Summary
Первичные культуры мыши кардиомиоцитов являются одним из ключевых инструментов для исследования миофибриллярного организации и функции. Следующий протокол описывает выделение и культуру первичных кардиомиоцитов из неонатальных мышиных сердцах. Полученные культуры кардиомиоцитов, может быть впоследствии использованы для различных биомеханических, биохимических и клеточных биологических анализов.
Abstract
Искусственный неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для изучения myofibrillogenesis и миофибриллярные функции. Искусственный кардиомиоциты позволяют легко расследования и манипуляции биохимических путей, и их влияние на биомеханических свойств спонтанно избиении кардиомиоцитов.
Следующий протокол уровня 2-дневного описывает выделение и культуру неонатальных кардиомиоцитов мыши. Мы покажем, как легко препарировать сердца от новорожденных, отделить сердечную ткань и обогатить кардиомиоциты от сердечной клетки-населения. Обсуждается использование различных ферментных смесей для клеток-диссоциации, и их влияние на клетки-жизнеспособности. Выделенные кардиомиоциты могут быть впоследствии использованы для различных морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических или-биомеханические анализов. Мы оптимизировали протокол для надежности и воспроизводимости, с помощью только имеющиеся в продаже решений и фермент смешивает, что шой немного партии к партии изменчивость. Мы также решения общих проблем, связанных с изоляцией и культуры кардиомиоцитов, и предлагают различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.
Introduction
Самые ранние сообщения для успешного диссоциации и культуры клеток сердца грызунов восходит к 1960-х годов 1,2. Даже тогда, Харари и Фарли заметил, что культивируемые кардиомиоциты »вправе оказывать уникальную систему для изучения требований периодической сократительной [и может] обеспечивают средства определения вклада различных метаболических путей для [бьющегося] процесс". Хотя Харари и Фарли выделяют и культивируют кардиомиоциты от молодых крыс и оригинального протокола была адаптирована и изменение многими учеными на протяжении многих лет, общий порядок выделения и культивирования не сильно изменилась. Тем не менее, лучше ферменты 3, стандартизованные растворы 4,5, и добавление обратимого ингибитора канала и миозин АТФазы БДМ, чтобы защитить клетки во время процедуры выделения 6-9 значительно улучшилось сотовый выход и жизнеспособность.
Взрослый против новорожденных кардиомиоцитовциты
Кардиомиоциты выделяют и культивируют с новорожденных мышей или крыс имеют ряд преимуществ перед культур взрослых кардиомиоцитов. Прежде всего, процедура изоляции для новорожденных мыши или крысы сердца легче и дешевле, по сравнению с выделением кардиомиоцитов из взрослой мыши или крысы 10. Неонатальные кардиомиоциты гораздо менее чувствительны к реинтродукции в кальция среде, содержащей после диссоциации, что значительно увеличивает выход сотовый. Другим большим преимуществом является то, что неонатальные кардиомиоциты мыши подвергаются более быстрому дедифференцировки - повторной дифференцировки цикл, который обычно приводит к спонтанно бить элементов 20 час после посева, в то время как взрослые кардиомиоциты обычно требуют ходить, чтобы вызвать сокращение. Новорожденных кардиомиоцитов также более легко transfectable с методами липосомальный трансфекции, в то время как взрослые кардиомиоциты требуют вирусных векторов для успешной сдачи трансгенной ДНК. В отличие от новорожденных кардиомиоцитовс, культура взрослых грызунов кардиомиоцитов 11-13 позволяет для исследования миофибриллярного деградации и в конечном итоге восстановления сократительного аппарата. Эти характерные морфологические изменения у взрослых кардиомиоцитов происходить в течение периодов 1-2 недель. Дедифференцировка - цикл повторной дифференцировки сопровождается reexpression программы генной плода, тем самым имитируя патологические изменения, наблюдаемые в человека кардиомиопатии 14. Еще одним преимуществом взрослых кардиомиоцитов крыс через культуре неонатальных кардиомиоцитов является способность культуры эти клетки в течение длительных периодов времени.
