Summary
Primære mus cardiomyocyte kulturer er et av de viktigste verktøyene for etterforskning av myofibrillære organisasjon og funksjon. Den følgende protokoll beskriver isolering og kultur av primære kardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturene kan deretter bli benyttet for en rekke biomekaniske, biokjemiske og biologiske celle-analyser.
Abstract
Dyrkede neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt til å studere myofibrillogenesis og myofibrillære funksjoner. Dyrkede cardiomyocytes gir enkel undersøkelse og manipulasjon av biokjemiske mekanismer, og deres effekt på biomekaniske egenskaper spontant slo cardiomyocytes.
Følgende to-dagers protokollen beskriver isolasjon og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Vi viser hvordan du enkelt kan dissekere hjerter fra nyfødte, distansere hjertevevet og berike cardiomyocytes fra hjerte celle-befolkningen. Vi diskuterer bruk av forskjellige enzymblandinger for celle-dissosiasjon, og deres virkninger på celle-levedyktighet. De isolerte cardiomyocytes kan senere brukes til en rekke ulike morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologiske og biomekanisk analyse. Vi optimalisert protokollen for robusthet og reproduserbarhet, ved bare å bruke kommersielt tilgjengelige løsninger og enzym blander at show litt mye til lot variasjon. Vi tar også vanlige problemer knyttet til isolasjon og kultur av cardiomyocytes, og tilbyr en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.
Introduction
De tidligste rapporter for den vellykkede dissosiasjon og kultur av gnager hjerte celler dateres tilbake til 1960-tallet 1,2. Selv da, Harary og Farley lagt merke til at kultur cardiomyocytes "kan gi et unikt system for studier av kravene i den periodiske contractility [, og kan] gi grunnlag for fastsettelse av bidrag fra ulike metabolske veier for [juling] prosess". Selv Harary og Farley isolerte og kultur cardiomyocytes fra unge rotter, og den opprinnelige protokollen har blitt tilpasset og modifisert av mange forskere i løpet av årene, har den generelle isolasjon og dyrking prosedyren ikke sterkt forandret. Imidlertid har bedre enzymer 3, standardiserte løsninger 4,5, og tilsetning av den reversible kanal og myosin ATPase inhibitor BDM for å beskytte celler under isoleringsprosedyren 6-9 vesentlig forbedret celle-utbytte og levedyktighet.
Voksen vs neonatal cardiomyocytes
Cardiomyocytes isolerte og dyrket fra nyfødte mus eller rotter har flere fordeler i forhold til kulturer av voksne cardiomyocytes. Fremst, er isolasjonsmetoden for neonatale mus-eller rottehjerter enklere og mindre kostbare, sammenlignet med isolering av kardiomyocytter fra voksne mus eller rotter 10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsom overfor gjeninnføringen inn i en kalsium-inneholdende medium etter dissosiasjon, i stor grad øke celle-utbytte. En annen stor fordel er at neonatale mus kardiomyocytter gjennomgå en raskere dedifferentiation - redifferentiation syklus som vanligvis resulterer i spontant slo celler 20 timer etter plating, mens voksne cardiomyocytes vanligvis krever pacing å indusere sammentrekning. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transfectable med liposomal transfeksjonsmetoder, mens voksne cardiomyocytes krever virale vektorer for vellykket levering av transgen DNA. I motsetning til neonatal cardiomyocytes, kultur av voksne gnager kardiomyocytter 11-13 åpner for undersøkelser av myofibrillære fornedrelse og eventuell reetablering av kontraktile apparatet. Disse karakteristiske morfologiske forandringer hos voksne cardiomyocytes oppstår over perioder på 1-2 uker. Den dedifferentiation - redifferentiation syklus er ledsaget av reexpression av fosterets genet programmet, dermed etterligne patologiske forandringer observert i menneske cardiomyopathies 14. En annen fordel av voksne rotte cardiomyocytes over kultur av neonatal cardiomyocytes er evnen til kulturen disse cellene i lange perioder av gangen.
