Medição da alodinia táctil em um modelo murino de prostatite bacteriana

Summary

Infecção da próstata pode ser um fator que contribui na mediação dor pélvica na prostatite crônica. Descreve-se o processo para a preparação do inoculo bacteriano padronizado, a instilação de bactérias para dentro da uretra de ratos machos e metodologia para medir a alodinia táctil em ratos ao longo do tempo.

Abstract

Escherichia coli uropatogênica (UPEC) são patógenos que desempenham um papel importante em infecções do trato urinário e prostatite bacteriana ^1. Temos mostrado recentemente que UPEC têm um papel importante na iniciação da dor pélvica crônica ^2, uma característica de prostatite crônica / síndrome de dor pélvica crônica (CP / CPPS) ^3,4. Infecção da próstata por UPEC clinicamente relevante pode iniciar e estabelecer a dor crónica, através de mecanismos que podem envolver danos nos tecidos e a abertura dos mecanismos de auto-imunidade ^5.

Um desafio para a compreensão da patogénese de UPEC na próstata é a relativa inacessibilidade da glândula da próstata a manipulação. Utilizamos um método previamente descrito infecção intra-uretral ⁶ para proporcionar uma estirpe clínica de UPEC em ratinhos macho estabelecendo assim uma infecção ascendente da próstata. Aqui, descrevemos nossos protocolos para padronizar a bacterial inoculo ^7, bem como o procedimento para a cateterização anestesiados ratos machos por instilação de bactéria.

CP / CPPS é essencialmente caracterizada pela presença de alodinia táctil ^4. Testes de comportamento foi baseada no conceito de hiperalgesia cutânea resultante referidas ^8-10 dores viscerais. Um foco irritável em tecidos viscerais reduz o limiar da dor cutâneas permitindo uma resposta exagerada a normalmente não estímulos dolorosos (alodinia). Aplicação de uma força normal para a pele, em resultado respostas anormais que tendem a aumentar com a intensidade da dor visceral subjacente. Descrevemos metodologia em NOD / ShiLtJ ratos que utilizam fibras de von Frey para quantificar alodinia táctil ao longo do tempo em resposta a uma única infecção com bactérias UPEC.

Protocol

1. Bactérias Preparação para inoculação em camundongos

A seguir, deve ser feita sob condições assépticas.

1. Tome um 17 x 100 milímetros tubos de polipropileno com tampas e adicionar 3 ml de caldo de Luria frescas (LB) de mídia. Utilizando pontas autoclavadas, levará algum estoque de glicerol congelado da estirpe de bactérias CP1 ² e transferir uma pequena quantidade da cultura para o tubo contendo os meios LB. Substituir a tampa do tubo de modo a que o oxigénio é ainda capaz de entrar no tubo - a cultura tem de crescer em condições aeróbias. Colocar o tubo de a 37 ° C numa incubadora com agitação a 220 rpm durante a noite.
2. No dia seguinte, transferir 5 ul da cultura durante a noite para um novo tubo com 3 ml de meio LB e crescer sob condições estáticas durante a noite, numa incubadora a 37 ° C.
3. No dia 3, a transferência de 40 | il da cultura em aa tubo de 50 ml contendo 40 ml de meio LB a cada. Coloque em uma noite 37 ° C incubadora estática.
4. Ligar e configurar centrífuga a 4 ° C.Uma vez que tenha atingido a temperatura de centrifugação final, transferir cada cultura de 40 ml para um tubo de centrífuga de 40 ml Nalgene.
5. Pesar tubos para equilibrar centrífuga - ajustar o volume com a mídia LB, conforme necessário. Girar os tubos a 6000 rpm durante 20 min.
6. Cuidadosamente remover o sobrenadante e suspender suavemente pellet bacteriano em 40 ml de PBS estéril.
7. Repetir o passo 1.5 com PBS.
8. Aspirar o sobrenadante e suspender as bactérias em 500 ul de PBS estéril. Transferir a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 10 ul de suspensão e dilui-se em 990 ul de PBS gelado. Utilizar um espectrofotómetro para ler a densidade óptica _{420 nm} para determinar o volume necessário para a inoculação. Para determinar o volume apropriado de PBS gelado a suspender o granulado em: Tome o número OD _{420 nm} (em ml), e subtrair o volume estimado do pellet bacteriano [ex. OD _{420 nm} = 0,545, pellet ml aproximadamente 0,075. ,545-0,075 = 0,470].
9. Remover 10 ul de suspensão bacteriana e dialaúde em 990 ul PBS gelado. Leia as _nm OD _420. A meta é alcançar um valor de OD _{420 nm} da suspensão diluída de 1,000 ± 0,010. Se o número de sua diluição é acima deste alvo, adicionar mais volume para a suspensão e ter outra leitura. Se o número estiver abaixo do 0,990 então girar a suspensão e repita OD leitura _{nm 420} até a obtenção de leitura desejada.

