Summary
전립선의 감염은 만성 prostatitis의 골반 통증을 중재에 기여 요소가 될 수 있습니다. 우리는 표준화 된 박테리아 inoculum, 시간이 지남에 따라 마우스에 촉각 allodynia을 측정하는 남성 마우스 및 방법론의 요도에 박테리아의 기지의 준비에 대한 절차를 설명합니다.
Abstract
Uropathogenic 대장균 (UPEC)는 요로 감염 및 세균 prostatitis 1 중요한 역할을 병원균입니다. 우리는 최근에 UPEC는 만성 골반 통증 2, 만성 prostatitis / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS) 3,4의 기능의 개시에 중요한 역할을하는 것으로 나타났습니다. 임상 관련 UPEC하여 전립선의 감염은 조직 손상과 autoimmunity 5 메커니즘의 개시를 포함 할 수 있습니다 메커니즘을 통해 만성 통증을 시작하고 설정할 수 있습니다.
전립선에 UPEC의 pathogenesis를 이해하는 데 도전 조작에 전립선의 상대적 어려움입니다. 우리는이를 통해 전립선의 오름차순 감염을 수립 남성 생쥐에 UPEC의 임상 부담이 제공하는 이전에 설명 intraurethral 감염 방법 6을 활용. 여기, 우리는 학사 학위를 표준화에 대한 우리의 프로토콜을 설명뿐만 아니라 박테리아의 기지에 anesthetized 남성 쥐를 catheterizing 절차 등 cterial inoculum 7.
CP / CPPS는 주로 촉각 allodynia (4)의 존재에 의해 특징입니다. 동작 테스트는 언급 내장 통증 8-10으로 인한 피부 hyperalgesia의 개념을 기반으로했다. 내장 조직에 짜증 초점은 일반적으로 비 고통스러운 자극 (allodynia)에 대한 과장된 반응을 허용하는 피부 통증 임계 값을 감소시킵니다. 기본 내장 고통의 강도를 증가하는 경향이 이상 반응의 피부 결과 정상적인 힘의 응용 프로그램입니다. 우리는 UPEC 박테리아와 하나의 감염에 대한 응답으로 시간이 지남에 촉각 allodynia를 정할 폰 프라이 섬유를 활용 NOD / ShiLtJ 마우스에 방법을 설명합니다.
Protocol
1. 마우스 접종에 대한 박테리아 준비
다음은 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
- 모자와 하나 17 × 100 밀리미터 폴리 프로필렌 튜브를 타고 신선한 Luria 국물 (LB) 미디어 3 ML를 추가합니다. autoclaved 팁을 사용하면, 스트레인 CP1 2의 일부 냉동 박테리아 글리세롤 주식을 가지고 LB 미디어를 포함하는 관에 문화의 작은 수량을 전송할 수 있습니다. 산소는 여전히 튜브를 입력 할 수 있도록 튜브 캡을 교체 - 문화 에어로빅 조건 하에서 성장해야합니다. 37 번 장소 튜브 ° 하루 아침에 220 rpm으로 흔들어 보육의 C.
- 그 다음날, 3 ML의 LB 미디어와 함께 새로운 튜브에 밤 문화의 5 μl를 전송하고 37 ° C.에서 보육 밤의 정적 조건 하에서 성장
- 날 AA 50 ML 튜브에 3 전송 문화의 40 μl는 40 ML의 LB 미디어 각을 포함. 37 ° C 정적 보육의 하룻밤의 장소.
- 켜, 4 ° C.에 원심 분리기를 설정일단 원심 분리기 최종 온도에 도달, 40 ML Nalgene의 원심 분리기 튜브에 각각 40 ML 문화를 전송할 수 있습니다.
- 필요에 따라 LB 미디어와 함께 볼륨을 조절 - 원심 분리기의 균형을 튜브를 무게. 20 분에 6,000 rpm으로 튜브를 봐.
- 조심스럽게 표면에 뜨는 제거하고 부드럽게 40 ML 멸균 PBS에서 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다.
- PBS와 단계 1.5를 반복합니다.
- 표면에 뜨는을 대기음, 500 μl 멸균 PBS에서 박테리아를 일시 중지합니다. 1.5 ML의 microfuge 관에 솔루션을 전송합니다. 정지 10 μl를 타고 얼음처럼 차가운 PBS의 990 μl에 희석. 접종에 필요한 볼륨을 확인하려면 OD 420의 NM을 읽어 분광 광도계를 사용합니다. 의 적절한 볼륨을 확인하려면 얼음처럼 차가운 PBS가 펠릿을 중지 할 수 : OD 420의 나노 번호 (ML)를 타고 박테리아 펠렛 [예의 예상 볼륨을 뺍니다. OD 420 nm 정도 = 0.545, 펠렛 약 0.075 ML. 0.545-0.075 = 0.470].
