Summary
Infektion der Prostata kann ein Faktor bei der Vermittlung Schmerzen im Beckenbereich bei chronischer Prostatitis sein. Wir beschreiben das Verfahren zur Herstellung von standardisierten bakteriellen Inokulums Instillation von Bakterien in die Harnröhre des männlichen Mäusen und Methodik zur Messung taktile Allodynie bei Mäusen über die Zeit.
Abstract
Uropathogenen Escherichia coli (UPEC) sind Erreger, die eine wichtige Rolle bei Harnwegsinfektionen und bakterielle Prostatitis 1 spielen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass UPEC eine wichtige Rolle bei der Initiierung von chronischen Schmerzen im Beckenbereich 2, ein Merkmal Chronische Prostatitis / chronisches Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS) 3,4 haben. Infektion der Prostata durch klinisch relevante UPEC können initiieren und zu etablieren chronischen Schmerzen durch Mechanismen, die Gewebeschäden und die Einleitung von Mechanismen der Autoimmunität 5 verbunden sein können.
Eine Herausforderung für das Verständnis der Pathogenese der UPEC in der Prostata ist die relative Unzugänglichkeit der Prostata zur Manipulation. Wir verwendeten ein zuvor beschriebenes intraurethrale Infektion Methode 6 eine klinische Stamm UPEC in männlichen Mäusen somit Gründung einer aufsteigenden Infektion der Prostata zu liefern. Hier beschreiben wir unsere Protokolle für die Standardisierung der bacterial Inokulum 7 sowie das Verfahren zur Katheterisiervorrichtung narkotisierten männlichen Mäusen zur Instillation von Bakterien.
CP / CPPS wird hauptsächlich durch das Vorliegen von taktiler Allodynie 4 charakterisiert. Behavior-Tests auf dem Konzept der kutanen Hyperalgesie aus bezeichnet viszeralen Schmerzen 8-10 basiert. Ein gereizter Fokus der viszeralen Geweben reduziert kutanen Schmerzschwelle ermöglicht eine übertriebene Reaktion auf normalerweise nicht-schmerzhafte Reize (Allodynie). Anwendung normaler Kraft auf die Haut führen anormalen Reaktionen, die mit der Intensität des darunterliegenden viszeralen Schmerzen erhöhen neigen. Wir beschreiben Methoden in NOD / ShiLtJ Mäusen, die von Frey Fasern zu verwenden, um taktile Allodynie über die Zeit in Reaktion auf eine einzelne Infektion mit Bakterien UPEC quantifizieren.
Protocol
Ein. Bakterien Vorbereitung für Maus Impfung
Folgendes muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen.
- Nehmen Sie ein 17 x 100 mm Polypropylen-Röhrchen mit Kappen und 3 ml frisches Luria Broth (LB)-Medium. Mit autoklaviert Tipps, nehmen Sie sich gefrorenen Bakterien Glycerin Lager des Stammes CP1 2 und übertragen eine kleine Menge der Kultur in das Röhrchen mit der LB-Medien. Den Schlauch Kappe so dass Sauerstoff noch in der Lage, um das Rohr eindringen - die Kultur muss unter aeroben Bedingungen wachsen. Das Röhrchen bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm über Nacht.
- Am nächsten Tag übertragen 5 ul-Nacht-Kultur in ein frisches Röhrchen mit 3 ml LB-Medium wachsen und unter statischen Bedingungen in einem Inkubator über Nacht bei 37 ° C.
- Am Tag 3 Transfer 40 ul der Kultur in aa 50 ml Röhrchen mit 40 ml LB-Medium jeweils. In einem 37 ° C statische Inkubator über Nacht.
- Schalten Sie ein und stellen Zentrifuge auf 4 ° C.Sobald Zentrifuge Endtemperatur erreicht, übertragen jede 40 ml Kultur in einem 40 ml Nalgene Zentrifugenröhrchen.
- Wiegen Röhrchen Zentrifuge auszugleichen - die Lautstärke mit LB-Medium, wie gebraucht. Spin Röhrchen bei 6.000 rpm für 20 min.