2. A infecção de animais

Os ratinhos (5-7 semanas de idade, dez por grupo) foram adquiridos a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

1. Os ratos são anestesiados por inalação de 1-4% de isoflurano numa câmara de plexiglas e são monitorizados até reclinada.
2. Um rato de cada vez é levado para a instilação de bactérias por cateterização com um polietileno (PE10), ligado a um cateter de agulha G 30 modificado de uma seringa Hamilton de vidro (comprimento de 1,5-2,0 cm). O cateter é inserido para o cubo da agulha. O mouse é placed na sua superfície dorsal sob anestesia mantida através de um cone de nariz.
3. O pênis do mouse é expulso pela pressão suave e quantidades liberais de lubrificante em cotonetes é usado para a lubrificação de entrada da uretra peniana.
4. 10 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1 x 10 ⁸ bactérias é introduzido na uretra de ratos anestesiados após cateterização.
5. Os ratos são mantidos em um estado anestesiado durante 15 minutos na câmara de Plexiglas após introdução bacteriana para permitir a fixação de bactérias e para evitar a micção imediata.
6. Os ratos são colocados de volta em suas gaiolas e monitorados para o próximo 24 hr.

3. Teste de comportamento

Os ratinhos foram testados antes da infecção (linha de base) e nos dias 3, 7, 14, 21 e 28 após a infecção. Hiperalgesia referido e alodinia táctil foi testada utilizando filamentos de von Frey aplicado ao abdómen ^11,12 eo r plantarEgion da pata traseira ^13. Testes, foi realizado em um tempo fixo de dia, metodologia padrão e teste experimentador única de todos os animais foram empregados. Testes cegado dos grupos foi utilizado para combater as limitações de comportamento baseados em testes da dor em modelos animais. Cinco individuais de filamentos de von Frey, com forças de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g (Stoelting, EUA) foram aplicados no abdómen e frequência das respostas de retirada foi calculada.

1. Depois de um período de 30 minutos de aclimatação, os ratos são colocados em câmaras de Plexiglas individuais (6 x 10 x 12 cm) feitos em casa com um chão de grelha de aço inoxidável de arame.
2. Hiperalgesia referido e alodinia táctil foram testados utilizando os cinco filamentos de von Frey. Cada filamento foi aplicado durante 1-2 segundos, com um intervalo inter-estímulos de 5 segundos para um total de 10 vezes, e os cabelos foram testados em ordem crescente de força.
3. Cada filamento é aplicada à área abdominal inferior, na vizinhança geral da próstata ecuidado foi tomado para estimular diferentes áreas dentro desta região para evitar dessensibilização ou "acabar" efeitos. Os filamentos foram aplicados em ordem crescente de força durante 1-2 segundos com intervalos de pelo menos 5 segundos entre as estimulações para um total de 10 vezes.
4. Três tipos de comportamento são considerados uma resposta positiva à estimulação filamento: 1) retração acentuada do abdômen; 2) lamber imediata ou coçar a área de estimulação filamento; salto 3).
5. Frequência de resposta foi calculada como a percentagem de resposta positiva (de 10, por exemplo, 5 respostas de 10 = 50%) e os dados foram relatados como a percentagem média de resposta de frequência ± SE
6. Os animais com mais de 25 positivos respostas basais totais são excluídos do estudo.
7. Tactile allodynia foi testado na região plantar da pata traseira utilizando filamentos de von Frey, com forças de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g. O limiar de retirada mediana de 50% (5), foi avaliada por meio do up-downmétodo em que o teste foi iniciado com 0,04 g de filamentos aplicado perpendicularmente à superfície plantar da pata posterior até o filamento dobrados ligeiramente. Os filamentos foram testados em ordem crescente até que uma resposta positiva foi observada. Uma resposta positiva para o filamento foi definida quer como uma suspensão acentuada da pata ou lamber a pata de teste. Quando uma resposta positiva foi registado o seguinte filamento mais fraco foi aplicada, e se a resposta negativa foi observada, em seguida, o filamento foi aplicado ao lado mais forte.
8. Os experimentos e metodologia descritos foram analisados ​​e aprovados pelo cuidado com os animais Northwestern University e usar comitê.