- 10 박테리아 정지 μl와 디를 제거990 μl 얼음처럼 차가운 PBS의 류트. OD 420의 나노를 참조하십시오. 목표는 1.000의 희석 정지 ± 0.010을위한 OD 420의 nm의 값을 달성하는 것입니다. 귀하의 희석의 수가이 목표를 초과하면, 정지에 더 많은 볼륨을 추가하고 또 다른 읽기를. 수 아래 인 경우 0.990는 원하는 반응을 얻을 때까지 중지 및 반복 OD 420의 나노 읽기 스핀 다운.
2. 동물 감염
마우스 (5-7주 세, 그룹 당 10)가 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입했다.
- 마우스는 Plexiglas 챔버에서 isoflurane 1~4%의 흡입에 의한 anesthetized하고 휴식하고있는 때까지 모니터링한다.
- 한 번에 하나의 마우스는 유리 해밀턴 주사기 (1.5-2.0 cm의 길이)의 수정 된 30 G 바늘에 부착 된 폴리에틸렌 (PE10) 카테터와 catheterization에 의해 박테리아의 기지에 이루어집니다. 카테터는 바늘의 허브에 삽입됩니다. 마우스 plac입니다에드는 마취상의 등쪽 표면에 코 콘을 사용하여 유지.
- 마우스의 음경은 음경 요도의 입구의 윤활에 사용되는 부드러운 압력과 면봉에 윤활제의 자유 양에 의해 압출입니다.
- 10 μl 인산염은 버퍼 1 개 10 8 박테리아를 포함하는 염분은 catheterization 다음 anesthetized 마우스의 요도에 소개되어 있습니다.
- 세균 첨부 파일을 허용하고 즉각적인 배뇨을 방지하기 위해 세균 소개 한 후 마우스가 Plexiglas 챔버에서 15 분 동안 anesthetized 상태로 유지됩니다.
- 마우스들은 케이지에 다시 배치하고 24 시간 모니터링하고 있습니다.
3. 동작 테스트
마우스는 사전 감염 (기준)과 일 3, 7, 14, 21, 감염 후 28 테스트되었습니다. 라고 hyperalgesia와 촉각 allodynia은 복부 11,12과 발바닥 R에 적용 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 테스트되었습니다뒷다리 앞발로 땅을 차다 13 egion. 테스트는 시간의 하루 고정에 perfomed 된 표준 방법론과 모든 동물의 한 실험 테스트는 고용했다. 그룹의 눈이 멀어 테스트는 동물 모델에서 동작 기반의 통증 테스트의 한계를 방지하기 위해 활용되었다. 0.04의 힘, 0.16, 0.4, 1.0 및 4.0 g (Stoelting, USA)와 다섯 개인 폰 프라이의 필라멘트가 탈퇴 응답의 복부 및 주파수에 적용되었다가 계산되었습니다.
- 새 환경 순응의 30 분 기간 후, 마우스는 스테인레스 스틸 와이어 그리드 바닥 - 집에서 만든 개인 Plexiglas 챔버 (6 × 10 x12 cm)에 배치됩니다.
- 라고 hyperalgesia와 촉각 allodynia은 다섯 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 테스트되었습니다. 각 필라멘트는 총 10 회에 5 초의 상호 자극 간격으로 1-2 초에 대해 적용하고, 머리카락이 힘의 오름차순으로 테스트되었습니다.
- 각 필라멘트는 전립선의 일반적인 주변에 낮은 복부 지역에 적용되고주의 desensitization을 피하거나 효과 "를 맺어야"이 지역 내의 다른 지역을 자극하는 촬영되었습니다. 필라멘트는 10 배의 총 stimulations 사이에 최소 5 초 간격으로 1-2 초에 대해 힘의 순서를 증가에 적용되었습니다.
- 행동의 세 가지 유형은 필라멘트 자극에 긍정적 인 반응으로 간주됩니다 : 복부 1) 날카로운 철회, 2) 즉시 핥아 또는 필라멘트 자극의 지역을 긁적, 3) 점프.
- 응답 주파수는 긍정적 인 반응의 비율 (10 중에 10 = 50 % 예를 들어 5 응답)로 계산 및 데이터가 응답 주파수의 평균 비율 ± SE로보고되었다
- 25 개 이상의 긍정적 총 기본 응답과 동물은 연구에서 제외됩니다.