- Überstand sorgfältig abnehmen und vorsichtig auszusetzen Bakterienpellet in 40 ml steriler PBS.
- Wiederholen Sie Schritt 1,5 mit PBS.
- Absaugen Überstand und auszusetzen Bakterien in 500 ul sterilem PBS. Wird die Lösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Nehmen Sie sich 10 ul der Suspension und verdünnen in 990 ul eiskaltem PBS. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die OD 420 nm zu lesen, um die Lautstärke für die Impfung benötigten bestimmen. Um das entsprechende Volumen bestimmen eiskaltem PBS, um Pellets in auszusetzen: Nehmen Sie die OD 420 nm-Nummer (in ml) und subtrahieren die geschätzte Volumen des Bakterienpellet [ex. OD 420 nm = 0,545, Pellet ca. 0,075 ml. 0,545 bis 0,075 = 0,470].
- Entfernen 10 ul der Bakteriensuspension und diLaute in 990 ul eiskaltem PBS. Lesen Sie die OD 420 nm. Das Ziel ist, eine OD 420 nm-Wert für die verdünnte Suspension von 1,000 ± 0,010 zu erreichen. Wenn die Anzahl Ihrer Verdünnung oberhalb dieses Ziels, fügen mehr Volumen der Suspension und nehmen eine andere Lesart. Wenn die Zahl unter dem 0,990 dann drehen sich die Aussetzung und wiederholen OD 420 nm Lesen bis zum Erhalt gewünschte Lektüre.
2. Tierische Infektion
Mäuse (5 bis 7 Wochen alt, zehn pro Gruppe) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben.
- Mäuse werden anästhesiert durch Inhalation von 1-4% Isofluran in einem Plexiglas-Kammer und sind bis recumbent überwacht.
- Eine Maus zu einem Zeitpunkt ist zur Instillation von Bakterien durch Katheterisierung mit einem Polyethylen (PE10) Katheter an einer modifizierten 30 G Nadel einer Hamilton-Spritze aus Glas (Länge 1,5 bis 2,0 cm) entnommen. Der Katheter mit der Nabe der Nadel eingeführt wird. Die Maus ist placed auf die dorsale Oberfläche unter Narkose gehalten mit einem Nasenkonus.
- Der Penis des Maus extrudiert wird durch sanften Druck und großzügigen Mengen an Schmiermittel auf Wattestäbchen ist zum Schmieren Eingang des penilen Harnröhre verwendet.
- 10 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1 x 10 8 Bakterien in die Harnröhre von betäubten Mäusen nach Katheterisierung eingeführt.
- Die Mäuse werden in einer anästhesierten Zustand für 15 min in dem Plexiglas-Kammer aufrechterhalten nach bakterieller Einführung bakteriellen Befestigung zu ermöglichen und eine sofortige Wasserlassen verhindern.
- Mäuse werden wieder in ihre Käfige gesetzt und überwacht für die nächsten 24 Stunden.
3. Behavior Testing
Die Mäuse wurden vor der Infektion (Baseline) und an den Tagen 3, 7, 14, 21 und 28 nach der Infektion getestet. Bezeichnet Hyperalgesie und taktile Allodynie wurde anhand von Frey Filamente aufgebracht auf den Bauch 11,12 und der plantaren region der Hinterpfote 13. Testing zu einem festen Zeit-of-day wurde perfomed wurden Standard-Methodik und einzelne Experimentator Prüfung von allen Tieren beschäftigt. Verblendet Testen von Gruppen wurde verwendet, um die Grenzen der verhaltensbasierte Schmerzen Tests in Tiermodellen zu bekämpfen. Fünf einzelne von Frey Filamenten mit Kräften von 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 und 4,0 g (Stoelting, USA) wurden auf das Abdomen und Häufigkeit der Wegziehreaktionen aufgebracht wurde berechnet.
- Nach einer 30 min Eingewöhnungszeit werden die Mäuse in den einzelnen Plexiglas Kammern (6 x 10 x12 cm) in-house mit einem Edelstahl-Drahtgitter-Boden aus gelegt.