Rat vs mus cardiomyocytes
Isolasjon og kultur av rotte neonatal cardiomyocytes har noen fordeler over at muse neonatal cardiomyocytes, inkludert høyere avkastning av levedyktige celler og økt transfeksjon priser. Men den brede bruken av genmodifiserte mus modeller for hjertesykdommer (f.eks </ Em> muskel lim protein knockout mus som modell for dilatert kardiomyopati 15) har ført til tilpasning av isolasjonsmetoden for cardiomyocytes avledet fra neonatale mus. Selv om protokollene som brukes for å isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er nesten identiske, må større forsiktighet tas ved valg av en passende enzym blanding for sistnevnte. Faktisk, neonatale mus cardiomyocytes er generelt mer utsatt for overdigestion, noe som resulterer i en redusert celle-utbyttet og levedyktighet. Videre bør plette densitet justeres, fordi kardiomyocytter avledet fra neonatale mus er noe mindre i forhold til celler avledet fra neonatale rotte-hjerter.
Med mange bruksområder for etterforskningen av morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologisk og biomekaniske parametere samt for prosessen med myofibrillogenesis, har kultur neonatal cardiomyocytes blitt en av de mest allsidige systemer for studiet avhjertecellefunksjoner in vitro. Det første skrittet til en vellykket analyse avhenger imidlertid av en enkel og pålitelig metode for å isolere neonatale mus kardiomyocytter. Vår protokoll trekker sin metodikk fra mange kilder og er optimalisert for reproduserbarhet og robusthet. Vi diskuterer faktorer som påvirker cardiomyocyte-yield og levedyktighet, og gir en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre beskriver en to-dagers protokollen 16,17 for isolering og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Alle løsninger er sterile eller sterile filtrert. Alle verktøy er sterilisert ved overflaten sterilisering med 75% etanol. Bortsett fra den innledende vev ekstraksjon, blir alle trinnene utføres i en steril laminær cellekultur hette. Denne protokollen er beregnet for isolering av neonatale mus hjerter 1-2 kull (e) - omtrent 5-14 pups, men kan tilpasses for større kullstørrelse og neonatal rotte kardiomyocytter. Scale media / enzym bruk etter behov.
For arbeid med neonatal gnagere, se dine lokale retningslinjer universitet og regler fastsatt av lovgiver og / eller dyr skolefritidsordning, og holder seg til din institusjonelt godkjent dyr protokollen. Alle metoder som er beskrevet i denne protokollen har blitt godkjent av UC San Diego Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), og holder seg til federal og statlige reguleringer.
Dag 1.
En. Isolering av Cardiac Vev fra Neonatal Mus
- Forbered 50 ml av 1 x PBS (uten Ca 2 +, 2 + Mg) supplementert med 20 mM BDM 6-8, og dispergere inn i to sterile bakterielle retter plassert på is.
- Forbered 10 ml av isolasjon medium i 50 ml sterilt konisk Falcon tube. Hold alle løsninger på is. Sterilisere saks (en buet, en rett), og tang (buede, Dumont No.7).
- 1-3 dager gamle neonatale mus skylles raskt i 75% etanol løsning for overflate sterilisering. Valper blir halshugget bruker steril saks (rette), og brystet åpnes langs brystbenet for å gi tilgang til brysthulen og hjertet (figur 1A, Supplemental Movie S1).
Teknisk kommentar: neonatale mus over 3 dager kan benyttes, men resulterer i færre levedyktige celler 2. - Hjerter er hentet fralegemet med buede saks og overføres umiddelbart inn i den bakterielle Skål inneholdende 1 x PBS (uten Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM, på is. Alle følgende trinn utføres i den sterile celle-kultur hette.
- Fjern lungevev, større skip (og atriene, om ønskelig). Vask hjerter i 1x PBS løsning (uten Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM (på isen) for å fjerne blod. Transfer vasket hjerter fra første fatet inn i andre bakterieskål inneholder 1x PBS (uten Ca 2 +, Mg 2 +) med 20 mM BDM (på isen) ved hjelp av pinsett eller en perforert skje (Figur 1B).
- Transfer rengjort / vasket hjerter i en dråpe av isolasjon medium (ca 250 mL, figur 1C) i en tredje bakteriell fatet (på isen) og bruke de buede saks å hakke hjerter i små biter (ca 0,5-1 mm 3, eller mindre; Figur 1D, 1E).
- Overfør hakket hjerter i en koniskrør inneholdende 10 ml av isoleringsmedium (på is), og inkuberes med forsiktig omrøring ved 4 ° C over natten.
Dag to.