- 촉각 allodynia는 0.04의 힘, 0.16, 0.4, 1.0 및 4.0 g과 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 뒷다리 손 안에 발바닥 지역에서 테스트되었습니다. 중간 50 % 탈퇴 임계 값 (5)이 위, 아래를 사용하여 평가 한필라멘트가 약간 구부러 때까지 테스트가 0.04 g 필라멘트로 시작 방법은 뒷다리 손 안에 발바닥 표면에 수직 적용. 필라멘트는 긍정적 인 반응이 관찰 될 때까지 오름차순으로 테스트되었습니다. 필라멘트에 대한 긍정적 인 반응은 테스트 손 안에 앞발로 땅을 차다이나 핥아의 날카로운 철회 중 하나로 정의되었다. 긍정적 인 반응이 기록되었을 때 다음 약한 필라멘트가 적용되고, 부정적인 응답이 관찰 된 경우, 다음 강한 필라멘트가 적용되었습니다.
- 설명 실험과 방법론은 검토 및 승인 노스 웨스턴 대학 동물 의료 의해위원회를 사용하고 있습니다.
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Representative Results
우리는 세균 감염시 만성 통증의 존재에 대한 NOD / ShiLtj와 C57BL/6J 수컷 쥐를 조사했다. 남성 마우스 (5~7주 이전)은 요도 (그림 1)에 생리 나 세균과 배우는되었습니다. 생리 - 배우는 C57BL/6J 마우스와 UPEC에 감염된 C57BL/6J 마우스의 폰 프라이의 필라멘트와 골반 지역의 기계적 자극이 실험의 28 일 코스 (그림 1) 동안 변경되지 않은 응답 주파수하게되었습니다. 반면, UPEC에 감염된 NOD 마우스는 상당히 큰있었습니다 골반 자극에 반응을 전시 일 28 일 (P <0.05, 그림 3)까지 크게 상승 있었다. 세균 감염 뒷다리 앞발로 땅을 차다 (데이터 미도시)의 발바닥 지역의 촉각 감도의 변경 사항 없음있었습니다.
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1 그림. 실험 흐름 차트입니다. 1 개 10 8 박테리아 3 일 문화 준비는 PBS에 부유하고 catheterization하여 anesthetized 마우스의 요도에 심어되었습니다. 결과 촉각 allodynia는 0.04의 힘, 0.16, 0.4, 1, 4g로 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 정량되었다.
그림 2. 폰 프라이 섬유. 마우스를 사용하여 촉각 allodynia 테스트를위한 방법론은 세균 감염 전에 후 감염 일 (PIDS) 7, 14, 21, 28에서 테스트되었습니다. 행동의 세 가지 종류의 필라멘트 자극에 긍정적 인 반응으로 간주되었다 : 복부 1) 날카로운 철회, 2) 즉시 핥아 또는 필라멘트 자극의 지역을 긁적;) 또는 3 점프. 응답 자주 긍정적 인 응답 비율 (10 개)와 D로 계산ATA는 응답 주파수의 평균 비율 ± SE로보고되었다.
그림 3. UPEC 박테리아에 의해 유도. 촉각 allodynia가 내장 hyperalgesia는 5 보정 세력의 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 골반 부위의 기계적 자극에 대한 응답으로 측정되었다 추천인. 데이터는 긍정적 인 응답의 평균 비율 ± SE 박테리아의 기지 (기본) 이전 및 PID 7, 14, 21, 28에서로보고됩니다. ANOVA는 UPEC에 감염된 NOD 마우스 (P <0.05)에서 테스트 모든 필라멘트의 기준에서에 비해 28 PIDS 7시 응답 주파수에 상당한 증가를 지적했다. 각 PID의 %의 응답은 기본 응답을 기준으로 모든 섬유에 대한 총 응답으로 계산되었습니다.
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Discussion
UPEC와 마우스 전립선의 감염은 세균 prostatitis, CP / CPPS의 pathogenesis 또는 만성 염증에 predisposing 이벤트로 참여 할 수 있습니다 이벤트의 생체 모델링에서 할 수 있습니다. 방법은 여성 비뇨기의 요로 감염이 7,14에 UPEC 모델에 문학의 큰 몸에 세균 준비 및 떨어 뜨림 조 추첨에 대해 설명했다. 모델은 잠재적 인 백신 후보와 면역 변조의 메커니즘을 테스트 pathogenesis을 공부에 대한 폭 넓은 적용이 있습니다. 객관적 방식으로 통증이 동작을 수행 할 수있는 능력은 감염 유발 통증 pathogenesis 연구와 잠재적으로 고통 치료학을 제작하고 테스트하기위한 잠복기 모델로 할 수 있습니다.
