Summary
La infección de la próstata puede ser un factor contribuyente en la mediación de dolor pélvico en la prostatitis crónica. Se describe el procedimiento para la preparación de inóculo estandarizado bacteriana, la instilación de bacterias en la uretra de ratones machos y metodología para medir la alodinia táctil en ratones con el tiempo.
Abstract
Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) son patógenos que juegan un papel importante en infecciones del tracto urinario y prostatitis bacteriana 1. Recientemente hemos demostrado que UPEC tienen un papel importante en la iniciación del dolor pélvico crónico 2, una característica de la prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) 3,4. La infección de la próstata mediante la UPEC clínicamente relevante puede iniciar y establecer el dolor crónico a través de mecanismos que pueden implicar daño en los tejidos y la iniciación de los mecanismos de autoinmunidad 5.
Un desafío a la comprensión de la patogénesis de la UPEC en la próstata es la relativa inaccesibilidad de la glándula prostática a la manipulación. Hemos utilizado un método previamente descrito infección intrauretral 6 para entregar una cepa clínica de UPEC en ratones machos estableciendo así una infección ascendente de la próstata. A continuación, describimos nuestros protocolos para la normalización de la bacterial inóculo 7 así como el procedimiento para la cateterización anestesiados ratones machos para la instilación de bacterias.
CP / CPPS se caracteriza principalmente por la presencia de alodinia táctil 4. Las pruebas de comportamiento se basa en el concepto de la hiperalgesia cutánea resultante de 8-10 refiere dolor visceral. Un foco irritable en los tejidos viscerales reduce los umbrales de dolor cutáneas que permitan una respuesta exagerada a la que normalmente no dolorosos estímulos (alodinia). La aplicación de fuerza normal a la piel resultado en respuestas anormales que tienden a aumentar con la intensidad del dolor visceral subyacente. Se describe metodología en los ratones NOD / ShiLtJ que utilizan von Frey fibras para cuantificar la alodinia táctil en el tiempo en respuesta a una sola infección con bacterias UPEC.
Protocol
1. Las bacterias Preparación para la inoculación de ratones
Lo siguiente debe ser realizado bajo condiciones asépticas.
- Tome un 17 x 100 mm tubos de polipropileno con tapas y añadir 3 ml de caldo Luria (LB) medios de comunicación. Utilizando puntas de autoclave, tome un poco de caldo congelado glicerol bacterias de la cepa CP1 2 y transferir una pequeña cantidad de la cultura en el tubo que contiene el medio LB. Reemplazar la tapa del tubo para que el oxígeno es todavía capaz de entrar en el tubo - la cultura necesita para crecer en condiciones aerobias. Colocar el tubo a 37 º C en una incubadora de agitación a 220 rpm durante la noche.
- El día siguiente, transferir 5 l de cultivo de una noche a un tubo nuevo con 3 ml de medio LB y crecer bajo condiciones estáticas en una incubadora durante toda la noche a 37 ° C.
- El día 3 de transferencia 40 l de cultivo en tubo de 50 ml que contiene aa medio LB 40 ml cada uno. Colocar en un 37 ° C durante la noche estática incubadora.
- Activar y configurar centrífuga a 4 ° C.Una vez centrífuga se ha alcanzado la temperatura final, transferir cada cultivo 40 ml en un tubo de centrífuga de 40 ml Nalgene.
- Pesar los tubos de centrífuga para equilibrar - ajustar el volumen con medio LB según sea necesario. Girar los tubos a 6.000 rpm durante 20 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante y sedimento bacteriano suavemente suspender en 40 ml de PBS estéril.
- Repita el paso 1.5 con PBS.
- Aspirar el sobrenadante y suspensión de bacterias en 500 l de PBS estéril. Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 10 l de suspensión y se diluye en 990 l de PBS enfriado en hielo. Utilice un espectrofotómetro para leer los OD 420 nm para determinar el volumen necesario para la inoculación. Para determinar el volumen adecuado de helado de PBS a suspender el pellet en: Tome el número OD 420 nm (en ml) y restar el volumen estimado del sedimento bacteriano [ex. OD 420 nm = 0,545, pellet aproximadamente 0,075 ml. 0,545 a 0,075 = 0,470].
