를 50 ㎖)에 (반복 접시 위에 도금 매체를 피펫으로 다시 중단 세포) 10cm 배양 접시에서 비 부착 심근을 씻어.
    선택 사항 : 세포 현탁액에서 추가 섬유 아 세포를 제거하는 사전 도금 단계를 반복합니다. 필요하다면, 접착 섬유 아세포 및 내피 세포 배양 일 수있다.
  8. (노이 바 우어의 혈구를 사용하여 예를 들어, 21를 염색 블루 배제 트리 판) 세포를 계산합니다.
  9. cm 2 (그림 2D 당 약 1.5 × 10 5 세포의 밀도 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 플레이트 세포, 볼은 도금 표 1 코멘트및 코팅).
    세포 배양 인큐베이터에 요리를 놓고 준수 및 심근의 확산 수 있도록 12 ~ 18 시간 동안 그대로 둡니다.

3 일 - 신생아 심근의 문화

  1. 37 ° C의 물을 욕조에 유지 보수 매체 prewarm를 준비합니다. 신생아 마우스 심근의 리포좀 형질에 대한 증식 억제 또는 chronotropic 에이전트의 추가, 또는 절차에 대한 내용은 표 1을 참조하십시오.
  2. 어느 날 도금 후 심근 세포의 배양 접시에 부착하고 최적의 계약을 자발적으로 시작해야합니다 (그림 2E, 2F를, 보충 영화 S2; 분리 / 배양 절차를 수행하는 동안 일반적인 문제에 대한 표 2 참조). 추가 1-5일에 대한 유지 보수 매체와 문화 매체를 도금 교체합니다. 필요에 따라 매체를 변경합니다.

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Representative Results

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 8 햇 신생아 생쥐 (그림 1A, 1B, 보충 영화 S1)에서 마음입니다. 세척 및 가위 (그림 1C-1 층)과 마음을 닦지 후, 조직 단편을 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 절연 매체에 predigested했다. predigestion (그림 1G)에 따라, 우리는 갓 소화 매체로 조직 조각을 전송하고, 교반과 함께 37 ° C에서 20 분 동안 조직의 조각을 배양 하였다. 얻어진 세포 현탁액 (도 1H)는 셀 스트레이너 (도 1G)를 통해 여과 하였다. 원심 분리 후, 펠릿 세포 배지 도금으로 13 ㎖에 재현 탁하고, 10cm의 세포 배양 접시 (도 2A)으로 예비 도금, 및 심장 섬유 아세포 및 내피 세포 (도 2B, 2C)의 부착을 허용하기 위해 2 시간 동안 배양 하였다. 빠르게 연결하지 않은 세포는 다시했다도금 배지에 현탁. 심근 세포를 포함하는 세포 현탁액 10 μL를 에펜 도르프 튜브로 pipetteted 및 1:1 비율의 트리 판 블루 용액으로 염색 하였다. 세포 / 매체 도금 ML 약 5.1 × 10 5 생세포 결과 자동화 세포 계수기를 사용하여 계수 하였다. 카운팅 후, 균체 접시 (;도 2d 1.4 × 105 세포 / cm 2) 당 약 1 × 106 도금 셀의 결과로, 네 30mm 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시 (접시 당 2 ㎖)로 플레이 팅 하였다. 18 시간 도금 후, 심근은 (약 70 %의 포화 상태에) 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 부착 자발적으로 (그림 2E, 보충 영화 S2)을 수축하기 시작했다. 이어서, 심장 근세포는 하나 (표 1 참조) 리포좀 형질 감염에 사용 된 세포 또는 직접적으로 보존 배지 (도 2F)로 도금로부터 옮겼다 그리고 또 다른 3 일 동안 배양 하였다. 배양에 이어, 심장 근세포 간단히 4 % PFA / PBS에서 5 분간 고정하고 최근 출판물 (22)의 하나에 기재된 면역 위해 가공, 1X PBS로 세척 하였다. 면역 학적으로 스테인드 형질 감염되지 않은 및 형질 심근 문화를 묘사하는 대표적인 결과는 각각 그림 2G 하반기에 표시됩니다. 배양 된 신생아 심근은 근원 섬유의 시각화에서 알 수있는 바와 같이, 예상 cytoarchitecture (그림 2G 빨간 신호)와 인터 디스크와 같은 구조 (그림 2G에서 녹색 신호)를 표시합니다. 그림 하반기에서 볼 수있는 것처럼 그들은 또한 일시적인 형질 의무가 있습니다 (녹색 신호가 형질 단백질, 알파 - sarcomeric 티닌 항체를 사용하여 근원 섬유의 빨간색 신호 counterstaining).