Крыса против кардиомиоцитов мыши
Выделение и культура крыс неонатальных кардиомиоцитов имеет некоторые преимущества по сравнению с, что из мыши неонатальных кардиомиоцитов, в том числе более высокий выход жизнеспособных клеток и увеличение ставок трансфекции. Тем не менее, широкое использование генетически модифицированных моделях мыши для сердечных заболеваний (например, </ EM> мышца Ит белок нокаут мыши в качестве модели для дилатационной кардиомиопатией 15) привело к адаптации процедуры выделения для кардиомиоцитов, полученных из новорожденных мышей. Хотя протоколы, используемые для изоляции новорожденной крысы и мыши кардиомиоцитов почти идентичны, больше необходимо позаботиться в подборе подходящей смеси ферментов для последнего. Действительно, неонатальные кардиомиоциты мыши, как правило, более чувствительны к избытком, что приводит к снижению клеточной жизнеспособности и выходом. Кроме того, плотность покрытия должна быть скорректирована, так как кардиомиоциты, полученные из новорожденных мышей несколько меньше по сравнению с клетками, полученными от новорожденных сердцах крыс.
С многих применений для исследования морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических и биомеханических параметров, а также для процесса myofibrillogenesis, культивированный неонатальные кардиомиоциты стали одним из самых универсальных систем для изученияфункции клеток сердца в пробирке. Первый шаг к успешному анализе однако, зависит от простой и надежный методологии выделения неонатальных кардиомиоцитов мыши. Наш протокол рисует свою методологию из многих источников и была оптимизирована для воспроизводимости и надежности. Мы обсуждаем факторы, влияющие на кардиомиоциты выход и жизнеспособность, а также обеспечить различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующая процедура описывает протокол 16,17 двухдневный для изоляции и культуре неонатальных кардиомиоцитов мыши. Все растворы должны быть стерильными или стерильно фильтруют. Все инструменты стерилизуют путем стерилизации поверхности 75% этанолом. Для первоначальной экстракции тканей, все остальные этапы выполняются в стерильных капот ламинарного потока клеточной культуры. Этот протокол предназначен для выделения новорожденных сердцах мыши с одного-двух помета (ы) - примерно 5-14 детенышей, но могут быть приспособлены для больших размеров для мусора и крыс неонатальных кардиомиоцитов. Использование Масштаб СМИ / фермент при необходимости.
Для работы с новорожденных грызунов, обратитесь к местным принципов вузов и правилами, установленными законодательным органом и / или программ по уходу за животными, и придерживаться вашей институционально утвержденным протоколом животных. Все способы, описанные в этом протоколе были одобрены на уходу и использованию животных комитета UC San Diego институционального (IACUC) на, и придерживаться ФедеRAL и государственное регулирование.
День 1.
1. Выделение сердечной ткани от новорожденных мышей
- Подготовка 50 мл 1x PBS (без Ca 2 +, Mg 2 +) с добавлением 20 мМ BDM 6-8, и развею на две стерильные бактериальных блюд помещают на лед.
- Подготовка 10 мл изоляции среды в 50 мл стерильной конической трубки сокола. Храните все решения на льду. Стерилизовать ножницы (одна изогнутая; одна прямая) и щипцы (изогнутые, Дюмон № 7).
- 1-3 дней новорожденных мышей быстро промывают в 75% растворе этанола для стерилизации поверхности. Щенки обезглавлен с помощью стерильных ножниц (прямые), и грудь открыта вдоль грудины чтобы разрешить доступ к грудной полости и сердце (рис. 1А, дополнительный Movie S1).
Технический комментарий: новорожденных мышей старше 3-х дней могут быть использованы, но привести к уменьшению числа жизнеспособных клеток 2. - Сердца извлекаются изкорпус с изогнутыми ножницами и сразу же передана в бактериальную чашку, содержащую 1X PBS (без Ca 2 +, Mg 2 +) с 20 мМ БДМ, на льду. Все последующие шаги выполняются в стерильной культивирования клеток капотом.
- Удалить легочной ткани, более крупные суда (и предсердий, при желании). Вымойте сердца в растворе 1x PBS (без Ca 2 +, Mg 2 +) с 20 мМ BDM (на льду), чтобы удалить кровь. Передача промывали сердца от первого блюда во второй бактериальной блюдо с 1x PBS (без Ca 2 +, Mg 2 +) с 20 мМ BDM (на льду) с помощью щипцов или перфорированной ложкой (рис. 1В).
- Очистить Передача / мыть сердца в каплю изоляции среды (примерно 250 мкл; Рисунок 1C) в третьей бактериальной блюдо (на льду) и использовать изогнутые ножницы, чтобы пропустить через мясорубку сердца на мелкие кусочки (примерно 0,5-1 мм 3, или более мелкие; Рисунок 1D, 1E).