- Eliminar 10 l de suspensión bacteriana y dilaúd en 990 l de helado de PBS. Lea las nm OD 420. El objetivo es conseguir un valor de OD 420 nm de la suspensión diluida de 1,000 ± 0,010. Si el número de su dilución por encima de este objetivo, añadir más volumen a la suspensión y tome otra lectura. Si el número está por debajo del .990 luego girar hacia abajo la suspensión y repetición lectura OD 420 nm hasta obtener la lectura deseada.
2. Animal Infección
Los ratones (5 a 7 semanas de edad, el diez por grupo) fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Los ratones son anestesiados por inhalación de isoflurano 1-4% en una cámara de plexiglás y se monitorizan hasta reclinada.
- Un ratón en un momento en que se da por la instilación de bacterias por cateterismo con un polietileno (PE10) unido a un catéter modificado aguja 30 G de una jeringa de vidrio Hamilton (longitud de 1.5-2.0 cm). El catéter se inserta en el cubo de la aguja. El ratón es placed en su superficie dorsal bajo anestesia mantenida usando un cono nasal.
- El pene del ratón se extruye por una presión suave y cantidades abundantes de lubricante en hisopos de algodón se utiliza para la lubricación de la entrada de la uretra del pene.
- 10 l de salina tamponada con fosfato que contenía 1 x 10 8 bacterias se introduce en la uretra de los ratones anestesiados después de la cateterización.
- Los ratones se mantienen en un estado de anestesia durante 15 min en la cámara de Plexiglas después de la introducción de bacterias para permitir la unión bacteriana y para prevenir la micción inmediata.
- Los ratones se vuelven a colocar en sus jaulas y monitoreados durante las siguientes 24 horas.
3. Comportamiento de la prueba
Los ratones fueron probados antes de la infección (línea de base) y en los días 3, 7, 14, 21 y 28 después de la infección. Referido hiperalgesia y alodinia táctil se ensayó usando filamentos de von Frey aplicados al abdomen y el 11,12 r plantaregión de la pata trasera 13. Las pruebas se desempeñasen en un fijo de tiempo de días, la metodología estándar y pruebas experimentador único de todos los animales fueron empleados. Prueba ciega de los grupos se utilizó para combatir las limitaciones de las pruebas basadas en el comportamiento de dolor en modelos animales. Cinco individuales filamentos de von Frey con fuerzas de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 y 4,0 g (Stoelting, EE.UU.) se aplica en el abdomen y la frecuencia de las respuestas de retirada se calculó.
- Después de un período de aclimatación de 30 minutos, los ratones se colocan en cámaras individuales de plexiglás (6 x 10 x 12 cm) hechas en casa con piso de rejilla de acero inoxidable alambre.
- Referido hiperalgesia y alodinia táctil se ensayaron usando los cinco filamentos de von Frey. Cada filamento se aplicó durante 1-2 segundos con un intervalo entre estímulos de 5 segundos para un total de 10 veces, y los pelos se ensayaron en orden ascendente de fuerza.
- Cada filamento se aplica a la zona inferior del abdomen en la vecindad general de la próstata yse trató de estimular las diferentes áreas dentro de la región para evitar la desensibilización o "terminar" efectos. Los filamentos se aplican en orden creciente de la fuerza de 1-2 segundos, con intervalos de al menos 5 segundos entre estimulaciones para un total de 10 veces.
- Hay tres tipos de comportamiento se considera una respuesta positiva a la estimulación del filamento: 1) fuerte contracción del abdomen, 2) lamer o rascar inmediata de la zona de estimulación filamento, 3) saltos.
- Respuesta en frecuencia se calcula como el porcentaje de respuesta positiva (de 10, por ejemplo, 5 respuestas de 10 = 50%) y los datos se informaron como la media del porcentaje de respuesta de frecuencia ± SE
- Los animales con más de 25 respuestas positivas iniciales totales se excluyeron del estudio.
