Mätning av taktil allodyni i en murin modell av bakteriell prostatit

Summary

Infektion av prostata kan vara en bidragande faktor vid mediering bäckensmärta vid kronisk prostatit. Vi beskriver förfarandet för beredning av standardiserade bakteriella inokulat, instillation av bakterier i urinröret manliga möss och metoder för att mäta taktil allodyni hos möss över tid.

Abstract

Uropatogena Escherichia coli (UPEC) är patogener som spelar en viktig roll i urinvägsinfektioner och bakteriell prostatit ^1. Vi har nyligen visat att UPEC har en viktig roll vid initieringen av kronisk bäckensmärta ^2, en funktion av kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP) ^3,4. Infektion i prostatan genom kliniskt relevanta UPEC kan initiera och etablera kronisk smärta genom mekanismer som kan innebära vävnadsskada och inledandet av mekanismer autoimmunitet ^5.

En utmaning att förstå patogenesen av UPEC i prostatan är den relativa otillgänglighet av prostatakörteln för manipulation. Vi utnyttjade en tidigare beskriven intrauretral infektion metod ⁶ för att leverera en klinisk stam av UPEC till hanmöss därigenom fastställa en uppåtgående infektion i prostatan. Här beskriver vi våra protokoll för standardisering av bacterial inokulum ⁷ samt förfarandet för catheterizing sövda hanmöss för instillation av bakterier.

CP / CPP kännetecknas primärt av närvaron av taktil allodyni ^4. Beteende tester baserades på begreppet kutan hyperalgesi följd avses visceral smärta ^8-10. En irriterad fokus i viscerala vävnader minskar kutan smärttröskeln möjliggör en överdriven reaktion på normalt icke smärtsamma stimuli (allodyni). Tillämpning av normal kraft på huden resulterar i onormala reaktioner som tenderar att öka med intensiteten av den underliggande visceral smärta. Vi beskriver metodiken i NOD / ShiLtJ möss som utnyttjar von Frey fibrer att kvantifiera taktil allodyni över tiden som svar på en enda infektion med UPEC bakterier.

Protocol

1. Bakterier Förberedelse för mus Inokulering

Följande måste göras under aseptiska förhållanden.

1. Ta en 17 x 100 mm provrör polypropen med lock och tillsätt 3 ml färsk Luria Broth (LB) medium. Med hjälp av autoklaverade tips, ta lite frysta bakterier glycerol lager av stam CP1 ² och överföra en liten mängd av kulturen i röret som innehåller LB-media. Byt röret locket så att syre fortfarande kan komma in i röret - kulturen behöver för att växa under aeroba förhållanden. Placera röret vid 37 ° C i en skakinkubator vid 220 varv per minut över natten.
2. Nästa dag, överför 5 il nattgammal kultur till ett färskt rör med 3 ml medium LB och växa under statiska betingelser i en inkubator över natten vid 37 ° C.
3. På dag 3 överföring 40 pl kultur i aa 50 ml rör innehållande 40 medium ml LB vardera. Placera i en 37 ° C statisk inkubator över natten.
4. Slå på och ställ centrifug till 4 ° C.När centrifugen har nått sluttemperatur, överföra varje 40 ml kultur i en 40 ml Nalgene centrifugrör.
5. Väg rör att balansera centrifugen - justera volymen med LB-media som behövs. Snurra rören vid 6.000 rpm under 20 minuter.
6. Ta försiktigt bort supernatanten och försiktigt dra bakteriell pellet i 40 ml sterilt PBS.
7. Upprepa steg 1,5 med PBS.
8. Sug bort supernatanten och suspendera bakterier i 500 ul sterilt PBS. Överför lösningen till en 1,5 ml mikrofugrör. Ta 10 ni suspension och späd i 990 ul iskall PBS. Använd en spektrofotometer för att läsa OD _{420 nm} för att bestämma den volym som krävs för ympning. För att bestämma lämplig volym av iskall PBS att avbryta pellet i: Ta OD _{420 nm} nummer (i ml) och subtrahera den beräknade volymen av den bakteriella pelleten [ex. OD _{420 nm} = 0,545, pelleten ca 0,075 ml. 0,545 till 0,075 = 0,470].
9. Ta 10 il bakteriesuspension och diluta i 990 ul iskall PBS. Läs OD _{420 nm.} Målet är att uppnå en OD _{420 nm} värdet för den utspädda suspensionen av 1,000 ± 0,010. Om numret till din utspädning ligger över detta mål, tillsätt mer volym till suspensionen och ta en läsning. Om numret är under 0,990 snurra sedan ner suspensionen och upprepa OD _{420 nm} läsning tills erhålla önskad avläsning.