2. Enzymatisk Tissue Fordøyelse og plating av celler
- Vei inn 15 mg kollagenase / dispase blanding (Roche), og oppløse enzymet blanding i 10 ml L15-medium 5 supplert med 20 mM BDM (fordøyelse medium). Sterile filter fordøyelsen medium i hetten cellekultur i en ny steril 50 ml Falcon-røret.
- Forbered 30 ml L-15-medium supplert med 20 mM BDM, og plette medium.
- Coat celle-kulturplater med kollagen-løsning (Sigma C-8919) i minst 1 time. Fjern kollagenløsning (kan brukes på nytt), og tørre kollagenbelagt celle-kultur retter i sterilt laminær strømningscelle-kultur hette.
- Fjern den koniske rør som inneholder predigested hjerter fra 4 ° C. Vev fragmenter bør samles (figur 1G). La vev fragmenter synke tili bunnen av røret og fjern supernatanten (sørge for ikke å miste noen vev fragmenter,. normalt, kan omtrent 1 ml av isolasjonsmedium forblir i røret). Tilsett 5 ml av fordøyelsen medium og 5 ml L-15 supplert med 20 mM BDM til vev fragmenter og oksygenat-suspensjon ved hjelp av oksygen eller luft i 1 min.
- Overfør til forseglede konisk rør inneholdende de kardiale vev fragmenter i fordøyelsesmedium til 37 ° C vannbad i omtrent 2 minutter for å justere temperaturen i opp-slutningsoppløsningen.
- Inkuber hjertevev fragmenter ved 37 ° C med forsiktig omrøring i 20 til 30 minutter (f.eks rister ved 37 ° C, satt til ikke mer enn 60rpm). Fordøyelse ganger kan i stor grad avhenge av enzymblandingen og lot-nummer Forsiktig:. Lengre inkubasjonsperioder eller høyere enzymkonsentrasjoner kan redusere celle levedyktighet.
Teknisk kommentar: Vi anbefaler bruk av en collage / dispase blanding fra Roche (Art.nr.: 10269638001) som har svært liten masse-til mye variasjon. Den klassiske enzym for isolering av mus kardiomyocytter er trypsin og / eller kollagenase type II 3,16-20 tilgjengelig fra Worthington (Cat No CLS-2). Imidlertid kan resultatene av collagenase II avvike vesentlig fra parti til parti. Worthington gir typisk for testing av flere kollagenaseklassene mye å optimalisere fordøyelsen ganger og enzymet bruk. Alternativt selger Worthington en cardiomyocyte isolasjon kit med en pre-testet enzym blanding inkludert som kan tilpasses for isolering av muse kardiomyocytter 17 (Cat nr: NCIS).
- Plasser sterile celle-sil (40-100 mikrometer nylon mesh) i friske sterile 50 ml konisk falk tube. Pre-våt celle sil med 5 ml L-15 supplert med 20 mM BDM. Forsiktig Triturer vev fragmenter ved hjelp av en forhåndsfuktet 10 ml cellekultur pipette i omtrent 10 til 20 ganger. De vev fragmenter bør hovedsakelig spre under dette trinnet, og slipper cellene i suspension (Figur 1H).
- La større vev fragmenter sedimenter og overføring supernatant som inneholder suspenderte celler i frisk konisk rør gjennom celle-sil (Figur 1I).
- Re-suspen ufordøyd vev fragmenter i 5 ml fordøyelse medium og inkuberes i ytterligere 5-10 minutter ved 37 ° C med forsiktig omrøring.
- Etter å fortsette fordøyelsen av gjenværende vev fragmenter, forsiktig Triturer vev for 10-20 ganger og legge til koniske rør som inneholder celler fra første fordøye gjennom celle sil. Skyll celle-sil med 5 ml L-15 supplert med 20 mM BDM å tillate passering av alle fordøyd celler.
- Sentrifugatet konisk rør som inneholder suspenderte cardiomyocytes for 5 min ved 300 rpm (ca. 50-100 xg). Fjern supernatanten (som inneholder det meste fibroblaster og endotelceller) og re-suspendere cellen pellet i 10 ml plating medium.
- Plate celler i 10 cm cellekultur fatet (Figur 2A) og inkuberes i en-3 Timer i cellekulturinkubator. Denne pre-plating trinnet fjerner fibroblaster og endotelceller (figur 2B), som vil følge den ubestrøket celle-kultur fatet (figur 2C).
