Summary
Infectie van de prostaat kan een bijdragende factor in het bemiddelen bekken pijn bij chronische prostatitis zijn. We beschrijven de procedure voor het bereiden van gestandaardiseerde bacterieel inoculum, instillatie van bacteriën in de urethra van mannelijke muizen en methode voor het meten tactiele allodynie bij muizen in de tijd.
Abstract
Uropathogene Escherichia coli (UPEC) zijn ziekteverwekkers die een belangrijke rol spelen bij infecties van de urinewegen en bacteriële prostatitis afspelen 1. We hebben onlangs aangetoond dat UPEC een belangrijke rol in de initiatie van chronische pijn in het bekken 2, een kenmerk van chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS) 3,4 te hebben. Infectie van de prostaat door klinisch relevante UPEC kunnen initiëren en chronische pijn vast te stellen via mechanismen die weefselschade en de start van de mechanismen van auto-immuniteit 05 mei te betrekken.
Een uitdaging voor het begrijpen van de pathogenese van UPEC in de prostaat is de relatieve ontoegankelijkheid van de prostaat voor manipulatie. We gebruik gemaakt van een eerder beschreven intra infectie methode 6 tot en met een klinische stam van UPEC leveren in mannelijke muizen en bepaalt zij aldus een opgaande infectie van de prostaat. Hier beschrijven we onze protocollen voor het standaardiseren van de bacterial inoculum 7 en de procedure voor catheterizing verdoofde mannelijke muizen voor instillatie van bacteriën.
CP / CPPS wordt voornamelijk gekenmerkt door de aanwezigheid van tactiele allodynie 4. Gedrag testen werd gebaseerd op het concept van cutane hyperalgesie als gevolg van genoemde viscerale pijn 8-10. Een prikkelbare focus in viscerale weefsels vermindert huidpijn drempels waardoor een overdreven reactie op normaal niet-pijnlijke stimuli (allodynie). Toepassing van normaalkracht op de huid resultaat abnormale respons die de neiging te stijgen met de intensiteit van de onderliggende ingewandspijn. We beschrijven methode in NOD / ShiLtJ muizen die von Frey vezels gebruiken om tactiele allodynie tijd kwantificeren in reactie op een infectie met bacteriën UPEC.
Protocol
1. Bacteriën Voorbereiding voor Muis Inoculatie
Het volgende moet worden gedaan onder aseptische omstandigheden.
- Neem een 17 x 100 mm polypropyleen buizen met doppen en 3 ml vers Luria bouillon (LB) media. Met behulp van geautoclaveerd tips, neem dan even bevroren bacteriën glycerol voorraad van stam CP1 2 en de overdracht van een kleine hoeveelheid van de cultuur in de buis met de LB media. Plaats het dopje zodat zuurstof is nog steeds in staat om de buis in te voeren - de cultuur moet groeien onder aërobe omstandigheden. Place buis bij 37 ° C in een schudincubator bij 220 rpm overnacht.
- De volgende dag overdragen 5 pi kweek gedurende de nacht naar een nieuwe buis met 3 ml LB media en groeien onder statische omstandigheden in een incubator bij 37 ° C.
- Op dag 3 overdracht 40 ul van cultuur in aa 50 ml buis met 40 ml LB-medium per stuk. Leg ze in een 37 ° C incubator statische 's nachts.
- Schakel en stel centrifuge tot 4 ° C.Zodra centrifuge heeft bereikt eindtemperatuur, breng elke 40 ml cultuur in een 40 ml Nalgene centrifugebuis.
- Weeg buizen aan centrifuge evenwicht - volume aan te passen met LB media als dat nodig is. Spin buizen bij 6.000 rpm gedurende 20 minuten.
- Verwijder voorzichtig supernatant en voorzichtig bacteriële pellet te schorten in 40 ml steriele PBS.
- Herhaal stap 1.5 met PBS.
- Zuig uit supernatant en schorten bacteriën in 500 pi steriel PBS. Over in een 1,5 ml microfugebuis. Neem 10 pi van schorsing en verdunnen in 990 ul ijskoude PBS. Gebruik een spectrofotometer de OD 420 nm gelezen om de benodigde volume voor inoculatie te bepalen. Om het juiste volume te bepalen van ijskoude PBS tot pellet te schorten: de OD 420 nm nummer (in ml) Neem en trek de geschatte hoeveelheid van de bacteriële pellet [ex. OD 420 nm = 0,545, pellet ongeveer 0.075 ml. 0,545 tot 0,075 = 0,470].