마우스 감염 모델의 성공을 결정하는 중요한 단계가 있습니다. 진동 및 정적 문화와 3 일 문화 방법은 UPEC에 중요하다고 알려져있다 pili 최적의 표현을 위해 수행됩니다상피 세포에 부착. 이 UPEC의 성공적인 장기 식민지을위한 중요한 단계를 나타냅니다. 박테리아 성장을위한 기술은 1 개 10 8 박테리아 7이 포함 된 염분 버퍼 인산 - 10 μl를 얻기에 최적화 된 OD 420 단계로 UPEC 성장을 위해 특별히 설계되었습니다. 다른 종이나 박테리아의 변종 가능성이 다른 속도로 성장하고 표준화은 1 개 10 8 박테리아를 제공하는 적절한 OD를 유도하는 것이 중요합니다. 박테리아의 다른 변종은 변종 (14)에 의해 표현 독성 요인에 크게 의존하고 독특한 방법으로 방광과 전립선의 세포을 준수합니다. 손쥐 전립선을 성공적으로 감염 따라서 독성 요소의 적절한 보완과 UPEC 변형의 활용에 따라 것입니다. 즉시 15 분의 최소 가볍게 anesthetized 상태에서 동물을 유지, 감염을 따라하면 해당 기능을 확인하는 것이 중요합니다스며 박테리아는 배뇨의 일반적인 메커니즘은 요도에서 배우는 볼륨을 삭제하기 전에 pathogenesis를 첨부하여 시작 시간이 있습니다.
쥐 촉각 allodynia가 기본 내장 병리의 결과이며, 등이 절묘한 호스트 변형 특성에 의해 특징입니다. 우리는 이전에 남성 NOD / ShiLtJ 마우스에 UPEC의 병원성 변종은 같은 스트레인 C57BL/67 마우스 2 allodynia를 일으킬 수없는 반면 3 일 봉우리와이 만성 지속되는 allodynia을 유도하는 설명했습니다. 우리의 연구는 기본 원인으로 NOD / ShiLtJ 쥐 면역 프로세스의 UPEC 유발 가속하는 것이 좋습니다. 따라서 호스트 유전 배경은 촉각 allodynia의 발전에 중요합니다. allodynia의 편견과 성공을 측정 핵심 다른 중요한 단계는 테스터가 항상 치료의 신원에 눈을 못 뜹니다 보장되며, 동일한 테스터는 모든 시간 P의 측정을위한 책임이있다실험 일 동안 유사한 테스트 시간 활용, 마우스 주택 조건과 실험에서뿐만 아니라 실험 사이의 시간 점에서 모두 표준화 된 조건을 보장에 oints.
손쥐 감염 모델은 신중하게 결과 해석시 고려해야 할 필요가 제한 수 있습니다. 박테리아는 intraurethrally 방광뿐만 아니라 전립선을 감염시킬 수있는 능력을 배우는. 이 기본 병리와 같은 체계 또는 일반 매개 변수의 해석이 여러 기관에서있을 수 복잡해. 그러나, 임상 및 전립선 파생 된 박테리아 변종의 활용뿐만 아니라 방광과 전립선의 동시 검사가 적절한 해석 할 수 있습니다. 또한, 감염의 방법론은 인간 남성의 가능성이 오름 감염 양상을 시뮬레이트합니다.
여기에 설명 된 감염 모델은 그 이전에보고 된 PRI 다릅니다릴리 UPEC 이용, 호스트 마우스 스트레인과 문화 기술의 차이 6 요도 15에 배우는 박테리아의 볼륨의 변형 인치 현재 연구는 질병 2 중재하기 위해 잘 특징 전립선 파생 만성 prostatitis의 UPEC 변형을 사용합니다. 이전 연구는 주로 검사 염증 관련 이벤트를 활용하지만, 촉각 allodynia 6,15의 관점에서 특징되지 않은 방광 감염이나 급성 prostatitis에서 파생 박테리아를 사용했습니다. 수많은 다른 동물 모델은 prostatitis를 유도하는 면역 메커니즘 5,16, 호르몬 조작 17 신생아 thymectomies 18 활용이보고되었습니다. 이 모델의 각 장기 별 질환 병리 및 기존 기술의 활용 등 일부 긍정적 인 속성을 가지고 있지만 CP / CPPS의 실제 pathogenesis에 이러한 방법의 관련성을 알 수 없습니다. 반면, 방법론은이 사람에 설명uscript은 전립선의 질병 pathogenesis의 창시자로 postulated 된 잠재적 인 메커니즘을 말합니다. 또한, CP / CPPS pathogenesis를 이해하는 데 그 유틸리티 넘어, 기술이 잘 전립선의 만성 염증을 설립하고 조사에 활용 될 수 있고 BPH (양성 전립선 비대증)과 전립선 암에 그것을의 역할.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH / NIDDK에서 부여 1K01DK079019A2 (PT)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
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