- Etter inkubering vaskes ikke-adherente kardiomyocytter fra 10 cm dyrkningsskål (re-suspendere celler ved gjentatt pipettering pletteringsmedium over fatet), og overføre resuspenderte cellene til en steril koniske Falcon sentrifugerør (15 ml eller 50 ml).
Valgfritt: Gjenta pre-plating skritt for å fjerne flere fibroblaster fra celle-suspensjon. Hvis ønskelig, kan de adherente fibroblast-og endotelceller bli ytterligere kultivert. - Telle celler (for eksempel ved hjelp av Neubauer hemocytometer, trypanblått eksklusjon flekker 21).
- Plate celler i kollagen belagt cellekultur retter med en tetthet på ca 1,5 x 10 5 celler per cm 2 (figur 2D, se også kommentarer i tabell 1 på platingog belegg).
Plasser retter i cellekultur inkubator og la uforstyrret for 12-18 timer for å tillate tilslutning og spredning av kardiomyocytter.
Dag 3 - Kultur av neonatal cardiomyocytes
- Forbered vedlikehold medium og prewarm i 37 ° C vannbad. Se tabell 1 for tillegg av spredning hemmere eller kronotrope agenter, eller framgangsmåten for liposomalt transfeksjon av neonatale mus kardiomyocytter.
- En dag etter plating, bør kardiomyocytter har levd opp til cellekultur fatet og optimalt begynner spontant å trekke seg sammen (Figur 2E, 2F, Supplemental Movie S2, se tabell 2 for vanlige problemer under inngrepet isolasjon / kultur). Bytt plating medium med vedlikehold medium, og kultur for ytterligere 1-5 dager. Skift medium etter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, vi isolert hjerter fra åtte én dag gammel neonatal mus (figur 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Etter vasking og hakking hjerter med saksen (figurene 1C-1F), ble vev fragmenter predigested isolert medium over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Etter predigestion (fig. 1G), vi overført vev fragmenter inn i nylaget fordøyelse medium, og inkubert vevet fragmenter i 20 min ved 37 ° C med forsiktig omrøring. Den resulterende cellesuspensjonen (figur 1 H) ble filtrert gjennom en celle sil (fig. 1G). Etter sentrifugering ble de pelleterte cellene på nytt oppslemmet i 8 ml Plating medium og forhåndsbelagte inn i en 10 cm cellekultur tallerken (figur 2A), og dyrket i 2 timer for å tillate binding av kardiale fibroblaster og endotelceller (figurene 2B, 2C). Celler som ikke raskt fester var resuspendert inn i plating medium. 10 ul av cellesuspensjonen inneholdende cardiomyocytes ble pipetteted inn i et Eppendorf rør og farget med et trypan blue-løsning i forholdet 1:1. Cellene ble talt ved å bruke et automatisk celleteller, noe som resulterer i omtrent 5.1 x 10 5 levende celler / ml Plating medium. Etter telling ble cellene platet ut i fire 30 mm kollagen belagt celledyrkingsskåler (2 ml pr fatet), noe som resulterer i omtrent 1 x 10 6 belagte celler pr form (1,4 x 10 5 celler / cm 2, figur 2D). 18 timer etter plating ble kardiomyocytter festet til kollagen belagt celledyrkingsskåler (med omtrent 70% konfluens), og begynte spontant å trekke seg sammen (figur 2E, Supplemental film S2). Deretter ble kardiomyocytter enten brukt til liposomal transfeksjon (se tabell 1), eller cellene ble direkte overført fra plette inn i vedlikeholdsmedium (figur 2F) og kultivert i ytterligere tre dager. Etter kultur, ble kardiomyocytter kort vasket i 1x PBS, fast for 5 min i 4% PFA / PBS og behandles for immunfluorescens som beskrevet i en av våre nyere publikasjoner 22. Representative resultater som viser immunologisk farget untransfected og transfekterte cardiomyocyte kulturer er vist i figurene 2G og 2H, respektivt. De dyrkede neonatale cardiomyocytes viser den forventede cytoarchitecture, som fremgår av visualisering av myofibrils (rødt signal på figur 2G) og mellomlag skivelignende strukturer (grønt signal i figur 2G). De er også mottagelig for transiente transfections, som sett i figur 2 H (grønt signal er transfektert protein; røde signalkontrafarging av myofibrils ved hjelp av en alfa-sarcomeric actinin antistoff).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Figur 1. Isolering av hjertevevet fra neonatale mus. A) Hjertet er nøye fjernet fra thorax bruker buede tang (se også Supplemental Movie S1). B) Hjerter isolert fra åtte nyfødte er vasket i 1x PBS (uten Ca 2 +, Mg 2 +) supplert med 20 mM BDM på is. C) Hjerter blir overført til en dråpe av isolasjon medium. DE) Mincing av neonatal hjerter bruker buede saks. F) Overføring av kvernet hjertevevet ved hjelp av en pre-fuktet pipette. G) predigested hjertevev etter over-natt inkubasjon ved 4 ° C. H) Cardiomyocytes i suspensjon etter 20 min med fordøyelse og triturering. Ufordøyd hjertevev samler seg på bunnen av røret. I) Suspensjonen av isolerte cardiomyocytes filtreres gjennom en celle sil.