- Трансфер фарш сердца в коническойтрубку, содержащую 10 мл среды изоляции (на льду), и инкубируют при осторожном перемешивании при 4 ° С в течение ночи.
День 2.
2. Ферментативный ткани Пищеварение и покрытие элементов
- Взвешивание 15 мг коллагеназы / диспаза смеси (Roche) и растворяют в смеси ферментов в 10 мл L15-среднего 5, дополненной 20 мМ БДМ (пищеварение среды). Стерильный фильтр пищеварение среда в капот культуре клеток в новый стерильный 50 мл сокола трубки.
- Подготовка 30 мл L-15 среду, дополненную 20 мМ БДМ, и плакировка среды.
- Coat клеток культуральные планшеты с коллагеном раствора (Sigma C-8919) в течение минимум 1 часа. Удалить раствора коллагена (можно использовать повторно) и сухие коллагеновые покрытием клеток-чашки для культивирования в стерильной культивирования клеток ламинаре.
- Снимите коническую трубку, содержащую приготовленный к употреблению сердца от 4 ° С. Фрагменты тканей должны объединяться (рис. 1 г). Пусть фрагменты ткани опускаются нав нижней части трубки и удалите супернатант (убедитесь, что не потеряете никаких фрагментов тканей;. обычно, около 1 мл изоляции среды могут оставаться в трубке). Добавить 5 мл пищеварения среды и 5 мл L-15 с добавлением 20 мМ БДМ для фрагментов ткани и кислородсодержащих подвески с использованием кислорода или воздуха в течение 1 мин.
- Передача герметичную коническую пробирку, содержащую фрагменты сердечной ткани в пищеварении среды до 37 ° С на водяной бане в течение примерно 2 мин, чтобы отрегулировать температуру варки раствора.
- Инкубировать фрагменты сердечной ткани при 37 ° С при осторожном перемешивании в течение 20-30 мин (например шейкере при 37 ° С, установлен на не более чем 60rpm). Раз пищеварения может сильно зависеть от смеси ферментов и номер партии. Внимание: более длительные периоды инкубации или более высокие концентрации фермента может уменьшить жизнеспособность клеток.
Технический комментарий: Мы рекомендуем использование в коллагеназы / диспаза смеси от Roche (Cat.No.: 10269638001), что имеет очень мало изменчивость от партии к партии. Классическая фермент для выделения кардиомиоцитов мыши является трипсин и / или коллагеназы типа II 3,16-20 доступны Уортингтон (Cat Нет CLS-2). Тем не менее, производительность коллагеназы II могут существенно отличаться от партии к партии. Уортингтон обычно позволяет проводить тестирование нескольких коллагеназы большим оптимизации раз пищеварения и фермента использование. Кроме того, Уортингтон продает набор для выделения кардиомиоцитов с предварительно протестированных смеси ферментов включены, которые могут быть адаптированы для выделения кардиомиоцитов мыши 17 (Кот-номер: NCIS).
- Наведите стерильную сотовый сетчатый фильтр (40-100 нейлоновая сетка мкм) в свежих стерильных 50 мл коническую трубки сокола. Предварительно мокрой сотовый фильтр с 5 мл L-15 с добавлением 20 мМ БДМ. Осторожно растирают фрагменты ткани с использованием предварительно смоченный клеточной культуры пипетки 10 мл в течение приблизительно 10-20 раз. Фрагменты ткани должны в основном расходятся на этом этапе, выпуская клетки в SuspensioN (рис. 1H).
- Пусть крупные фрагменты ткани осадок и передачи супернатант, содержащий взвешенные клетки в свежей коническую трубку через клеточную ситечко (рис. 1и).
- Повторное приостановить фрагменты непереваренные ткани в 5 мл среды пищеварения и инкубировать в течение дополнительных 5-10 минут при 37 ° С при осторожном перемешивании.
- После продолжающегося переваривания оставшихся фрагментов ткани, мягко растирают ткани для 10-20 раз и добавить в коническую трубку с клетками из первой переварить через ячейки фильтра. Промыть фильтр-клеток 5 мл L-15 с добавлением 20 мМ БДМ, чтобы позволить прохождение всех переваренных клеток.
- Центрифугат коническую трубку содержащие взвешенные кардиомиоцитов в течение 5 мин при 300 оборотах в минуту (около 50-100 мкг). Удалить супернатант (содержащий в основном фибробласты и эндотелиальные клетки) и повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл среды обшивки.