- La alodinia táctil se ensayó en la región plantar de la pata trasera usando los filamentos de von Frey con fuerzas de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 y 4,0 g. La mediana del umbral del 50% por retiro (5) se evaluó mediante el arriba-abajométodo donde la prueba se inició con 0,04 g filamento aplicada perpendicularmente a la superficie plantar de la pata trasera hasta que el filamento ligeramente doblados. Los filamentos fueron probados en orden ascendente hasta una respuesta positiva se observó. Una respuesta positiva a que el filamento se definió como una retirada brusca de la pata o lamido de la pata de prueba. Cuando una respuesta positiva se registró el filamento más débil siguiente se aplicó, y si una respuesta negativa se observó, a continuación, el filamento más fuerte siguiente fue aplicada.
- Los experimentos y la metodología descritos han sido revisados y aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad Northwestern y el empleo.
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Representative Results
Se examinaron los ratones NOD / ShiLtj C57BL/6J macho y la presencia de dolor crónico después de la infección bacteriana. Los ratones macho (5 a 7 semanas de edad) fueron infundidos con solución salina o bacterias en la uretra (Figura 1). La estimulación mecánica de la zona pélvica con filamentos de von Frey de solución salina-inculcado ratones C57BL/6J y ratones infectados con UPEC C57BL/6J dio lugar a una respuesta de frecuencia que no cambió durante el transcurso de 28 días del experimento (Figura 1). En contraste, UPEC infectados ratones NOD mostraron respuestas a la estimulación pélvico que fueron significativamente mayores y permaneció significativamente elevada hasta el día 28 (P <0,05; Figura 3). La infección bacteriana no resultó en cambios en la sensibilidad táctil de la región plantar de la pata trasera (datos no mostrados).
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Figura 1. Diagrama de flujo experimental. 1 x 10 8 bacterias preparado por un cultivo de tres días se suspendió en PBS y se instila en la uretra de ratones anestesiados con el cateterismo. Resultante alodinia táctil se cuantificó usando filamentos de von Frey con fuerzas de .04, .16, 0.4, 1, y 4 g.
Figura 2. Metodología para probar la alodinia táctil usando fibras de von Frey. Ratones fueron evaluados antes de la infección bacteriana y, al día después de la infección-(PIDs) 7, 14, 21, y 28. Hay tres tipos diferentes de conducta fueron consideradas como positivas las respuestas a la estimulación filamento: 1) fuerte contracción del abdomen, 2) lamer o rascar inmediata de la zona de estimulación filamento, o 3) saltos. Respuesta de frecuencia se calcula como el porcentaje de respuesta positiva (de 10) y data fueron reportados como el porcentaje medio de respuesta de frecuencia ± SE.
Figura 3. La alodinia táctil inducida por bacterias UPEC. Referido hiperalgesia visceral se midió como respuestas a la estimulación mecánica de la región pélvica usando filamentos de von Frey calibrados de cinco fuerzas. Los datos se presentan como el porcentaje medio de respuestas positivas ± SE antes de la instilación de bacterias (línea de base) y en PIDs 7, 14, 21, y 28. ANOVA indica un aumento significativo en la respuesta de frecuencia en PIDs 7 a 28 en comparación con el de la línea de base para todos los filamentos probados en ratones NOD-UPEC infectados (P <0,05). El porcentaje de respuesta en cada PID se calculó como respuestas totales a todas las fibras con respecto a las respuestas de línea de base.
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Discussion
La infección de la próstata del ratón con UPEC permite el modelado en vivo de eventos que pueden estar implicados en la patogénesis de la prostatitis bacteriana, CP / CPPS o como un evento predisponente en la inflamación crónica. Los métodos descritos para la preparación bacteriana y el consumo de la instilación en una gran cantidad de literatura sobre modelos UPEC en infección del tracto urinario femenino 7,14. El modelo tiene una amplia aplicabilidad para el estudio de la patogénesis, probar posibles vacunas y mecanismos de modulación inmune. La capacidad de seguir el comportamiento de dolor de una forma cuantificable permite el estudio de la infección inducida por la patogénesis del dolor y potencialmente como un modelo preclínico para probar la terapéutica del dolor.