2. Animal Infektion

Möss (5 till 7 veckor gamla, tio per grupp) köptes från Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

1. Möss sövs genom inandning av 1-4% isofluran i en plexiglas kammare och övervakas tills liggande.
2. En mus åt gången tas för instillation av bakterier genom kateterisering med en polyeten (PE10) kateter fäst vid en modifierad 30 G nål av ett glas Hamilton-spruta (längd 1,5-2,0 cm). Katetern införs till navet av nålen. Musen är placed på sin rygg yta under anestesi upprätthålls med hjälp av en noskon.
3. Penisen med musen extruderas genom lätt tryck och rikligt med glidmedel på tops används för smörjning av ingången till penis urinröret.
4. 10 il fosfatbuffrad saltlösning innehållande 1 x 10 ⁸ bakterier införs i urinröret hos bedövade möss efter kateterisering.
5. Möss hålls i en sövd tillstånd under 15 minuter i plexiglas kammaren efter bakteriell introduktion att möjliggöra bakteriell vidhäftning och för att förhindra omedelbar urinering.
6. Möss placerades tillbaka i sina burar och övervakas för nästa 24 timmar.

3. Beteende Test

Möss testades före infektion (baslinje) och på dagarna 3, 7, 14, 21 och 28 efter infektion. Avses hyperalgesi och taktil allodyni testades genom att använda von Frey-filament som appliceras på buken ^11,12 och plantar region av baktassen ^13. Testningen uppträtt vid en bestämd tidpunkt på dagen, var standard metodik och enkel försöksledaren testning av alla djur används. Blinded testning av grupper användes för att bekämpa de begränsningar av beteende-baserade smärta tester i djurmodeller. Fem individuella von Frey filament med krafter 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 och 4,0 g (Stoelting, USA) appliceras på buken och frekvensen av tillbakadragande svar beräknades.

1. Efter en 30 minuters period av acklimatisering, möss placerade i enskilda plexiglas kammare (6 x 10 x12 cm) som görs internt med rostfri tråd gallergolv.
2. Avses hyperalgesi och taktil allodyni testades med användning av fem von Frey filament. Varje filament söktes 1-2 sek med en inter-stimulus intervall av 5 sekunder för en total 10 gånger, och håren testades i stigande ordning av kraft.
3. Varje filament anbringas på den nedre delen av buken i den allmänna närheten av prostata ochvård togs för att stimulera olika områden inom denna region för att undvika desensibilisering eller "avveckla" effekter. Filament tillämpades i stigande ordning kraft för 1-2 sekunder med minst 5 sek intervall mellan stimuleringar för totalt 10 gånger.
4. Tre typer av beteenden anses vara en positiv respons på tråd stimulering: 1) skarp indragning av buken, 2) omedelbart slicka eller klia på området med glödtråden stimulering, 3) hoppning.
5. Svarsfrekvens beräknades som andelen positiva svar (av 10, t ex 5 svar 10 = 50%) och data rapporterades som den genomsnittliga andelen svarsfrekvens ± SE
6. Djur med mer än 25 positiva totala baslinjesvaren utesluts från studien.
7. Taktil allodyni testades på plantar regionen av baktassen med von Frey filament med krafter 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 och 4,0 g.. Medianen 50% återtagströskel (5) bedömdes med hjälp av upp-nedmetod där testningen startade med 0,04 g filamentet appliceras vinkelrätt mot den plantara ytan av baktassen tills tråden lätt böjda. Filament testades i stigande ordning tills ett positivt svar observerades. Ett positivt svar på tråden definierades som antingen en skarp tillbakadragande av tassen eller slickande av tassen testet. När ett positivt svar noterades nästa svagare glödtråden tillämpades och om ett negativt svar observerades sedan nästa starkare glödtråden tillämpades.
8. Experimenten och metoder som beskrivs har granskats och godkänts av Northwestern University djuromsorg och använda kommitté.