- Verwijder 10 pi bacteriesuspensie en diluit in 990 ul ijskoude PBS. Lees de OD 420 nm. Het doel is te komen tot een OD 420 nm waarde voor de verdunde suspensie van 1,000 ± 0,010. Als het nummer van uw verdunning is boven deze doelstelling, voegt meer volume aan de suspensie en neem een andere lezing. Als het nummer is onder de 0.990 dan spin down de schorsing en herhaal de OD 420 nm lezen tot het verkrijgen van de gewenste lezen.
2. Animal Infectie
Muizen (5 tot 7 weken oud, tien per groep) werden gekocht bij Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Muizen zijn verdoofd door inhalatie van 1-4% isofluraan in een plexiglas kamer en worden bewaakt totdat ligfiets.
- Een muis tegelijk wordt genomen voor het inbrengen van bacteriën door catheterisatie met polyethyleen (PE10) katheter bevestigd aan een gemodificeerde 30 G naald van een glazen Hamilton spuit (lengte van 1,5-2,0 cm). De katheter wordt ingebracht op de naaf van de naald. De muis is placed op het dorsale oppervlak onder narcose onderhouden met behulp van een neuskegel.
- De penis van de muis is geëxtrudeerd door lichte druk en liberale hoeveelheden smeermiddel op wattenstaafjes wordt gebruikt voor smering van de ingang van de penis urethra.
- 10 pl fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 1 x 10 8 bacteriën wordt in de urethra van verdoofde muizen na catheterisatie.
- Muizen worden gehouden in een verdoofde gedurende 15 min in de kamer Plexiglas na bacteriële inleiding bacteriële hechting mogelijk te maken en onmiddellijk plassen voorkomen.
- Muizen worden teruggeplaatst in hun kooien en gecontroleerd voor de volgende 24 uur.
3. Gedrag Testen
Muizen werden getest voor infectie (baseline) en op dag 3, 7, 14, 21 en 28 na infectie. Doorverwezen hyperalgesie en allodynie tactiele werd getest met behulp van von Frey filamenten toegepast op de buik 11,12 en de plantaire rEgion van de achterpoot 13. Het testen werd perfomed op een vast tijdstip van de dag, werden standaard methodologie en enkele experimentator het testen van alle dieren gebruikt. Verblind testen van groepen werd gebruikt om de beperkingen van op gedrag gebaseerde pijn proeven te in diermodellen. Vijf individuele von Frey filamenten met krachten van 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 en 4,0 g (Stoelting, USA) werden op de buik en de frequentie van terugtrekking reacties werd berekend.
- Na een 30 min periode van acclimatisatie, worden muizen geplaatst in individuele plexiglas kamers (6 x 10 x12 cm) in eigen huis gemaakt met een roestvrij staaldraad roostervloer.
- Doorverwezen hyperalgesie en allodynie tactiele werden getest met behulp van de vijf von Frey filamenten. Elke vezel werd gedurende 1-2 sec met een inter-stimulus interval van 5 sec voor een totaal 10 keer, en de haren werden getest in oplopende volgorde van kracht.
- Elke vezel wordt toegepast op de onderbuik in de algemene nabijheid van de prostaat enzorg is besteed aan verschillende gebieden te stimuleren in deze regio de desensibilisatie vermijden of "de wind" effecten. Filamenten toegepast in oplopende volgorde van kracht voor 1-2 sec met minstens 5 sec interval tussen stimulaties in totaal 10 maal.
- Er zijn drie soorten gedrag worden beschouwd als een positieve reactie op filament stimulatie: 1) scherpe terugtrekken van de buik; 2) onmiddellijke likken of krabben van het gebied van gloeidraad stimulatie; 3) springen.
- Frequentiegebied werd berekend als het percentage positieve respons (uit 10, bijvoorbeeld 5 reacties van 10 = 50%) en data werd gerapporteerd als het gemiddelde percentage van de respons frequentie ± SE
- Dieren met meer dan 25 positieve totale basislijn reacties zijn uitgesloten van de studie.