Figur 2. Culture of neonatale mus kardiomyocytter og representative immunofluorescence bilder. A) Plating av isolerte celler i begynnelsen av den pre-plating trinn. B) Hjerte fibroblaster og endotelceller begynner å følge den ubestrøket cellekultur fatet etter 1-3 timers av kulturen i løpet av pre-pletteringstrinnet. C) Etter resuspensjon av ikke-adherente cardiomyocytes, kan gjenværende kardiale fibroblaster og endotelceller bli ytterligere kultivert, hvis ønskelig. D) Plating av isolerte og rensede neonatale mus cardiomyocytes i kollagenbelagt celle-kultur retter . E) Etter 18 timer i kultur, kardiomyocytter holder seg til den belagt dønsker flere kvinner, og optimalt starte spontane sammentrekninger (se også Supplemental Movie S2). F) Skifte plating medium med vedlikehold medium fjerner døde celler fra kulturen. A)-F) Scalebar 0,2 mm. G) Representant immunfluorescens bilde av neonatale mus cardiomyocytes, farget med antistoffer mot myomesin (Developmental Studies hvbridom Bank, Iowa, mMaC myomesin B4, i rødt) og beta-catenin (Sigma, Kat.-Nei .: C2206, i grønt). Scalebar 10 mikrometer. H) Representant immunfluorescens bilde av transfekterte neonatale mus cardiomyocytes med den uttrykte GFP-tagget protein i grønt (GFP-titin-N2B fragment), og alfa-actinin (Sigma, Kat.-No.A-7811) i rødt . Scalebar 20 mikrometer. En fremgangsmåte for transfeksjon og immunologisk farging anvendes i 2G) og 2H) finnes i Tabell 1, og er sammenfattet i et av de nyere publikasjoner 22.
Supplemental Movie S1. Supplemental Movie S2. Klikk her for å vise supplerende filmen . Tabell 1. Optimalisering av plating og kulturforhold, liposomal transfeksjon. Tabell 2. Feilsøking. Mange faktorer kan påvirke vellykket isolasjon og kultur av primær celles. Vennligst ta kontakt med manualer som "Culture of Animal Cells" av Ian Freshney 21, som generelle introduksjoner til grunnleggende cellekulturteknikker. Mulige årsaker til problemer i isolasjon og kultur procedur av neonatale mus cardiomocytes som vi møtte oftest er oppført i denne tabellen. Pre-plating Pre-plating av cellene etter isolering i stor grad fjerner kardiale fibroblaster og endotelceller fra hele celleblanding. En enkelt pre-plating trinnet fjerner omtrent 50 til 80% av ikke-kardiomyocytter fra celle-populasjonen. Repetisjon av pre-plating mer enn to ganger, så vel som av pre-pletteringstider som er lengre enn 3 timer, anbefales ikke på grunn av ekstra tap av hjertemuskelceller. Substitusjon av pre-pletteringen med Percoll-gradient 23,24 kan forbedre renheten av cardiomyocyte cellepopulasjon. Belegg og cellekultur underlaget Belegg av celle-kultur retter med extracellular matrix (ECM) komponenter som kollagen, fibronectin, laminin, komplekse ECM blandinger (dvs. matrigel 25,26) eller kunstig underlag (dvs. silikon polymer 27, organosilan 28) positivt påvirker cardiomyocyte tilslutning, celle levedyktighet og celle spredning i løpet av første galvaniseringstrinn , og for den etterfølgende kulturperiode. Spesielt kultur av kardiomyocytter på glass-substrater krever belegging av overflaten med ECM-komponenter for å oppnå riktig tilslutning av kardiomyocytter.