Representative Results

Vi undersökte NOD / ShiLtj och C57BL/6J hanmöss för förekomst av kronisk smärta vid bakteriell infektion. Hanmöss (5 till 7 veckor gamla) instillerades med saltlösning eller bakterier i urinröret (figur 1). Mekanisk stimulering av bäckenområdet med von Frey filament av saltlösning ingivna C57BL/6J-möss och UPEC-infekterade C57BL/6J-möss resulterade i en svarsfrekvens som inte förändras under 28-dagars kurs av experimentet (figur 1). Däremot uppvisade UPEC-infekterade NOD-möss svar på bäcken stimulering som var signifikant större och förblev signifikant förhöjd till dag 28 (p <0,05, figur 3). Bakteriell infektion resulterade i inga förändringar i taktil känslighet av plantar regionen av baktassen (data ej visade).

tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Figur 1. Experimentell flödesschema. 1 x 10 ⁸ bakterierna som utarbetats av en tre dagars odling suspenderades i PBS och ingjutit in i urinröret hos bedövade möss genom kateterisering. Resulterande taktil allodyni kvantifierades med von Frey filament med krafter 0,04, 0,16, 0,4, 1 och 4 g.

Figur 2. Metodik för att testa taktil allodyni med von Frey fibrer. Möss testades före bakteriell infektion och vid efter infektion dagar (PID) 7, 14, 21, och 28. Tre olika typer av beteenden ansågs som positiva reaktioner på tråd stimulering: 1) skarp indragning av buken, 2) omedelbart slicka eller klia på området med glödtråden stimulering, eller 3) hoppning. Respons ofta beräknades som procentandel av positiva svar (av 10) och data rapporterades som medelvärde procent av svarsfrekvens ± SE.

Figur 3. Taktil allodyni inducerad av UPEC bakterier. Värvade visceral hyperalgesi mättes som svar på mekanisk stimulering av bäckenregionen med von Frey filament av fem kalibrerade krafter. Data rapporteras som den genomsnittliga andelen positiva svar ± SE innan instillation av bakterier (baslinje) och PID 7, 14, 21 och 28. ANOVA visade en signifikant ökning i svarsfrekvens på PID 7 till 28 jämfört med vid baslinjen för alla filament testades i UPEC-infekterade NOD-möss (P <0,05). Den procentuella responsen vid varje PID beräknades som total svar på alla fibrer i förhållande till baslinjen svar.

Discussion

Infektion av mus prostata med UPEC möjliggör in vivo-modellering av händelser som kan vara inblandade i patogenesen av bakteriell prostatit, CP / CPP eller som en predisponerande händelse i kronisk inflammation. De metoder som beskrivs för bakteriell förberedelse och instillation dra på en stor mängd litteratur om UPEC modeller i kvinnliga urinvägsinfektion ^7,14. Modellen har bred tillämpbarhet för att studera patogenes, testa potentiella vaccinkandidater och mekanismer för immunmodulering. Förmågan att följa smärtbeteendet i ett kvantifierbart sätt möjliggör studier av infektion-inducerad smärta patogenes och potentiellt som en preklinisk modell för att testa smärta terapeutika.