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8 신생아로부터 분리 신생아 생쥐에서 심장 조직의 그림 1. 격리.) 마음이주의 깊게 곡선 집게를 사용하여 가슴에서 제거 ()도 보충 영화 S1을 참조하십시오. B) 하츠 (칼슘 2 +없이 1X PBS에 세척 MG 2 +))이 얼음. C에 20 mM의 BDM 보충 마음이 분리 매체의 드롭으로 전송됩니다. DE) 미리 침수 피펫을 사용하여 곡선 가위 다진 심장 조직의. F) 전송을 사용 신생아 마음을 닦지. G) 소화와 분쇄의 20 분 후에 정지에 4 ° C. H)의 Cardiomyocytes에서 하룻밤 동안 배양 한 후 Predigested 심장 조직. 소화되지 않는 심장 조직)을 관. I의 아래쪽에 절연 C의 현탁액을 누적ardiomyocytes는 셀 스트레이너를 통해 필터링됩니다.

그림 2
심장 섬유 아 세포와 내피 세포는 1-3 시간 후 코팅되지 않은 세포 배양 접시에 부착하기 시작 도금 전 단계. B)의 시작 부분에서 고립 된 세포의 신생아 마우스 심근 대표적인 면역 형광 이미지의 그림 2. 문화.) 도금 원하는 경우 비 접착 성 심근의 재 부유 한 후 도금 전 단계. C) 동안 문화, 나머지 심장 섬유 아 세포와 내피 세포는 배양 할 수있다. 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에서 분리 정제 신생아 마우스 심근 D) 도금 . E) 문화의 18 시간 후, 심근는 코팅 D 준수ishes, 최적으로 (또한 보충 영화 S2 참조). F) 유지 보수 매체 도금 매체를 교체 문화에서 죽은 세포를 제거하는 자연 수축을 시작합니다. myomesin에 대한 항체로 염색 신생아 마우스 심근의 A)-F) Scalebar 0.2 mm. G) 대표 면역 형광 이미지 빨간색 (발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와, MMAC의 myomesin의 B4)과 베타 - 카테닌 (시그마, CAT. - 없음 . : C2206, 녹색). 빨간색으로 표현 GFP - 태그 녹색 단백질 (GFP-titin - N2B 조각), 그리고 알파 - 티닌 (시그마, CAT. - 동안 No.A-7811)로 형질 신생아 마우스 심근 Scalebar 10 ㎛. H) 대표 면역 형광 이미지 . 20 μm의 Scalebar. 형질 감염 및 면역 염색에 사용되는 2G) 및 2H)를위한 방법은 표 1에서 발견 될 수 있고, 우리의 최근 간행물 (22) 중 하나에 요약 하였다.

보충 영화 S1.