- Пластина клеток в 10 см клеток блюдо культуры (рис. 2А) и выдержать в течение 1-3 Часа в инкубаторе клеточной культуре. Эта стадия предварительной покрытие удаляет фибробласты и эндотелиальные клетки (фиг.2В), который будет прилипать к непокрытой клеточной культуральной чашке (рис. 2в).
- После инкубации промыть неадгезированных кардиомиоцитов от 10 см культуральной чашке (повторно приостановить клеток путем многократного пипетки металлизации среды через тарелки), и передачи ресуспендировали клетки в стерильную коническую центрифужную пробирку Фалькон (15 мл или 50 мл).
Дополнительно: Повторите шаг до обшивки для удаления дополнительных фибробласты из клеток-подвески. Если желательно, прилипшие фибробластов и эндотелиальных клеток может быть дополнительно культивировали. - Граф клеток (например, с помощью Нейбауера гемоцитометра, трипанового синего окрашивания 21).
- Пластина клеток в коллаген покрытием клеточных культур блюд с плотностью примерно 1,5 х 10 5 клеток на см 2 (рис. 2D, см. также комментарии в таблице 1 на обшивкеи нанесение покрытий).
Поместите посуду в инкубаторе для культивирования клеток и оставить в покое на 12-18 часов, чтобы обеспечить соблюдение и распространение кардиомиоцитов.
День 3 - Культура неонатальных кардиомиоцитов
- Подготовить среду обслуживания и prewarm в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 для добавления ингибиторов пролиферации или хронотропных агентов, или порядок липосомальной трансфекции неонатальных кардиомиоцитов мыши.
- Однажды после посева, кардиомиоциты должны присоединились к клеточной культуры блюдо и оптимально начать спонтанно сокращаться (рис. 2E, 2F; Справочная фильм S2; см. Таблицу 2 для общих проблем во время процедуры изоляции / культура). Заменить покрытие среду с поддерживающей среде и культуре для дополнительных 1-5 дней. Изменение среды по мере необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы изолировали сердца от 8 однодневных новорожденных мышей (Фигуры 1A, 1B, Дополнительное Movie S1). После промывки и мясорубки сердца с ножницами (Цифры 1С-1F), фрагменты ткани были приготовленный к употреблению в изоляции среды в течение ночи при 4 ° С при осторожном перемешивании. После обработку залитых (рис. 1G), мы передали фрагменты тканей в свежеприготовленный пищеварения среды, и инкубировали фрагменты ткани в течение 20 мин при 37 ° С при осторожном перемешивании. Полученную суспензию клеток (рис. 1H) фильтровали через ячейки сетчатого фильтра (фиг. 1G). После центрифугирования осажденные клетки ресуспендировали в 8 мл среды и обшивки preplated в чашку культуральной 10 см клеток (рис. 2а), и культивировали в течение 2 часов для обеспечения прикрепления сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток (фиг. 2В, 2С). Клетки, которые не быстро прикрепить были повторноприостановлено в гальванической среды. 10 мкл клеточной суспензии, содержащей кардиомиоциты был pipetteted в пробирку Эппендорфа и окрашивали трипановым синим раствора в соотношении 1:1. Клетки подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток, в результате чего примерно 5,1 × 10 5 живых клеток / мл обшивки среды. После подсчета, клетки высевали на четыре 30 мм покрытые коллагеном клетки культуральные чашки (2 мл на чашку), в результате чего примерно 1 × 10 6 плакированных клеток на чашку (1,4 х 10 5 клеток / см 2; рис 2D). 18 ч после посева, кардиомиоциты были прикреплены к коллагеновых покрытием клеточных культур блюд (с примерно 70% слияния) и начал сокращаться самопроизвольно (рис. 2E, дополнительный Movie S2). Впоследствии кардиомиоциты были либо используется для липосомального трансфекции (см. таблицу 1) или клетки, непосредственно переносится с покрытием в поддерживающую среду (рис. 2F) и культивировали в течение еще 3 дней. После культуры, кардиомиоциты быстро промывают в 1x PBS, фиксированной в течение 5 мин в 4% PFA / PBS и обрабатывали для иммунофлуоресценции, как описано в одном из наших последних публикаций 22. Представитель результаты изображающие иммунологически окрашенных нетрансфицированные и трансфицированные культуры кардиомиоцитов показаны на рисунках 2G и 2Н соответственно. Культивированные неонатальные кардиомиоциты отображения ожидаемого цитоархитектуры, как это видно из визуализации миофибрилл (красный сигнал на рисунке 2G) и интеркалированном дискообразных структуры (зеленый сигнал на рисунке 2G). Они также поддаются временной трансфекции, как показано на Рисунке 2H (зеленый сигнал трансфицировали белок, красный сигнал контрастного миофибрилл с использованием антитела актинина саркомера альфа-).