- Bezeichnet Hyperalgesie und taktile Allodynie wurden getestet unter Verwendung der fünf von Frey Filamenten. Jedes Filament wurde für 1-2 Sekunden mit einem Inter-Stimulus-Intervall von 5 Sekunden für insgesamt 10-mal angewendet, und die Haare wurden in aufsteigender Reihenfolge der Kraft getestet.
- Jedes Filament mit dem unteren Bauchbereich in der allgemeinen Umgebung der Prostata aufgebracht undwurde darauf geachtet, verschiedene Bereiche innerhalb dieser Region zu stimulieren Desensibilisierung zu vermeiden oder "Wind up"-Effekte. Filamente wurden mit ansteigender Kraft für 1-2 sec mit mindestens 5 sec Intervallen zwischen Stimulationen für insgesamt 10-mal angewendet.
- Drei Arten von Verhalten eine positive Reaktion auf Filament Stimulation betrachtet: 1) scharfe Einziehen des Bauches, 2) sofort Lecken oder Kratzen im Bereich der Wendel Stimulation; 3) Springen.
- Ansprechfrequenz wurde als der Prozentsatz der positiven Antwort (von 10, z. B. 5 Antworten von 10 = 50%) berechnet und die Daten wurden als mittlere Prozentsatz der Ansprechfrequenz ± SE gemeldet
- Tiere mit mehr als 25 positiven insgesamt Baseline Antworten werden von der Studie ausgeschlossen.
- Taktile Allodynie wurde auf dem Plantarbereich der Hinterpfote mit von Frey Filamente mit Kräften von 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 und 4,0 g getestet. Der Median 50% Wegziehschwelle (5) wurde mit dem up-downMethode, bei der Prüfung mit 0,04 g Filament gestartet wurde angewendet senkrecht zur Fußsohle der Hinterpfote, bis der Faden leicht gebeugt. Filamente wurden in aufsteigender Reihenfolge, bis eine positive Antwort wurde beobachtet, getestet. Eine positive Antwort auf das Filament wurde entweder als eine scharfe Rückzug der Pfote oder Lecken der Test paw definiert. Wenn eine positive Antwort aufgezeichnet wurde der nächste schwächeren Filamenten aufgebracht wurde, und wenn eine negative Antwort beobachtet wurde, dann wird die nächste stärkere Filament aufgebracht wurde.
- Die Experimente und Methoden beschrieben, wurden überprüft und von der Northwestern University Tierpflege und benutzen Ausschuss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir untersuchten NOD / ShiLtj und C57BL/6J männlichen Mäusen auf das Vorhandensein von chronischen Schmerzen bei bakteriellen Infektion. Männliche Mäuse (5 bis 7 Wochen alt) wurden mit Kochsalzlösung oder Bakterien in die Harnröhre (Abbildung 1) zugetropft. Mechanische Stimulation des Beckenbodens mit von Frey Filamente Kochsalzlösung eingeflößt C57BL/6J-Mäuse und UPEC-infizierten C57BL/6J Mäusen führte zu einer Reaktion Frequenz, die nicht während der 28-tägigen Kurs des Experiments (Abbildung 1) geändert haben. Im Gegensatz dazu zeigten UPEC-infizierten NOD-Mäusen Antworten auf Beckenbereich Stimulation, die deutlich größer waren und blieben deutlich erhöhten bis Tag 28 (P <0,05; Abbildung 3). Bakterielle Infektion führte zu keinen Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit des plantaren Bereich des Hinterpfote (Daten nicht gezeigt).
tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Experimentelle Flussdiagramm. 1 x 10 8 Bakterien durch eine Drei-Tage-Kultur vorbereitet wurde in PBS suspendiert und eingeflößt in die Harnröhre von narkotisierten Mäusen durch Katheterisierung. Resultierende taktile Allodynie wurde unter Verwendung von Frey Filamenten mit Kräften von 0,04, 0,16, 0,4, 1 und 4 g auf.