보충 영화 S2는. 보충 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

사전 도금 분리 후 세포의 사전 도금은 크게 전체 세포 혼합물로부터 심장 섬유 아 세포와 내피 세포를 제거합니다. 선불 도금 단계는 세포 인구에서 비 심근 약 50~80%을 제거합니다. 두 번 이상 도금 전뿐만 아니라 3 시간 이상 사전 도금 시대로의 반복으로 인해 심장 근육 세포의 추가 손실을하지 않는 것이 좋습니다. 사전 도금의 대체 퍼콜 구배 (23, 24)은 심근 세포 인구의 순도를 향상시킬 수 있습니다.
코팅 및 세포 배양 기판 EX와 세포 배양 접시의 코팅콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 복잡한 ECM 혼합물 (즉, 리겔 (25), (26)) 또는 인공 기판 (즉, 실리콘 폴리머 (27), 유기 실란 28) 등 tracellular 매트릭스 (ECM) 구성 요소는 긍정적으로 초기 도금 단계에서 확산 심근 준수, 세포 생존과 세포에 영향을 미친다 그 이후의 배양 기간 동안. 특히 유리 기판에 심근 배양 심근의 적절한 부착을 달성하기 위하여 ECM 성분을 가진 표면의 코팅을 필요로한다.
우리는 0.1 %의 콜라겐 용액 (시그마 C-8919), 3 ㎎ / ㎖ 콜라겐 1 형 솔루션 (고급 Biomatrix, PureCol), 1 %의 젤라틴 용액 (를 포함하여 ECM 구성 요소의 다양한 세포 배양 처리 플라스틱 및 유리 기판의 코팅을 테스트 시그마 G9391, H 2 O, 멸균에 용해), 라미닌 솔루션 (시그마 L4544), 또는 돼지 하트 29 또는 심장 섬유 아세포 (30)에서 파생 된 복합 ECM의 혼합물을 포함한다. 휴대 cultu요리는 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤에 1 시간의 최소의 ECM 솔루션을 배양 하였다 다시 층류 세포 문화 후드에서 건조 ECM의 제거 후.은 장기간 보관하면 불임 및 ECM 단백질의 무결성 (4 ° C 또는 냉동에서 예를 들어, 저장)를 유지하는 경우 ECM 솔루션은 여러 번 (20 번)을 재사용 할 수있다. 주의로 인해 ECM 단백질을 분해하는 데 사용되는 버퍼의 일부 산성 특성으로 코팅 한 후 1X PBS와 문화 요리의 세척 세포의 도금하기 전에해야 할 수 있습니다.
기술과 밀도 도금 이후의 분석에 따라, 도금에 대한 최적의 세포 농도는 거의 합류 심근 단층에서 발생한다. 낮은 농도의 전문 세포 - 세포 콘택 찾아 볼 수없는 하나의 고립 된 심근의 세포 생존과 결과를 감소하는 반면 높은 농도에서 심근의 도금, 다층 심근 집계 낮은 동질성 결과TS (삽입 된 디스크와 같은 구조). 심근 오히려 크고 무거운, 그리고 팔콘 튜브의 바닥에 집중하는 경향이 있다는 것을 명심 도금을위한 세포를 피펫 팅합니다. 도금 단계 사이에있는 세포의 재 부상은 요리를 통해 세포의 균일 한 분포를 보장합니다. 도금 셀 체형의 형상으로 요리를 이동할 때 "8"접시의 중심까지의 세포 농도를 피하기 위하여. 리포좀 형질에 지정된 신생아 심근의 최적 자랄 도금 후 하루 70 ~ 80 %이어야한다.
혈청 세포 배양의 사용은 태아 (또는 신생아) 도금 배지에 소 혈청과 말 혈청 도금 단계에서 세포 생존 능력 및 심근의 준수에 필요한 시험. 사용 된 혈청의 품질은 도금 / 배양 과정 동안 중요한 단계 중 하나 일 수있다. 혈청의 낮은 양의 유지 보수 매체의 보완은 선택 사항입니다, 그러나 크게 impro있다문화 시간의 기간을했습니다.
주의 : 혈청의 첨가는 크게 배양 심근 세포의 생화학 적 신호 전달 경로를 변경할 수 있으며, 실험적 파라미터 가설 및 결과의 후속 해석에 대해 판정 될 수있다. 심근의 혈청 문화 10,31 설명되어 있고, 때문에 혈청에 존재하는 알 수없는 성장 요인에 결과 기울이기을 방지 할 수 있습니다.