"FO: Пребывание" / files/ftp_upload/50154/50154fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50154/50154fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Выделение сердечной ткани от новорожденных мышей.) Сердце осторожно удаляют из грудной клетки с помощью изогнутых щипцов (см. также Дополнительного Movie S1). Б) Сердечки, выделенные из 8 новорожденных промывают в 1x PBS (без Ca 2 +, Mg 2 +) с добавлением 20 мМ БДМ на льду. C) Сердца передаются в каплю изоляции среды. DE) Mincing неонатальных сердцах использованием изогнутые ножницы. F) передача фарша сердечной ткани с использованием предварительно смоченный пипетки. G) приготовленный к употреблению сердечной ткани после над-ночь инкубации при 4 ° С. H) кардиомиоцитов в суспензии после 20 мин пищеварения и растирания. Непереваренные сердечной ткани накапливается в нижней части трубы. I) суспензии изолированных Cardiomyocytes фильтруют через ячейки сетчатого фильтра.
Рисунок 2. Культура неонатальных кардиомиоцитов мыши и представительств иммунофлюоресценции изображений.) Покрытие изолированных клеток в начале предварительного обшивки шаг. B) Сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки начинают придерживаться непокрытой блюдо культуре клеток через 1-3 часа культуры в ходе предварительного обшивки шаг. C) После ресуспендирования неадгезивных кардиомиоцитов, остальные сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки могут быть дополнительно культивировали, если это необходимо. D) Покрытие из изолированных и очищенных неонатальных кардиомиоцитов мыши в коллагеновых покрытием клеточной культуры блюд . Е) Через 18 часов в культуре, кардиомиоциты придерживаться г покрытиемгибнет, а оптимально начать спонтанных сокращений (см. также Справочная Movie S2). F) Замена обшивки среду с поддерживающей среде удаляет мертвые клетки из культуры. Представитель)-F) Масштабная линейка 0,2 мм. G) иммунофлюоресценции образ неонатальных кардиомиоцитов мыши, окрашенных с антителами против myomesin (Развивающие Исследования гибридом банк, Айова, MMAC myomesin B4, в красном) и бета-катенин (Sigma, кат-Нет .: C2206, в зеленый цвет). Масштабная линейка 10 мкм. H) представитель иммунофлюоресценции образ трансфектированных неонатальных кардиомиоцитов мышей с выраженным GFP с метками белка в зеленой (GFP-тайтин-N2B фрагмент), и альфа-актинина (Sigma, кат-No.A-7811) в красном . Масштабная линейка 20 мкм. Способ трансфекции и иммунологического окрашивания, используемой в 2G) и 2Н), можно найти в таблице 1, и обобщены в одном из последних публикаций 22.
Справочная фильм S1. Справочная фильм S2. Нажмите здесь, чтобы посмотреть дополнительную фильм . Таблица 1. Оптимизация гальванических и культуры условиях, липосомальный трансфекции. Таблица 2. Поиск и устранение неисправностей. Многие факторы могут повлиять на успешное изоляцию и культуру первичной ячейкис. Пожалуйста, обратитесь пособия, такие, как «Культура клеток животных" Ян Freshney 21, как общих введениях в основных методов культивирования клеток. Возможные причины проблем в изоляции и культуры procedur новорожденных cardiomocytes мыши с которыми мы столкнулись чаще всего представлены в этой таблице. Предварительно покрытие Предварительно покрытие из клеток после выделения значительно снимает сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки из смеси цельных клеток. Один шаг до обшивки удаляет около 50-80% лиц, не являющихся кардиомиоцитов из сотового населения. Повторение предварительно покрытие более чем в два раза, а также предварительно гальванических раз дольше, чем 3 часа не рекомендуется, из-за дополнительной потери кардиомиоцитов. Замена предварительной металлизации с Перколла градиента 23,24 может улучшить чистоту кардиомиоцитов клеточной популяции. Покрытие и культуры клеток подложки Покрытие клеточной культуры блюд с эксвнеклеточного матрикса компоненты (ECM), как коллаген, фибронектин, ламинин, сложных ECM смесей (т.е. Матригель 25,26) или искусственных субстратах (т.е. силиконового полимера 27, органосиланового 28) положительно влияет кардиомиоцитов приверженность, жизнеспособность клеток и распространения клеток во время начальной стадии металлизации и на последующий период культура. В частности, культуры кардиомиоцитов на стеклянных подложках требует покрытия поверхности с компонентами ECM для достижения надлежащего прилипание кардиомиоцитов.