Hay varios pasos críticos que determinan el éxito del modelo de infección de ratón. El método de cultivo de tres días con agitación y cultivos estáticos se realiza para la óptima expresión de pili que se sabe que son importantes para UPECunión a células epiteliales. Esto representa un paso fundamental para la colonización de órganos con éxito por la UPEC. Las técnicas para el crecimiento bacteriano se han diseñado específicamente para el crecimiento UPEC con el paso OD 420 optimizado para obtener 10 l de salina tamponada con fosfato que contenía 1 x 10 8 7 bacterias. Otras especies o cepas de bacterias potencialmente crecer a ritmos diferentes y estandarización sería importante para obtener el correspondiente diámetro exterior que da a 1 x 10 8 bacterias. Las diferentes cepas de bacterias se adhieren a células de la vejiga y de la próstata en formas únicas que son en gran medida dependientes de los factores de virulencia expresados por la cepa 14. Éxito de la infección de la próstata murino tanto, sería dependen de la utilización de una cepa de UPEC con el complemento adecuado de factores de virulencia. Inmediatamente después de la infección, el mantenimiento de los animales en un estado ligeramente anestesiados durante un mínimo de 15 min es importante asegurarse de que insbacterias cultivados tienen tiempo para unir e iniciar la patogénesis antes de que los mecanismos normales de la micción borrar el volumen instilado por la uretra.
Alodinia táctil en ratones es una consecuencia de la patología subyacente visceral y, como tal, se caracteriza por una especificidad exquisita cepa huésped. Hemos descrito previamente que una cepa patógena de UPEC en NOD macho / ShiLtJ ratones induce la alodinia que los picos en 3 días y se mantiene crónicamente mientras que la misma cepa es incapaz de inducir la alodinia en ratones C57BL/67 2. Nuestros estudios sugieren UPEC inducida por la aceleración de los procesos autoinmunes en ratones NOD / ShiLtJ como la causa subyacente. Así, el fondo genética del huésped es importante en el desarrollo de la alodinia táctil. Otras medidas importantes que son la clave para una medición objetiva y éxito de la alodinia se aseguran de que el probador está siempre cegados a la identidad del tratamiento, el probador mismo es responsable de la medición de todos los tiempos-pUNTOS en el experimento, la utilización de tiempos de pruebas similares durante el día, las condiciones de vivienda de los ratones y garantizar condiciones normalizadas tanto en los puntos de tiempo en un experimento, así como entre los experimentos.
El modelo murino de infección tiene una serie de limitaciones que deben considerarse cuidadosamente durante la interpretación de resultados. Las bacterias inculcado intrauretral tienen la capacidad de infectar la vejiga, así como la próstata. Esto complica la interpretación de los parámetros sistémicos o generales como la patología subyacente podría ser de múltiples órganos. Sin embargo, la utilización de clínicos y de próstata derivados cepas bacterianas, así como el examen simultáneo de la vejiga y de la próstata permite interpretaciones adecuadas. Además, la metodología de la infección simula la modalidad probable infección ascendente en los machos humanos.
El modelo de infección descrito aquí difiere de los publicados en la priprimordialmente en la cepa de UPEC utilizado, la cepa de ratón huésped y las diferencias en las técnicas de cultivo y el volumen 6 de bacterias instila en la uretra 15. El presente estudio utiliza un bien caracterizado próstata derivado de la cepa UPEC prostatitis crónica para mediar en la enfermedad de 2. Estudios anteriores han utilizado bacterias derivadas de infecciones de la vejiga o la prostatitis aguda que se utilizó principalmente para eventos que examinan la inflamación asociados pero no caracteriza en términos de la alodinia táctil 6,15. Numerosos modelos animales se han reportado otros que utilizan mecanismos autoinmunes 5,16, 17 y manipulación hormonal timectomías neonatal de 18 a inducir la prostatitis. Aunque cada uno de estos modelos tienen algunos atributos positivos, incluyendo la patología de enfermedades de órganos específicos y la utilización de las técnicas de pre-existentes de la relevancia de estos métodos a la patogénesis real de CP / CPPS es desconocida. En contraste, la metodología descrita en este hombreuscript se refiere a un mecanismo potencial que ha sido postulado como un iniciador de la patogénesis de la enfermedad de la próstata. Además, más allá de su utilidad para la comprensión de CP / CPPS patogénesis, las técnicas bien podría ser utilizado en el establecimiento y el examen de la inflamación crónica de la próstata y su papel en la BPH (hiperplasia prostática benigna) y cáncer de próstata.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por conceder 1K01DK079019A2 (PT) del NIH / NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
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