대량 살상 무기 확산 억제 말기 차별화 된 심근 세포는 일반적으로 세포 분열을 받아야하지 않습니다. 그러나, 10 μM ARAC (시토신-BD-아라 비노 - furanoside 염산염; 시그마 C6645)와 같은 증식 억제제의 추가 유지 보수 매체는 매우 심장 섬유 아세포와 혈관 내피 세포의 증식을 방지하는 것이 좋습니다. 비록 심장 섬유 아세포 및 내피 세포의 집단을 줄이기 위해 사전 도금 단계의 추가와 함께, 나머지 섬유 아세포는 세포 proli을 겪을 것이다feration 상당히 시간이 지남에 따라 배양 세포 인구를 변경합니다.
주의 : 유전 적 요인과 분리 시간 점, 배아와 신생아 마우스 심근가 계속 확산 가능성 23,32,33가있을 수 있습니다에 따라. ARAC의 사용은 실험적인 매개 변수, 가설과 결과의 해석에 따라 판단해야한다.
chronotropic 에이전트 추가 (우선적으로 신생아 쥐의 심근 1 μM, 시그마 I6501), 또는 이소 프로 테레 놀 등의 페닐 (시그마 P6126 0.1 우선적으로 신생아 쥐의 심근에 대한 밀리미터,)와 같은 에이전트 (34)와 유지 보수 매체의 보완은 크게에서 심근의 확산, sarcomerogenesis 증가 판뿐만 아니라, 세포의 자발적인 박동. 그러나, 이들 제제의 첨가는 원하는 분석 파라미터 (예를 첨가 수축 거동 및 생화학 적 파라미터를 기울일 수도있다)과 관련하여 칭량한다.
형질 신생아 마우스 심근에 DNA / RNA의 리포좀 형질 형질 시간 점, 형질 전환 시약, 문화, 밀도, DNA / RNA 농도와 사용 된 DNA의 구조에 크게 의존한다. 우리는 리포좀 형질 전환 시약의 다양한 테스트를 호위 III (시그마) 리포 펙 타민 2000 (Invitrogen 사) 적용을 발견했다. 항생제 유지 보수 매체와 이전에 형질에 도금 매체 2 시간을 대체하여 도금 한 후 세포를 24 시간 형질. 신생아 심근의 형질이 30mm 접시에 배양의 경우, 멸균 에펜 도르프 튜브에 200 μL의 DMEM과 1 ~ 2 μg의 DNA를 섞어 희석 된 DNA 혼합물에 에스코트 III의 4 μl를 추가합니다. 부드럽게 혼합 DNA / 리포좀 복합체 형성 할 수 있도록 멸균 후드에 최소 5 분 동안 품어. 800 ㎕의 신선한 항생제 유지 보수 매체와 항생제 유지 보수 매체를 교체하고 세포에 DNA / 리포좀 혼합물을 추가합니다. 셀 CU에서 세포를 품어24 시간 후 신선한 표준 유지 보수 매체 LTURE 인큐베이터 및 교체합니다. 성공적으로 형질 전환 된 신생아 마우스의 심근에 대한 대표적인 결과는 그림 하반기에 표시됩니다. DNA의 칼슘 침전 법을 이용하여 형질 전환도 가능하다. 신생아 마우스 심근의 형질은 1~20%에 이르기까지 일반적인 형질 전환 효율과, 신생아 쥐의 심근에 비해 더 어렵다. (: 아데노 바이러스, 아데노 - 관련 바이러스, 렌티 바이러스 등) 바이러스 성 벡터는 높은 효율 35-37을 달성하기 위해 필요합니다. 신생아 심근의 일렉트로은 DNA / RNA의 전달에 적합하지 않은 우리의 손에 달려있다, 그러나 몇몇 보고서는 배아와 신생아 심근 (38, 39)의 전기 충격을 사용하여 성공을 보여줍니다. 최근 기사 (38), Djurovic 등 알. 여러 형질 전환 방법, 성공률뿐만 아니라 자신의 장점과 단점을 요약합니다.
계대 냉동 / 스토격노 심근의 계대는 1을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 장기간 보관을위한 격리 된 신생아 심근의 동결로 인해 낮은 효율과 낮은 회수율에 추천 할 매우 어려운 없습니다. 몇몇 회사는 그러나 조건이 최적화 될 필요가있다, 또한 신생아 마우스 심근의 냉동 보존에 적합 할 수있는 인간의 심장 근세포 차 문화 (예를 들어 celprogen, 고양이. 아니. M36044-15FM)에 대한 전문적인 냉동 매체를 제공합니다. 심방 심장 근세포의 성공적인 계대 및 냉동는 형질 전환 마우스 모델 (32)에 설명되었다.