Мы протестировали покрытие для культивирования клеток, обработанных пластмассовых и стеклянных подложках с различными ECM компонентов, в том числе 0,1% раствора коллагена (Sigma C-8919), типа 3 мг / мл коллагена 1 раствора (Расширенный Biomatrix, PureCol), 1%-ным раствором желатина ( Сигма G9391; растворяли в H 2 O, автоклавного), ламинином решения (Сигма L4544), или сложные ECM смеси, полученные из свиных сердец 29 или сердечных фибробластов 30. Сотовый Cultuповторно блюда инкубировали с ECM решений для как минимум 1 час в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур, и после удаления ECM высушенной в клеточной культуры ламинаре. ECM растворы могут быть использованы повторно много раз (в 10-20 раз), если стерильность и целостность ECM белок при длительном хранении поддерживается (например, хранение при 4 ° С или замороженных). Внимание, в связи с кислотной природы некоторых из буферов, используемых для растворения белков ЕСМ, стиральная из культуральных чашек с 1x PBS после нанесения покрытия может потребоваться до посева клеток. Покрытие технику и плотность В зависимости от последующих анализов, оптимальные концентрации клеток для покрытия должно привести в почти сливающийся кардиомиоцитов монослоев. Покрытие кардиомиоцитов при высоких концентрациях приводит к многослойных кардиомиоцитов агрегатов и низкой однородности, в то время как низкие концентрации снижает жизнеспособность клеток и приводит к одиночных, изолированных кардиомиоцитов лишенный специализированной контакторов межклеточнойTS (интеркалированные дискообразные структуры). Когда пипетки клеток для посева иметь в виду, что кардиомиоциты довольно большие и тяжелые, и имеют тенденцию концентрироваться на нижней части трубки сокола. Ресуспендирование клеток в между шагами гальванических обеспечивает равномерное распределение клеток по всему Ваших блюд. Когда Покрытие клетки перемещаются блюда в форме фигуры "8", чтобы избежать концентрации клеток к центру блюда. Оптимальная конфлюентности неонатальных кардиомиоцитов предназначен для липосомальной трансфекции должна быть около 70-80% в день после посева. Сыворотка Использование культуры клеток испытаны плода (или новорожденный) бычьей сыворотки и лошадиной сыворотки в электролитической среде необходимо для жизнеспособности клеток и соблюдение кардиомиоцитов во время стадии нанесения покрытия. Качество используемого сыворотки может быть одним из важных шагов во время процедуры покрытия / культуры. Добавление к поддерживающей среде с низким содержанием сыворотки не является обязательным, однако может существенно Improве продолжительность времени культивирования.
Внимание: добавление сыворотки может существенно изменить биохимические сигнальные пути в культивируемых кардиомиоцитов и можно судить по отношению к экспериментальных параметров, гипотезы и последующей интерпретации результатов. Бессывороточной культуры кардиомиоцитов были описаны 10,31, и может предотвратить перекос результатов из-за неизвестных факторов роста, присутствующих в сыворотке крови. Ингибиторы пролиферации Терминально дифференцированных кардиомиоцитов как правило, не подвергаются клеточного деления. Тем не менее, добавление ингибиторов пролиферации, таких как 10 мкМ AraC (цитозин-BD-арабино-фуранозид гидрохлорид; Sigma C6645) в поддерживающую среду настоятельно рекомендуется, чтобы предотвратить распространение сердечной фибробластов и эндотелиальных клеток. Даже с добавлением предварительно гальванических шаги к уменьшению населения сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток, остальные фибробласты претерпит сотовые ProLiferation и существенно изменить культурный сотовый населения с течением времени.