Representative Results

Examinámos NOD / ShiLtj e C57BL/6J ratinhos macho para a presença de dor crónica após infecção bacteriana. Ratos machos (5-7 semanas de idade) foram instilados com solução salina ou de bactérias no interior da uretra (Figura 1). Estimulação mecânica da área pélvica com filamentos de von Frey de camundongos C57BL/6J instilados com solução salina e ratinhos C57BL/6J UPEC infectados resultou numa resposta de frequência que não se alterou durante o curso de 28 dias da experiência (Figura 1). Em contraste, os ratinhos NOD UPEC infectadas exibiram respostas à estimulação pélvica que foram significativamente maiores e permaneceu significativamente elevado até o dia 28 (P <0,05, Figura 3). A infecção bacteriana não resultou em alterações na sensibilidade táctil da região plantar da pata traseira (dados não mostrados).

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Figura 1. Fluxograma experimental. 1 x 10 ⁸ bactérias preparado por uma cultura de três dias foi suspenso em PBS e instilado na uretra de ratinhos anestesiados por cateterização. Resultando alodinia táctil foi quantificada utilizando filamentos de von Frey, com forças de 0,04, 0,16, 0,4, 1 e 4 g.

A Figura 2. Metodologia para testar a alodinia táctil utilizando fibras de von Frey. Ratos foram testados antes da infecção bacteriana e, ao dia pós-infecção (PIDs) 7, 14, 21, e 28. Três diferentes tipos de comportamento foram consideradas como respostas positivas à estimulação filamento: 1) retração acentuada do abdômen; 2) lamber imediata ou coçar a área de estimulação filamento, ou 3) saltar. Frequentemente resposta foi calculada como a percentagem de resposta positiva (em 10) e data foram relatados como o percentual médio de resposta de freqüência ± SE.

Figura 3. Alodinia táctil induzida por bactérias UPEC. Referido hiperalgesia visceral foi medida como respostas à estimulação mecânica da região pélvica utilizando filamentos de von Frey de cinco forças calibrados. Os dados são apresentados como as percentagens médias de respostas positivas ± SE antes da instilação de bactéria (linha de base) e aos PIDs 7, 14, 21, e 28. ANOVA indicaram um aumento significativo na frequência de resposta ao PIDs 7-28 em comparação com a que a linha de base para todos os filamentos testados em ratinhos NOD UPEC infectados (P <0,05). A resposta por cento em cada PID foi calculada como respostas totais para todas as fibras em relação às respostas de linha de base.

Discussion

Infecção da próstata do rato com UPEC permite a modelagem em vivo de eventos que podem estar envolvidos na patogénese da prostatite bacteriana, CP / CPPS ou como um evento de predisposição em inflamação crónica. Os métodos descritos para a preparação bacteriana e empate instilação em cima de um grande corpo de literatura sobre modelos UPEC em infecção do trato urinário feminino ^7,14. O modelo tem grande aplicabilidade para o estudo da patogênese, testando vacinas candidatas potenciais e mecanismos de modulação imunológica. A capacidade de seguir o comportamento da dor de uma forma quantificável permite o estudo da infecção induzida patogénese da dor e, potencialmente, como um modelo pré-clínico para testar terapias da dor.