도금과 문화 조건의 표 1. 최적화, 리포좀 형질.

실행 가능한 또는 부착 세포 일일 도금 후 - 효소의 농도 및 / 또는 소화 시간을 단축
- 변경 효소 혼합물
- 차매체를 도금에 대한 NGE 혈청
- 변경 ECM / 코팅 매체 및 / 또는 세포 배양 접시의 유형
- 격리 / 소화 미디어에 20 mM의 BDM를 추가
- 세포의 오염 확인
낮은 세포 수율 - 소화 시간 및 / 또는 효소 농도를 증가
- 분리 절차를 수행하는 동안 증가 원심 분리 시간 / 속도
- 증가 분쇄 기간
고르지 도금, 문화에 세포의 포화 상태는 고 / 너무 낮 - 분리 과정 중에 세포를 계산하고 도금하는 동안 셀 / 접시의 수를 조정
- 도금 농도를 조정
- 신중하게 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 재현 탁 반복 피펫 팅 (하루 2 단계 13)에 의해 도금하기 전에, 눈에 보이는 세포 덩어리가 남아 있도록
더 치고 세포 없습니다 (: 페닐, 이소 프로 테레 놀 등) - 유지 보수 매체에 chronotropic 에이전트를 추가
- 매체를 대체
- 채널심장 섬유 아 세포 / 내피 세포의 높은 번호에 대한 에크
섬유 아 세포의 높은 수 - 분리 과정 중에 추가적인 예비 도금 공정을 추가
- 유지 보수 매체에 증식 억제제를 추가 (표 1)
많은 죽은 세포 - 세포 배양 배지를 대체
- 분리 절차 도중 효소의 농도 및 / 또는 소화 시간을 단축
- 체크 세포 배양 배양기 (CO 2, 온도, 습도)
- 오염 확인
오염 - 무균 세포 배양 작업 환경 (21)에 부착
- 새로운 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션에게 사용 매체를 대체
- 표면의 75 % 에탄올 용액으로 신생아 생쥐 살균

표 2. 문제 해결. 많은 요인 일차 전지의 성공적인 분리 및 문화에 영향을 미칠 수의. 기본 세포 배양 기술에 일반적인 소개로, 이안 Freshney (21)에 의해 같은 "동물 세포의 문화"등의 설명서를 참조하십시오. 우리가 발생한 신생아 마우스 cardiomocytes의 분리 및 문화 procedur 문제의 가능한 원인은 대부분이 표에 나와 있습니다.

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Discussion

심장 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 심장 혈관 연구에서 표준이되었습니다. 이 모델의 가까이 생화학 적 특성 (즉, 생화학 적 또는 생체 역학적 인 자극에 심장 세포의 직접 응답을 공부)은 일반적으로 심장 조직이나 심근의 분리가 필요합니다. 심장의 생리적 반응을 조사 연구는 생체 (예를 들어 40 아세틸 콜린, 또는 허혈 - 재관류 시나리오 41)은 일반적으로 심장 조직 조각의 44, 45가에서 심근의 조사를 허용 이식편 문화 동안 랑겐 - 관류 전체 마음 42,43 활용 입체적인 조직 환경. 그러나, 조직 체외 이식편을 배양하는 것은 잠재적으로 조직의 코어 내에서 괴사 성 클러스터를 생성 영양소의 확산을 방해 할 수있다. 또한, 심근가 조직 내에서 움직이며, 따라서 외식 밖으로 세포의 이동은 obse입니다섬유 아 세포 또는 추정 심장 전구 세포 (44)와 같은 비 심근에 대한 rved. 따라서 분리 및 배양 과정의 설립을 요구 심근의 발달, 세포 생물학, 생화학 및 생물 물리학 적 행동을 조사. 포유 동물의 심장 근세포의 분리 및 문화에 대한 초기 프로토콜은 신생아 쥐 1,2를 사용합니다. 그러나, 유전자 연구를위한 모델 시스템으로 마우스의 상승 (즉, 유전자의 노크 또는 녹아웃 쥐를 수정) 설립 분리 및 배양 방법의 적응을 필요하게. 불행히도, 신생아 쥐 심근 세포의 분리는 전통적으로 사용되는 신생아 래트 심근 세포의 그것과 비교하여 특히 도전적이다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 최적화 된 안정적이고 강력한 방법을 설명합니다. 우리는 해리를 위해, 초기 티슈 추출에 필요한 단계를 설명차 심장 섬유 아 세포와 혈관 내피 세포에서 심근의 정화 및 도금과 문화 조건. 프로토콜이 표준 상태에있는 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 대한 기본적인 접근 방식을 제공하지만, 그것은 쉽게 신생아 쥐의 심근 세포의 분리 및 문화 적응뿐만 아니라, 특정 후속 분석 유형에 대한 수 있습니다 고립 된 세포의 예를 들면 문화 xCELLigence 심장 전자 판에서 심근의 라이브 세포 이미징, 또는 문화에 대한 유연한 막 생 역학적 특성을 조사하기 위해 (예를 들면 Bioflex 문화 판), 유리 바닥 요리 문화 (MatTek)에 (ACEA, 로슈, Cat.-No. : 06417051001) 수축성 함수에 대한 약물의 효과를 연구한다. 또한, 우리는 분리 및 배양 과정의 최적화에 대한 옵션을 제공하고 문제와 그 해결 방법에 대한 소스를 설명합니다. 따라서,이 프로토콜은 연구자가 최신, 높은 재현성 및 검사 지원한다신생아 마우스 심근 문화를 준비하기위한 저렴한 방법.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