Внимание: в зависимости от генетических факторов и изоляции временной точке, эмбриональные и неонатальные кардиомиоциты мыши все равно может быть оружия потенциальную 23,32,33. Использование AraC следует судить в зависимости от параметров эксперимента, гипотезы и интерпретации результатов. Добавление хронотропных агентов Дополнение от поддерживающую среду с агентами 34, например, фенилэфрин (0,1 мм, преимущественно для новорожденных кардиомиоцитов крыс; Сигма P6126) или изопротеренолом (1 мкм, преимущественно для новорожденных кардиомиоцитов мыши; Сигма I6501) значительно увеличивает sarcomerogenesis, распространяя кардиомиоцитов на пластина, а также спонтанное избиение клеток. Однако добавление таких агентов должны быть взвешены относительно искомых параметров анализа (например, добавление может привести к искажению сократительную поведение и биохимических параметров). Трансфекция Liposomal трансфекции ДНК / РНК в неонатальных кардиомиоцитов мышей сильно зависит от трансфекции временной точке, реагента для трансфекции, плотность культуры, концентрации ДНК / РНК и ДНК-конструкции, используемой. Мы протестировали различные липосомальных реагентов трансфекции и нашел ESCORT III (Sigma) и Lipofectamine 2000 (Invitrogen), применимый. Трансфекции клеток через 24 часа после посева путем замены обшивки среда 2 ч до трансфекции с антибиотиками среде без обслуживания. Для трансфекции неонатальных кардиомиоцитов культивировали в 30 мм чашки, смешайте 1-2 мкг ДНК с 200 мкл DMEM в стерильной пробирки Эппендорф и добавьте 4 мкл Escort III к разбавленной смеси ДНК. Аккуратно смешать и инкубировать в течение как минимум 5 мин в стерильных капот, чтобы позволить ДНК / липосомы образование комплекса. Замените антибиотики свободные обслуживания среду с 800 мкл свежей антибиотиков свободные поддерживающую среду и добавить ДНК / липосомы смесь к клеткам. Инкубируйте клетки в клеточной у.е.lture инкубатор и заменить свежей стандартной поддерживающей среде после 24 часов. Представитель результат для успешной трансфекции неонатальных кардиомиоцитов мышей показано на рисунке 2 полугодии. Трансфекцией с использованием осаждение кальция ДНК также возможно. Трансфекция неонатальных кардиомиоцитов мыши сложнее по сравнению с неонатальных кардиомиоцитов крысы, с типичными эффективности трансфекции, начиная от 1-20%. Вирусные векторы необходимы для достижения более высокую эффективность 35-37 (например, аденовирус, аденоассоциированный вирус, лентивирусов). Электропорацию неонатальных кардиомиоцитов в наших руках неподходящих для доставки ДНК / РНК, однако несколько отчеты показывают успех, используя электропорации эмбриональных и новорожденных кардиомиоцитов 38,39. В недавней статье 38, Джурович и др.. Суммировать несколько методов трансфекции показатели успеха, а также их преимущества и недостатки. Пассирование Замораживание / Стоярость Пассирования кардиомиоцитов не рекомендуется 1. Замораживание изолированных неонатальных кардиомиоцитов для длительного хранения является чрезвычайно сложным и не рекомендуется в связи с низкой эффективностью и низкими темпами восстановления. Несколько компаний предлагают специализированную среду замерзания для человека кардиомиоцитов первичных культурах (например celprogen, кошек. Нет. M36044-15FM), которые также могут быть пригодны для криоконсервации неонатальных кардиомиоцитов мышей, однако условия могут должны быть оптимизированы. Успешное пассирования и криоконсервации предсердных кардиомиоцитов было описано в трансгенных мышах 32. Нет жизнеспособные или прилипшие клетки 1 день после посева - Снизить концентрацию фермента и / или время пищеварения
- Изменение смесь ферментов
- ЧаНге сыворотка для посева среду
- Средне-и / или тип клеточной культуры блюд изменения ECM / покрытие
- Добавить 20 мМ BDM для изоляции / пищеварения СМИ
- Проверить на загрязнение клеток Выход Низкий клеток - Увеличить время пищеварения и / или концентрации фермента
- Время увеличение центрифугирования / скорость во время процедуры выделения
- Период увеличение растирания Слияния клеток в культуре слишком низкая / высокая; неравномерное покрытие - Рассчитывать клетки во время процедуры выделения и отрегулировать количество клеток / блюдо во время посева
- Настроить гальванической концентрацию
- Тщательно ресуспендируйте осадок клеток после центрифугирования и до обшивки повторным пипетированием (день 2 шаг 13), убедитесь, что никаких видимых сотовые сгустки остаются Нет избиение клетки - Добавить хронотропный агентов в поддерживающую среду (например: фенилэфрин, изопротеренол)
- Заменить среду