Abbildung 2. Methodik zum Testen taktile Allodynie mit von Frey Fasern. Mäuse wurden vor bakteriellen Infektionen und bei der Post-Infektion Tag (PIDs) 7, 14, 21 und 28 getestet. Drei verschiedene Arten von Verhalten wurden als positive Antworten auf Filament Stimulation betrachtet: 1) scharfe Einziehen des Bauches, 2) sofort Lecken oder Kratzen im Bereich der Wendel Stimulation; oder 3) Springen. Reaktion häufig wurde als der Prozentsatz der positiven Antwort (von 10) und d berechnetata wurden als der Mittelwert Prozentsatz der Ansprechfrequenz ± SE gemeldet.
Abbildung 3. Taktile Allodynie durch UPEC Bakterien induziert. Geworbene viszerale Hyperalgesie als Reaktion auf mechanische Stimulation der Beckenbereich Verwendung von Frey Filamenten von fünf kalibriert Kräfte gemessen. Die Daten sind als die mittleren Prozentsätze der positiven Antworten ± SE vor der Instillation von Bakterien (Baseline) und PIDs 7, 14, 21 und 28 berichtet. ANOVA zeigte einen deutlichen Anstieg der Ansprechfrequenz auf PIDs 7-28 im Vergleich zu derjenigen bei der Basislinie für alle Filamente in UPEC-infizierten NOD Mäusen (P <0.05) getestet. Die prozentuale Reaktion bei jedem PID wurde als Gesamt-Antworten auf alle Fasern im Vergleich zum Ausgangswert Antworten berechnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infektion der Maus Prostata mit UPEC ermöglicht für die in vivo-Modellierung von Ereignissen, die an der Pathogenese von bakteriellen Prostatitis, CP / CPPS oder als prädisponierende Ereignis in chronischen Entzündung beteiligt sein können. Die Methoden für die bakterielle Vorbereitung und Instillation draw auf eine große Menge an Literatur beschrieben auf UPEC Modelle weiblichen Harnwegsinfektion 7,14. Das Modell verfügt über eine breite Anwendbarkeit für das Studium Pathogenese, Testung potentieller Impfstoffkandidaten und Mechanismen der Immunmodulation. Die Fähigkeit, Schmerzen Verhalten in einer quantifizierbaren Weise folgen können für die Untersuchung der Infektion induzierte Schmerzen Pathogenese und potentiell als präklinischen Modell zum Testen Schmerztherapeutika.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die den Erfolg der Maus Infektion Modell zu bestimmen. Die dreitägige Kultur-Methode mit Schütteln und statischen Kulturen ist für eine optimale Expression von Pili, die bekanntermaßen für UPEC wichtige durchgeführtBindung an Epithelzellen. Es stellt einen wichtigen Schritt für eine erfolgreiche Orgel Kolonisierung durch UPEC. Die Techniken für das Bakterienwachstum wurden speziell für UPEC Wachstum mit der OD 420 zum Erlangen von 10 ul optimiert ausgelegt phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1 x 10 8 Bakterien 7. Andere Tierarten oder Bakterienstämme potenziell wachsen unterschiedlich schnell und Standardisierung wäre wichtig, daraus die entsprechenden OD, die 1 x 10 8 Bakterien gibt. Verschiedene Stämme von Bakterien, Zellen in der Blase und Prostata, die in einzigartiger Weise weitgehend abhängig von der Virulenzfaktoren durch den Stamm 14 exprimiert sind haften. Erfolgreiche Infektion des murinen Prostatakrebs wäre daher abhängig Nutzung eines UPEC Stamm mit der entsprechenden Ergänzung von Virulenzfaktoren. Unmittelbar nach der Infektion, Aufrechterhalten Tiere in einer leicht anästhesiert Zustand für mindestens 15 min ist wichtig sicherzustellen, dass Insbestellt Bakterien haben Zeit zu befestigen und zu initiieren Pathogenese, bevor die normalen Mechanismen der Wasserlassen deaktivieren Sie das instillierte Volumen aus der Harnröhre.