- Tactiele allodynie werd getest op de plantaire regio van de achterpoot met von Frey filamenten met krachten van 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 en 4,0 g. De mediaan 50% onttrekkingsdrempel (5) werd gemeten met de omhoog-omlaagmethode waarbij testen werd gestart met 0,04 g filament die loodrecht op de voetzool van de achterpoot tot filament lichtjes gebogen. Filamenten werden getest oplopend tot een positieve reactie waargenomen. Een positieve reactie op de gloeidraad werd gedefinieerd als een scherpe terugtrekking van de poot of likken van de test poot. Wanneer een positieve reactie opgenomen de volgende zwakkere filament werd toegepast en als een negatieve respons waargenomen, wordt de volgende sterke filament toegepast.
- De experimenten en methodologie beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Northwestern University verzorging van dieren en het gebruik comite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We NOD / ShiLtj en C57BL/6J mannelijke muizen onderzocht op de aanwezigheid van chronische pijn bij bacteriële infectie. Mannelijke muizen (5 tot 7 weken oud) werden gedruppeld met zoutoplossing of bacteriën in de urethra (figuur 1). Mechanische stimulatie van het bekkengebied met von Frey filamenten van saline-boezemden C57BL/6J muizen en UPEC geïnfecteerde C57BL/6J muizen resulteerde in een reactie frequentie die niet verandert tijdens de 28-daagse verloop van het experiment (figuur 1). Daarentegen UPEC geïnfecteerde NOD muizen vertoonden reacties op bekken stimulatie significant groter en bleef significant verhoogd tot dag 28 (P <0,05; figuur 3). Bacteriële infectie resulteerde in geen veranderingen in tactiele gevoeligheid van de plantaire regio van de achterpoot (data niet getoond).
tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Figuur 1. Experimental stroomschema. 1 x 10 8 bacteriën bereid door een driedaagse kweek werd gesuspendeerd in PBS en ingedruppeld in de urethra van verdoofde muizen door catheterisatie. Verkregen tactiele allodynie werd gekwantificeerd met behulp von Frey filamenten met krachten van 0,04, 0,16, 0,4, 1 en 4 g.
Figuur 2. Testmethoden tactiele allodynie met von Frey vezels. Muizen werden getest voor bacteriële infectie en na infectie dag (PIDs) 7, 14, 21 en 28. Drie verschillende soorten gedrag werden beschouwd als positieve reacties op filament stimulatie: 1) scherpe terugtrekken van de buik; 2) onmiddellijke likken of krabben van het gebied van filament stimulatie, of 3) springen. Reactie frequent werd berekend als het percentage positieve respons (uit 10) en data werden gerapporteerd als het gemiddelde percentage van de respons frequentie ± SE.
Figuur 3. Tactiele allodynie veroorzaakt door UPEC bacteriën. Doorverwezen viscerale hyperalgesie werd gemeten als reactie op mechanische stimulatie van het bekken met behulp van von Frey filamenten van vijf gekalibreerde krachten. Gegevens worden gerapporteerd als het gemiddelde percentage van positieve reacties ± SE vóór instillatie van bacteriën (baseline) en PIDs 7, 14, 21 en 28. ANOVA een significante toename in respons frequentie PIDs 7 tot 28 vergeleken met de basislijn voor alle filamenten getest UPEC geïnfecteerde NOD muizen (P <0,05). Het percentage respons op elke PID werd berekend als de totale antwoorden op alle vezels ten opzichte van basislijn responsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infectie van de muis prostaat met UPEC maakt de in vivo modellering van gebeurtenissen die betrokken zijn bij de pathogenese van bacteriële prostatitis, CP / CPPS of een predisponerende event in chronische ontsteking. De beschreven methoden voor bacteriële voorbereiding en instillatie putten uit een grote hoeveelheid literatuur over UPEC modellen bij vrouwelijke urineweginfectie 7,14. Het model heeft brede toepasbaarheid voor het bestuderen van de pathogenese, het testen van potentiële kandidaat-vaccins en de mechanismen van immuunmodulatie. De mogelijkheid om pijngedrag volgen een kwantificeerbare wijze maakt de studie van infectie geïnduceerde pijn pathogenese en mogelijk als een preklinisch model voor het testen van pijn therapeutica.