우리는 교수의 명예 장 클로드 Perriard과 에블린 Perriard 신생아 쥐와 쥐 심근을위한 절연 기술에 도입 (기술, 스위스 스위스 연방 공업 대학)에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 교수 후아 첸 교수 실비아 에반스 (UCSD, 미국)에게 감사의 말씀을 전합니다. EE의 실험실에서 작업 MRC 경력 설립 교부금에 의해 투자되었다. SL은 NIH / NHLBI (HL107744)에서 독립 수상에 K99/R00 경로에 의해 지원된다. TMM은 미국 심장 협회 (American Heart Association, 11POST7310066)에서 박사 학위 취득 후 친교에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 Sigma B-0753 prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase Roche 10269638001 can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3 Worthington CLS-2 substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA cellgro 25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS cellgro 30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) e,g, cellgro 21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 cellgro 21-022-CV
DMEM high glucose cellgro 10-013-CV
M-199 cellgro 10-060-CV
fetal bovine serum cellgro 35-011-CV cell-culture grade
horse serum cellgro 35-030-CV cell-culture grade
Leibovitz L-155 cellgro 10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) Sigma C-6645 proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine Sigma P-6126 chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride Sigma I-6501 chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution Sigma C-8919 extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution Advanced BioMatrix 5005-B alternative to Sigma collagen solution
cell strainer Fisherbrand 22363548 appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm Fisherbrand 09-719C for sterile filtration of digestion medium
straight scissors Fine Sciences Tools 91460-11
curved scissors Fine Science Tools 91461-11
Dumont No. 7 forceps Fine Science Tools 91197-00
perforated spoon Fine Science Tools 10370-19 optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue Gibco 15250-061 live cell staining
Neubauer hemocytometer Prosource Scientific 3500 alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes Fisherbrand 14-432-23
15 ml Falcon tubes Fisherbrand 05-527-90
20 ml syringe BD Medical 14-820-19
10 ml serological pipette Falcon 357551
30 mm cell culture dish Nunc 153066 for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom MatTek P35G-0-10-C for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish Nunc 172958 for preplating
Escort III Sigma L3037 for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000 Life Technologies, Invitrogen 52887 substitute for Escort III
Buffers and media:
  • Isolation medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    0.0125% trypsin
    in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)
  • Digestion medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix
    in L15 medium
  • Plating medium
    65% DMEM high glucose
    19% M-199
    10% horse serum
    5% fetal calf serum
    1% penicillin/streptomycin
  • Maintenance medium
    78% DMEM high glucose
    17% M-199
    4% horse serum
    1% penicillin/streptomycin
    optional:
    1 μM AraC
    1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine
The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.

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References

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Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (79), e50154, doi:10.3791/50154 (2013).

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