Vi testet belegg av cellekultur behandlet plast og glass-substrater med en rekke ulike ECM-komponenter, inkludert 0,1% kollagen-løsning (Sigma C-8919), 3 mg / ml kollagen type 1 løsning (Advanced BioMatrix, PureCol), 1% gelatin-oppløsning ( Sigma G9391; oppløst i H 2 O, autoklaveres), Laminin løsninger (Sigma L4544), eller komplekse ECM blandinger avledet fra gris hjerter 29 eller hjerte fibroblaster 30. Cell Culture retter ble inkubert med ECM-løsninger for et minimum av 1 time til over natten i cellekulturinkubator, og etter fjerning av ECM tørket i laminær celle-kultur hette. ECM-løsninger kan brukes om igjen mange ganger (10-20 ganger) hvis sterilitet og ECM protein integritet under langvarig lagring opprettholdes (f.eks lagring ved 4 ° C eller frosset). Forsiktig, på grunn av den sure karakter av noen av de buffere som brukes for å oppløse ECM-proteiner, vasking av kultur retter med 1 x PBS etter at belegget kan være nødvendig før plettering av cellene. Plating teknikk og tetthet Avhengig påfølgende analyser, bør optimal cellekonsentrasjonen for plating resultere i nær-konfluent cardiomyocyte monolayers. Plating av cardiomyocytes ved høye konsentrasjoner føre til flerlags cardiomyocyte aggregater og lav homogenitet, mens lave konsentrasjoner reduserer celle levedyktighet og resultater i enkeltrom, isolerte cardiomyocytes blottet for spesialisert celle-celle kontaktetts (intercalated disk-lignende strukturer). Ved pipettering av celler for plating husk at cardiomyocytes er ganske store og tunge, og har en tendens til å konsentrere seg på bunnen av Falcon-røret. Resuspensjon av celler i mellom plating trinn sikrer jevn fordeling av celler i hele oppvasken. Når Plating celler beveger retter i form av et tall "8" for å unngå konsentrasjon av cellene i sentrum av skålen. Den optimale confluency av neonatal cardiomyocytes utpekt for liposomalt transfeksjon bør være rundt 70-80% dagen etter plating. Serum Bruken av cellekultur testes føtal (eller nyfødt) bovint serum-og hesteserum i pletteringsmedium som er nødvendig for celle-levedyktighet, og vedheftningen av kardiomyocytter under pletteringstrinnet. Kvaliteten på det anvendes serum kan være en av de kritiske trinn under prosedyren plating / kultur. Tilskudd av vedlikeholdsmediet med lave mengder av serum er valgfri, kan imidlertid i stor grad forbeve varigheten av kultur tid.
Forsiktig: tillegg av serum kan betydelig endre biokjemiske signalveier i dyrkede cardiomyocytes og kan bli dømt i forhold til eksperimentelle parametre, hypotese og påfølgende tolkning av resultatene. Serumfrie kulturer av kardiomyocytter er blitt beskrevet 10,31, og kan forhindre forskyvning av resultater på grunn av ukjente vekstfaktorer som er tilstede i serumet. Sprednings hemmere Terminalt differensiert cardiomyocytes vanligvis ikke gjennomgå celle-delingen. Men, tillegg av spredning hemmere, som 10 mikrometer Arac (Cytosine-BD-arabino-furanoside hydroklorid; Sigma C6645) er til vedlikehold medium sterkt anbefalt for å hindre spredning av hjerte fibroblast og endotelceller. Selv med tilsetning av pre-pletteringsfremgangsmåten for å redusere populasjonen av kardiale fibroblaster og endotelceller, vil de resterende fibroblaster gjennomgå celle proliferation og vesentlig endring av den kultiverte celle-befolkningen over tid.