Er zijn verschillende kritische stappen dat het succes van de muis infectie model te bepalen. De driedaagse kweekmethode onder schudden en statische kweken wordt uitgevoerd voor optimale expressie van pili waarvan bekend belangrijk voor UPECgehechtheid aan epitheelcellen. Het is een cruciale stap voor een succesvolle orgel kolonisatie door UPEC. De technieken voor bacteriegroei zijn speciaal ontworpen voor UPEC groei met de OD 420 stap geoptimaliseerd voor het verkrijgen van 10 pl fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 1 x 10 8 bacteriën 7. Andere soorten of stammen van bacteriën mogelijk groeien met verschillende snelheden en standaardisering is belangrijk om het afleiden van de juiste OD dat 1 x 10 8 bacteriën geeft. Verschillende stammen van bacteriën hechten aan cellen in de blaas en prostaat op een unieke manier die grotendeels afhankelijk van de virulentiefactoren die door de stam 14. Succesvolle infectie van de murine prostaat zou daarom afhankelijk gebruik van een UPEC stam met de juiste complement van virulentiefactoren. Onmiddellijk na de infectie handhaven dieren in een licht verdoofd toestand ten minste 15 minuten is belangrijk dat insbebouwd bacteriën hebben de tijd te bevestigen en te starten pathogenese vóór de normale mechanismen van urineren het toegediende volume te wissen uit de plasbuis.
Tactiele allodynie bij muizen is een gevolg van de onderliggende pathologie viscerale en als zodanig wordt gekenmerkt door uitstekende gastheerstam specificiteit. We hebben eerder beschreven dat een pathogene stam van UPEC bij mannelijke NOD / ShiLtJ muizen allodynie induceert die pieken in 3 dagen en chronisch wordt gedragen terwijl het dezelfde stam niet in staat is het induceren van allodynie in C57BL/67 muizen 2. Onze studies suggereren UPEC-geïnduceerde versnelling van auto-immune processen in NOD / ShiLtJ muizen als de onderliggende oorzaak. Dus de gastheer genetische achtergrond is belangrijk in de ontwikkeling van tactiele allodynie. Andere belangrijke stappen die cruciaal zijn voor een objectieve en succesvolle meting van allodynie zorgen ervoor dat de tester altijd blind voor de identiteit van de behandeling dezelfde tester verantwoordelijk voor het meten van tijd-points in het experiment gebruik van dergelijke testen tijdens de dag, behuizing van de muizen en zorgen gestandaardiseerde omstandigheden binnen tijdstippen in een experiment en tussen experimenten.
De muis infectie model heeft een aantal beperkingen die moeten zorgvuldig worden overwogen tijdens resultaat interpretatie. Bacteriën gedruppeld intraurethrally de capaciteit van de blaas infecteren en de prostaat. Dit bemoeilijkt de interpretatie van een systemische of algemene parameters als de onderliggende pathologie zou kunnen zijn van meerdere organen. Echter, gebruik van klinische en prostate afgeleid bacteriestammen en gelijktijdige onderzoek van de blaas en de prostaat maakt een passende interpretaties. Bovendien de methodologie van infectie simuleert de waarschijnlijke stijgend infectie modaliteit bij mannen.
De infectie hier beschreven model verschilt van de eerder gerapporteerde priMarily in de stam van UPEC gebruikt, de gastheer muizenstam en verschillen in cultuur technieken 6 en volume van de bacteriën ingeprent in de urethra 15. Deze studie maakt gebruik van een goed gekarakteriseerd prostate afgeleide chronische prostatitis UPEC stam te bemiddelen ziekte 2. Eerdere studies hebben gebruikt bacteriën uit blaasontstekingen of acute prostatitis die is voornamelijk gebruikt voor de behandeling van ontsteking gebeurtenissen maar niet gekarakteriseerd in termen van tactiele allodynie 6,15. Talrijke andere diermodellen gemeld dat gebruik auto mechanismen 5,16, hormonale manipulatie 17 en neonatale thymectomies 18 tot prostatitis induceren. Elk van deze modellen heeft positieve eigenschappen, inclusief orgaanspecifieke pathologie en het gebruik van bestaande technieken de relevantie van deze methoden om de feitelijke pathogenese van CP / CPPS is onbekend. Daarentegen wordt de werkwijze in deze manuscript verwijst naar een potentieel mechanisme waarvan wordt verondersteld een initiator van ziekte pathogenese in de prostaat. Daarnaast buiten haar nut voor het begrijpen van CP / CPPS pathogenese, kunnen de technieken goed worden gebruikt bij het vaststellen van en het onderzoeken van chronische ontsteking van de prostaat en zijn rol in de BPH (Benigne prostaathyperplasie) en prostaatkanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies 1K01DK079019A2 (PT) van de NIH / NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
References
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
- Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
- Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
- Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
- Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).
- Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).
- Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
- Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
- Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
- Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).