Existem vários passos críticos que determinam o sucesso do modelo de infecção de rato. O método de cultura de três dias com agitação e culturas estáticas é realizado para a expressão óptima de pili que são conhecidas por serem importantes para a UPECligação às células epiteliais. Ela representa um passo fundamental para a colonização órgão bem-sucedido por UPEC. As técnicas para o crescimento bacteriano foram concebidos especificamente para o crescimento UPEC com o passo ₄₂₀ OD optimizado para a obtenção de 10 ul de salina tamponada com fosfato contendo 1 x 10 ^{8 7} bactérias. Outras espécies ou estirpes de bactérias potencialmente crescer a taxas diferentes e padronização seria importante para obter o OD apropriado que dá 1 x 10 ⁸ bactérias. Diferentes estirpes de bactérias aderem a células da bexiga e próstata de maneira única, que são em grande parte dependentes dos factores de virulência expressos pela estirpe ^14. A contaminação da próstata murina seria, portanto, dependente de utilização de uma estirpe de UPEC com o complemento apropriado de factores de virulência. Imediatamente após a infecção, mantendo-se os animais em estado ligeiramente anestesiados por um período mínimo de 15 min é importante para garantir que a insbactérias cultivadas têm tempo para ligar e iniciar patogênese antes os mecanismos normais de urinar limpar o volume instilado pela uretra.

Alodinia táctil em ratos é uma consequência da patologia subjacente visceral e, como tal, é caracterizada pela excelente especificidade estirpe hospedeira. Temos anteriormente descrito que uma estirpe patogénica de UPEC em NOD macho / mice ShiLtJ induz alodinia que os picos em 3 dias e é sustentado cronicamente enquanto que a mesma estirpe é incapaz de induzir a alodinia em ratos C57BL/67 ^2. Nossos estudos sugerem UPEC induzida por aceleração de processos auto-imunes em NOD / ShiLtJ ratos como a causa subjacente. Assim, o fundo genético hospedeiro é importante para o desenvolvimento de alodinia táctil. Outros passos importantes que são essenciais para uma medição isenta e bem sucedida de alodinia está garantindo que o aparelho de teste está sempre cegos para a identidade do tratamento, o testador mesma é responsável pela medição do tempo de todo o p-ontos na experiência, a utilização de tempos de teste semelhantes ao longo do dia, condições de alojamento dos ratos e assegurar condições padronizadas, tanto dentro de pontos temporais de um experimento, bem como entre as experiências.

O modelo murino de infecção tem uma série de limitações que devem ser cuidadosamente consideradas na interpretação dos resultados. Bactérias instiladas intrauretral tem a capacidade de infectar a bexiga, assim como a próstata. Isso dificulta a interpretação de quaisquer parâmetros sistêmicos ou gerais como a patologia subjacente pode ser de múltiplos órgãos. No entanto, a utilização de estirpes derivadas da próstata e clínicos bacterianos, bem como exame concomitante da bexiga e da próstata permite interpretações apropriadas. Além disso, a metodologia de infecção simula a modalidade infecção provavelmente ascendente em machos humanos.

O modelo de infecção descrito aqui difere daqueles previamente relatado pricipalmente na estirpe de UPEC utilizado, estirpe de ratinho do hospedeiro e as diferenças nas técnicas de cultura de ⁶ e de volume de bactérias instilados na uretra ^15. O presente estudo utiliza um bem caracterizado da próstata derivado de estirpe UPEC prostatite crónica para mediar doença ^2. Estudos anteriores usaram bactérias provenientes de infecções da bexiga ou prostatite aguda que foi utilizada principalmente para eventos de inflamação associados examinam mas não caracterizados em termos de alodinia táctil ^6,15. Numerosos outros modelos animais têm sido relatado que utilizam mecanismos de auto-imunes, ^{17 5,16} manipulação hormonal e timectomias neonatais ¹⁸ para induzir a prostatite. Embora cada um desses modelos tem alguns atributos positivos, incluindo órgão específico patologia da doença e utilização de técnicas pré-existentes a relevância destes métodos para a patogênese real da CP / CPPS é desconhecida. Em contraste, a metodologia descrita no presente homemuscript refere-se a um mecanismo potencial que tem sido postulada como sendo um iniciador da patogênese da doença da próstata. Além disso, para além da sua utilidade para a compreensão CP / CPPS patogénese, as técnicas podem também ser utilizados para estabelecer e examinando a inflamação crónica da próstata e o seu papel no BPH (hiperplasia benigna da próstata) e de cancro da próstata.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture tubes	BD Falcon	352059
LB Broth Miller	EMD	EM1.10285.0500
Nalgene Centrifuge Tubes	Thermo	3118-0050
Isoflurane	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Catheter needle 30G	Hamilton	91030
PE10 tubing	BD intramedic	427400
Von Frey Filaments	Stoelting	58025-31