Taktile Allodynie in Mäusen ist eine Folge des zugrundeliegenden Pathologie viszeralen und als solche wird durch exquisite Wirtsstamm Spezifität aufweist. Wir haben zuvor beschrieben, dass ein pathogener Stamm von UPEC in männlichen NOD / ShiLtJ Mäusen Allodynie induziert, daß Spitzen in 3 Tagen und chronisch wohingegen der gleiche Stamm ist unfähig Induzieren Allodynie in C57BL/67 Mäusen 2 aufrechterhalten. Unsere Studien deuten darauf hin UPEC-induzierte Beschleunigung der autoimmune Prozesse in NOD / ShiLtJ Mäusen als Ursache. So ist die Host-genetischen Hintergrund ist in der Entwicklung der taktile Allodynie wichtig. Weitere wichtige Schritte, die Schlüssel zu einer neutralen und erfolgreiche Messung der Allodynie sind, sicherzustellen, dass das Gerät immer auf die Identität der Behandlung verblendet ist die gleiche Prüfvorrichtung für die Messung aller Zeit-punkte im Experiment, die Nutzung von ähnlichen Tests Male während des Tages, Wohnverhältnisse der Mäuse und die Sicherstellung standardisierten Bedingungen sowohl innerhalb der Zeit-Punkte in einem Experiment als auch zwischen den Experimenten.
Die murine Infektionsmodell hat eine Reihe von Einschränkungen, die sorgfältig während Ergebnisinterpretation berücksichtigt werden müssen. Bakterien instilliert intraurethral haben die Fähigkeit zur Infektion der Blase sowie die Prostata. Dies erschwert die Interpretation aller systemischen oder allgemeinen Parameter wie die zugrunde liegende Pathologie konnte aus mehreren Organen sein. Allerdings ermöglicht Ausnutzung klinischen und Prostata abgeleitet Bakterienstämme sowie die gleichzeitige Untersuchung der Blase und der Prostata geeignete Interpretationen. Darüber hinaus simuliert die Methode der Infektion die Wahrscheinlichkeit aufsteigenden Infektion Modalität bei Männern.
Die Infektion hier beschriebenen Modell unterscheidet sich von den zuvor berichteten priprimär in den Stamm von UPEC Verwendete, dem Host-Mausstamm und Unterschiede in Kultur Techniken 6 und Volumen von Bakterien in die Harnröhre 15 zugetropft. Die vorliegende Studie verwendet eine gut charakterisierte Prostata-derived chronische Prostatitis UPEC Stamm Krankheit 2 vermitteln. Frühere Studien haben Bakterien Infektionen der Blase oder akute Prostatitis, die vor allem für die Prüfung Entzündung Veranstaltungen genutzt wurde, aber nicht in Bezug auf die taktile Allodynie 6,15 gekennzeichnet ableiten. Zahlreiche andere Tiermodelle berichtet worden, dass zu nutzen autoimmune Mechanismen 5,16, hormonelle Manipulation 17 und Neugeborenen thymectomies 18 bis Prostatitis induzieren. Während jedes dieser Modelle einige positive Eigenschaften, einschließlich Organ-spezifische Pathologie und Nutzung der bereits vorhandenen Techniken haben die Relevanz dieser Methoden, um die tatsächliche Pathogenese der CP / CPPS ist unbekannt. Im Gegensatz beschriebene Methodik in diesem Mannuscript bezieht sich auf einen Mechanismus, der potenzielle postuliert wurde ein Initiator der Pathogenese der Erkrankung in der Prostata ist. Darüber hinaus, jenseits ihrer Nützlichkeit für das Verständnis CP / CPPS Pathogenese, konnten die Techniken, die in Aufbau und Prüfung chronische Entzündung der Prostata eingesetzt werden und seine Rolle bei BPH (benigne Prostatahyperplasie) und Prostatakrebs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse 1K01DK079019A2 (PT) von der NIH / NIDDK unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
References
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
- Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
- Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
- Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
- Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).
- Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).
- Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
- Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
- Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
- Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).