Forsiktig: avhengig av genetiske faktorer og isolasjon tid-point, embryonale og neonatale mus kardiomyocytter kan fortsatt ha spredning potensial 23,32,33. Bruk av Arac bør bli dømt avhengig av eksperimentelle parametre, hypotese og tolkning av resultatene. Tilsetting av kronotrope agenter Tilskudd av vedlikeholds medium med agenter 34, for eksempel fenylefrin (0,1 mM, fortrinnsvis for neonatal rotte cardiomyocytes; Sigma P6126), eller isoproterenol (1 mikrometer, fortrinnsvis for neonatale mus kardiomyocytter; Sigma I6501) øker sarcomerogenesis, spredning av cardiomyocytes på plate, så vel som spontane slåing av celler. Imidlertid bør tilsetningen av disse midler veies med hensyn til ønskede analyseparametre (f.eks tillegg kan forskyve kontraktile oppførsel og biokjemiske parametere). Transfeksjon Liposomal transfeksjon av DNA / RNA inn i neonatale mus cardiomyocytes er i stor grad avhengig av transfeksjon tid-punkt, transfeksjon reagens, kulturtetthet, DNA / RNA-konsentrasjon og brukes DNA-konstruksjon. Vi testet en rekke liposomholdige transfeksjon reagenser og fant ESCORT III (Sigma) og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som gjelder. Transfektere celler 24 timer etter plating ved å erstatte pletteringsmediet 2 timer før transfeksjon med antibiotika fri opprettholdelsesmedium. For transfeksjon av neonatal cardiomyocytes dyrket i 30 mm retter, bland 1-2 mikrogram DNA med 200 mL DMEM i en steril Eppendorf rør, og legge 4 mL av Escort III til den fortynnede DNA blandingen. Bland forsiktig og inkuberes i minst 5 min i steril hette for å tillate DNA / liposom-kompleksdannelse. Erstatte antibiotika fritt vedlikehold medium med 800 mL frisk antibiotika-free vedlikehold medium og tilsett DNA / liposome blandingen til cellene. Inkuber cellene i celle cuLTURE kuvøse og erstatte med frisk standard vedlikehold medium etter 24 timer. Et representativt resultat for med hell transfektert neonatale mus cardiomyocytes er vist i figur 2H. Transfeksjon ved hjelp av kalsium-utfelling av DNA er også mulig. Transfeksjon av neonatale mus kardiomyocytter er vanskeligere sammenlignet med neonatale rotte cardiomyocytes, med typisk transfeksjon effektivitet strekker 1-20%. Virale vektorer som er nødvendig for å oppnå høyere effektivitet 35-37 (f.eks: adenovirus, adeno-assosiert virus, lentivirus). Electroporation av neonatal cardiomyocytes er i våre hender uegnet for levering av DNA / RNA, men flere rapporter viser suksess ved hjelp electroporation av embryonale og neonatal cardiomyocytes 38,39. I en fersk artikkel 38, Djurovic et al. Oppsummere flere transfeksjonsmetoder, suksessrate så vel som sine fordeler og ulemper. Aging Frysing / Storaseri Aging av cardiomyocytes er ikke anbefalt en. Frysing av isolerte neonatal cardiomyocytes for langvarig lagring er ekstremt vanskelig og anbefales ikke på grunn av lav effektivitet og lav utvinningsgrad. Flere selskaper tilbyr spesialiserte fryse medium for menneske cardiomyocyte primærkulturer (f.eks celprogen, katt. Nei. M36044-15FM) som også kan være egnet for nedfrysing av neonatal mus cardiomyocytes, men forholdene kan være nødvendig å være optimalisert. Den vellykkede aging og nedfrysing av atriale cardiomyocytes er blitt beskrevet i en transgen musemodell 32. Ingen levedyktige eller heftende celler en dag etter plating - Redusere enzymkonsentrasjon og / eller fordøyelse gang
- Endring enzym blanding
- Change serum for plating medium
- Endring ECM / belegg medium og / eller type celle kultur retter
- Legge til 20 mM BDM til isolasjon / fordøyelse media
- Sjekk for forurensning av celler Lav celle avkastning - Øke fordøyelse tid og / eller enzym-konsentrasjon
- Økningen sentrifuge tid / hastighet under isolasjon prosedyre
- Økningen trituration periode Konfluens av celler i kultur er for lav / høy; ujevn plette - Telle celler i løpet av isolasjonsprosedyren og justere antall celler / fatet under pletter
- Juster plating konsentrasjon
- Nøye resuspender cellen pellet etter sentrifugering og før plating ved gjentatt pipettering (dag 2 trinn 13), sørg for at ingen synlige celle-klumper forbli Ingen slo celler - Legg kronotrope agenter til vedlikehold medium (f.eks: fenylefrin, isoproterenol)