- ЧEck для большого количества сердечных фибробластов / эндотелиальные клетки Большое количество фибробластов - Добавить дополнительный шаг предварительным покрытием во время процедуры выделения
- Добавить ингибитор пролиферации в поддерживающую среду (табл. 1) Многие мертвые клетки - Заменить клетки культуральной среды
- Снизить концентрацию фермента и / или время пищеварения во время процедуры выделения
- Инкубатор проверка культура клеток (CO 2, температура, влажность)
- Проверить на загрязнение Загрязнение - Придерживаться условий 21 рабочих стерильной культуре клеток
- Заменить среду, использовать новое решение пенициллин / стрептомицин
- Поверхность стерилизуют новорожденных мышей с 75% раствором этанола
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование животных моделях для изучения сердечных заболеваний стала стандартом в сердечно-сосудистых исследований. Ближе биохимическая характеристика этих моделей (то есть изучения прямые ответы сердечных клеток в биохимических или биомеханических стимулы), как правило, требуется выделение сердечных тканей или кардиомиоцитов. Исследования следственные физиологические реакции сердца экс естественных (например, для ацетилхолина 40, или в сценариях ишемии 41) обычно используют Лангендорфа-перфузии целые сердца 42,43, в то время эксплантов культур 44,45 фрагментов сердечной ткани позволяют исследований кардиомиоцитов в трехмерное окружение ткани. Тем не менее, культивирование эксплантов тканей может препятствовать диффузии питательных веществ, потенциально генерации некротических кластера в ядре ткани. Кроме того, кардиомиоциты неподвижны в ткани, поэтому миграция клеток из эксплантов только OBSErved для не-кардиомиоцитов, как фибробласты или предполагаемых клеток сердечной предшественников 44. Исследуя в развитии, клеточно-биологических, биохимических и биофизических поведение кардиомиоцитов необходимых поэтому создание изоляции и процедур культивирования. Ранние протоколы для изоляции и культуры кардиомиоцитов млекопитающих используют новорожденных крыс 1,2. Однако, повышение мыши в качестве модельной системы для генетических исследований (то есть генетически модифицированные нокаут или нокаут мышей) необходимость адаптации установленном изоляции и культивирования методологий. К сожалению, изоляция новорожденных кардиомиоцитов мыши является особенно сложным по сравнению с тем из более традиционно используемых неонатальных кардиомиоцитов крысы. Представленный протокол описывает надежный и надежный метод оптимизированный для выделения и культуры неонатальных кардиомиоцитов мыши. Мы описываем шаги, необходимые для извлечения начальной ткани, для диссоциации ай очистка кардиомиоцитов из сердечных фибробластов и эндотелиальных клеток, а также для обшивки и условия культивирования. В то время как протокол предлагает основной подход к выделению и культуры неонатальных кардиомиоцитов мышей в стандартных условиях, он может быть легко адаптирована для выделения и культуры неонатальных кардиомиоцитов крысы, а также конкретных последующих видов анализа: например, культура изолированных клеток на гибких оболочек (например, Bioflex культуры плиты) по расследованию биомеханические свойства, культуры в стеклянным дном блюда (Маттек) для живых клеток изображений, или культуры кардиомиоцитов в xCELLigence сердечно электронных пластин (ACEA, Roche, № заказа: 06417051001) для изучения влияния препаратов на функции сократительных. Кроме того, мы предлагаем варианты оптимизации выделения и процедуры культуры и обсудить источники возможных проблем и их решений. Таким образом, этот протокол должен помочь исследователям изучения до современных, хорошо воспроизводим идоступным способом получения новорожденных культур мыши кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Мы благодарны проф почетный Жан-Клод Perriard и Эвелин Perriard (Швейцарский федеральный технологический институт, Швейцария) для вступления в методах изоляции для новорожденных крыс и кардиомиоцитов мыши. Мы хотели бы поблагодарить профессора Ju Чен и профессор Сильвия Эванс (UCSD, США) за их поддержку. Работа в лаборатории ЭЭ финансировалось в МРК Карьера Establishment Гранта. SL поддерживается K99/R00 путь к независимости награду от NIH / NHLBI (HL107744). ТММ поддержали докторантуру от Американской ассоциации сердца (11POST7310066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
|||
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Enzyme Manual. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. Worthington Tissue Dissection Guide. , Freehold. N.J. Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th, Wiley-Blackwell. (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