Det finns flera kritiska steg som bestämmer framgång musens infektionsmodell. Den tre dagar odlingsmetod med skakning och statiska kulturer sker för optimal expression av pili som är kända för att vara viktiga för UPECfastsättning till epitelceller. Det är ett kritiskt steg för framgångsrik orgel kolonisering av UPEC. Teknikerna för bakterietillväxt har utformats speciellt för UPEC tillväxt med OD ₄₂₀ steg optimerad för att erhålla 10 ^ fosfatbuffrad saltlösning innehållande 1 x 10 ⁸ bakterierna ^7. Andra arter eller stammar av bakterier växer potentiellt i olika takt och standardisering är viktigt att härleda lämpliga OD som ger 1 x 10 ⁸ bakterierna. Olika stammar av bakterier vidhäftar till celler i urinblåsan och prostatan på ett unikt sätt som är i hög grad beroende av virulensfaktorer som uttrycks av stammen ^14. Framgångsrik infektion i murina prostata skulle därför vara beroende av utnyttjande av en UPEC stam med lämplig komplement virulensfaktorer. Omedelbart efter infektion, upprätthålla djur i en lätt sövd tillstånd för minst 15 min är viktigt att säkerställa att insbrukade bakterier har tid att fästa och initiera patogenes före den normala mekanismerna urinering rensa ingjutit volymen från urinröret.

Taktil allodyni hos möss är en följd av den underliggande patologin viscerala och som sådan kännetecknas av utsökt värdstam specificitet. Vi har tidigare beskrivit att en patogen stam av UPEC i manlig NOD / ShiLtJ möss inducerar allodyni att toppar i 3 dagar och upprätthålls kroniskt medan samma stam är oförmögen att inducera allodyni i C57BL/67 möss ^2. Våra undersökningar tyder UPEC-inducerad accelerationen av autoimmuna processer i NOD / ShiLtJ möss som den underliggande orsaken. Sålunda värd genetiska bakgrunden är viktig för utvecklingen av taktil allodyni. Andra viktiga steg som är nyckeln till en opartisk och framgångsrik mätning av allodyni är att se till att testaren alltid blinda för identitet behandlingen är samma testaren ansvarig för mätning av tiderna-points i experimentet, utnyttjande av liknande tester gånger under dagen, bostadsförhållanden för mössen och säkerställa standardiserade villkor både inom tidpunkter i ett experiment samt mellan experiment.

Den murina infektion modellen har ett antal begränsningar som måste övervägas noga under resultat tolkning. Bakterier ingjutit intrauretralt har förmågan att infektera urinblåsan samt prostata. Detta komplicerar tolkningen av eventuella systemiska eller allmänna parametrar som underliggande patologin kan vara från flera organ. Emellertid tillåter användning av kliniska och prostata härledda bakteriestammar samt samtidig undersökning av urinblåsan och prostatan för lämpliga tolkningar. Dessutom simulerar metoden för infektion den sannolika stigande infektion modalitet hos män.

Infektionen som beskrivs här skiljer sig från de tidigare rapporterade prihand i stammen av UPEC utnyttjas värd musstammen och skillnader i kultur tekniker ⁶ och volym av bakterier ingjutit i urinröret ^15. Den aktuella studien använder en väl karakteriserad prostata-härledda kronisk stam prostatit UPEC att förmedla sjukdom ^2. Tidigare studier har använt bakterier som härrör från urinblåsan infektioner eller akut prostatit som användes främst för undersöka tillhörande inflammation händelser men som inte kännetecknas i termer av taktil allodyni ^6,15. Många andra djurmodeller har rapporterats som utnyttjar autoimmuna mekanismer ^5,16, hormonell manipulation ¹⁷ och neonatala thymectomies ¹⁸ att inducera prostatit. Även om alla dessa modeller har vissa positiva egenskaper, bland annat organspecifik sjukdom patologi och utnyttjande av befintliga tekniker relevans av dessa metoder till den faktiska patogenesen av CP / CPP är okänd. Däremot beskrivs metoden i den här mannenuscript avser en potentiell mekanism som har postulerats vara en initiator av sjukdomen patogenes i prostatan. Dessutom, utöver dess användbarhet att förstå CP / CPP patogenes, kunde tekniker väl användas vid upprättande och undersöka kronisk inflammation i prostata och dess roll i BPH (benign prostatahyperplasi) och prostatacancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture tubes	BD Falcon	352059
LB Broth Miller	EMD	EM1.10285.0500
Nalgene Centrifuge Tubes	Thermo	3118-0050
Isoflurane	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Catheter needle 30G	Hamilton	91030
PE10 tubing	BD intramedic	427400
Von Frey Filaments	Stoelting	58025-31