- Erstatte medium
- Check for høyt antall kardiale fibroblaster / endotelceller Høyt antall fibroblaster - Legge til ekstra forhåndspålegg trinnet under isolasjon prosedyre
- Legg proliferasjonsinhibitor til vedlikehold medium (Tabell 1) Mange døde celler - Erstatte cellekulturmedium
- Redusere enzymkonsentrasjon og / eller fordøyelse tid under isoleringsprosedyren
- Sjekk cellekultur inkubator (CO 2, temperatur, fuktighet)
- Sjekk for forurensning Forurensning - Holde sterile cellekultur arbeidsvilkår 21
- Erstatte medium, bruke ny penicillin / streptomycin løsning
- Overflaten sterilisere neonatal mus med 75% etanol løsning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av dyremodeller for å undersøke hjertesykdommer er blitt standard i hjerte-forskning. Nærmere biokjemiske karakterisering av disse modellene (dvs. å studere direkte responsene til hjerteceller for biokjemiske eller biomekaniske stimuli) krever typisk isolering av hjerte-vev eller kardiomyocytter. Studier som undersøker fysiologiske responser av hjertet ex vivo (f.eks til acetylkolin 40, eller i iskemi-reperfusjon scenarier 41) generelt utnytte Langendorff-perfundert hele hjerter 42,43, mens eksplantering kulturer 44,45 av kardiale vev fragmenter åpner for undersøkelser av cardiomyocytes i en tre-dimensjonale vev miljø. Imidlertid dyrkning eksplantering vev kan hindre diffusjon av næringsstoffer, som potensielt kan skape en nekrotisk klynge i kjernen av vevet. Videre cardiomyocytes er immobile i vevet, således migrering av celler av eksplantater er bare observed for ikke-cardiomyocytes, som fibroblaster eller antatte hjerte stamceller 44. Gransker utviklings, cellebiologisk, biokjemisk og biofysiske oppførsel av kardiomyocytter kreves derfor etablering av isolasjon og dyrking prosedyrer. Tidlige protokoller for isolering og kulturen i pattedyr cardiomyocytes utnytte nyfødte rotter 1,2. Men økningen av mus som modellsystem for genetiske studier (dvs. genmodifisert knock-in eller knock-out mus) nødvendiggjort tilpasning av den etablerte isolasjon og dyrking metoder. Dessverre, er isolering av neonatale mus kardiomyocytter spesielt utfordrende i forhold til at av de mer tradisjonelt brukt neonatal rotte cardiomyocytes. Den fremlagte protokoll beskriver en pålitelig og robust fremgangsmåte som er optimalisert for isolering og kulturen i neonatale mus kardiomyocytter. Vi beskriver de nødvendige skritt for første vev utvinning, for dissosiasjon ennd rensing av kardiomyocytter fra hjerte fibroblaster og endotelceller, og for plette og dyrkningsbetingelser. Mens protokollen har en grunnleggende metode til isolering og kulturen i neonatale mus cardiomyocytes under standardforhold, kan den lett tilpasses for isolering og kulturen av neonatal rotte cardiomyocytes, så vel som for bestemte påfølgende analysetyper: for eksempel kultur av de isolerte cellene på fleksible membraner (f.eks Bioflex kultur plater) for å undersøke biomekaniske egenskaper, kultur i glassbunn retter (Mattek) for live-cell imaging, eller kultur av cardiomyocytes i xCELLigence cardio e-plater (Acea, Roche, Cat.-No.: 06417051001) å studere effekter av legemidler på kontraktile funksjoner. Videre tilbyr vi muligheter for optimalisering av isolasjon og kultur prosedyre og diskutere kilder for mulige problemer og deres løsninger. Derfor bør denne protokollen hjelpe forskere å undersøke en up-to-date, reproduserbar ogrimelig metode for å forberede nyfødte mus cardiomyocyte kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til professor emeritus Jean-Claude Perriard og Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Sveits) for innføring i isolasjon teknikker for neonatal rotte og mus kardiomyocytter. Vi vil gjerne takke Prof Ju Chen og professor Sylvia Evans (UCSD, USA) for deres støtte. Arbeidet i laboratoriet av EE ble finansiert av en MRC Career Etablering Grant. SL er støttet av en K99/R00 vei til uavhengighet award fra NIH / NHLBI (HL107744). TMM ble støttet av en postdoktorstilling fra American Heart Association (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
